CN103665130A - α-芋螺毒素肽TxIC/Txd1、其药物组合物及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学和分子生物学领域,涉及α-芋螺毒素肽TxIC/Txd1、其药物组合物及用途。本发明的α-芋螺毒素肽能够特异地阻断乙酰胆碱受体(nAChRs,例如α3β4 nAChR),并且具有治疗成瘾、神经痛,帕金森症、痴呆、精神***症、抑郁、癌症、恐惧等的活性,具有在制备戒烟戒毒与镇痛药物、有关精神疾病与癌症治疗药物、以及神经科学工具药等方面的良好应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化学和分子生物学领域,涉及α-芋螺毒素肽TxIC/Txd1、其药物组合物及用途。
背景技术
芋螺(Conus)是腹足纲前腮亚纲芋螺科芋螺属的一类热带海洋肉食性软体动物,其通过毒液管分泌多肽类的毒液来进行捕食和防御。芋螺毒素通常含有10-46个氨基酸,富含二硫键,生物活性强,能特异地作用于动物细胞膜上的受体和离子通道。尤其是对电压门控或配体门控离子通道(包括少数G-蛋白相关受体等)具有较高的选择性。芋螺毒素按其前体蛋白的内质网信号肽序列的相似性,以及半胱氨酸模式,分为不同的基因家族,至今,所有已知的芋螺毒素可分为18个超家族,分别为A、C、D、S、M、I1、I2、I3、J、L、O1、O2、O3、P、T、V、Y、K(Kaas Q,Yu R,Jin AH,Dutertre S and Craik DJ.ConoServer:updated content,knowledge,and discovery tools in the conopeptidedatabase.Nucleic Acids Research(2012)[Ahead of print];Ye M,KhooKK,Xu S,Zhou M,Boonyalai N,Perugini MA,Shao X,Chi C,GaleaCA,Wang C & Norton RS(2012)A helical conotoxin from Conusimperialis has a novel cysteine framework and defines a newsuperfamily.Journal of Biological Chemistry 287,14973-14983)。芋螺毒素按其受体靶位可分为α、ω、μ、δ等多种药理学家族。每个超家族根据受体靶类型,又可分为α、αA、κA(A-超家族),ω、δ、κ、μO(O-超家族),μ、ψ、KM(M-超家族)等家族(亚型)。
其中,α-芋螺毒素是目前发现的、选择性最好的烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)亚型特异阻断剂。α-芋螺毒素及其作用靶点nAChRs在多种疾病机理的研究,以及药物研发方面具有极其重要的价值。α-芋螺毒素是人们最早发现的一类芋螺毒素,通常分子量较小,一般由12-19个氨基酸残基组成,富含二硫键。α-芋螺毒素种类繁多,活性多样,结构变化复杂。通过其高度保守的信号肽序列、药理学活性及半胱氨酸模式可对α-芋螺毒素进行分类。α-芋螺毒素的半胱氨酸模式为CC-C-C,其中天然肽的二硫键连接方式为C1-C3与C2-C4,称为球形异构体(globular isomer),二硫键间形成2个loop环。含有4个半胱氨酸的α-芋螺毒素线性肽氧化折叠后往往产生3种异构体,除了C1-C3与C2-C4间的天然肽二硫键连接方式(球形异构体)外,另外两种异构体分别是带状异构体(ribbon isomer)与珠子状异构体(bead isomer)。带状异构体的二硫键连接方式为C1-C4与C2-C3;珠子状异构体的二硫键连接方式为C1-C2与C3-C4。球形异构体具有完全的生物活性,带状异构体有时通过不同的作用机制也发挥生物活性,珠子状异构体活性往往减小。根据二三及三四半胱氨酸间氨基酸数量不同又可把α-芋螺毒素分为α3/5,α4/7,α4/6,α4/4和α4/3等多种亚家族,每个loop的特征和残基组成的不同是毒素作用于不同受体亚型的基础(Ulens C,HoggRC,Celie PH,et al.Structural determinants of selectivealpha-conotoxin binding to a nicotinic acetylcholine receptor homologAChBP[J].Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:3615–20;Gehrmann J,Alewood PF,Craik DJ.Structure determination of the three disulfidebond isomers of alpha-conotoxin GI:a model for the role of disulfidebonds in structural stability.J Mol Biol.1998,278(2):401-15;GrishinAA,Wang CI,Muttenthaler M,Alewood PF,Lewis RJ,Adams DJ.Alpha-conotoxin AuIB isomers exhibit distinct inhibitory mechanismsand differential sensitivity to stoichiometry of alpha3beta4 nicotinicacetylcholine receptors.J Biol Chem.2010,285(29):22254-63)。
烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)是动物界普遍存在的具有重要生理作用和临床研究意义的细胞膜蛋白,是人类最早发现的一类受体,可分为两类:肌肉型乙酰胆碱受体和神经型乙酰胆碱受体。nAChRs是细胞膜上的变构膜蛋白,介导众多中枢和外周神经***的生理功能,包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放。已证实nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点,这些疾病包括疼痛、烟酒和毒品成瘾、智障、痴呆、精神***症、中枢神经紊乱、癫痫症、帕金森病、精神病、神经肌肉阻滞、重症肌无力、抑郁症、高血压、心率不齐、哮喘、肌肉松弛、中风、乳腺癌和肺癌等。至今对于上述疾病还没有对症治疗的药物。常用的非选择性的nAChR激动剂如烟碱,虽然可以缓解上述神经疾病的症状,但它们对心脏和胃肠道产生强烈的副作用,且有成瘾性。因此,开发针对nAChRs各种亚型具有高选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在(LivettBG,Sandall DW,Keays D,Down J,Gayler KR,Satkunanathan N,Khalil Z.Therapeutic applications of conotoxins that target theneuronal nicotinic acetylcholine receptor.Toxicon,2006,48(7):810-829;Taly A,Corringer PJ,Guedin D,Lestage P,ChangeuxJP.Nicotinic receptors:allosteric transitions and therapeutic targets inthe nervous system.Nat Rev Drug Discov.2009,8(9):733-50;LaylaA,McIntosh JM.Alpha-conotoxins as pharmacological probes ofnicotinic acetylcholine receptors[J].Acta Pharmacol Sin 2009 Jun;30(6):771–783.)。
然而,要开发这样的药物的前提是,要获得可以特异结合nAChRs各种亚型的选择性化合物,作为工具药来研究和鉴定各种亚型的精细组成和生理功能,或直接作为相关疾病的治疗药物。
nAChRs由不同的α和β亚基组装成很多种亚型,每种亚型都有截然不同的药理学特征。其中肌肉型乙酰胆碱受体由5个亚基构成,含2个α1亚基,1个β亚基,1个δ亚基和1个γ或ε亚基,γ或ε亚基取决于其是否为胎儿或成体的乙酰胆碱受体。哺乳动物神经型nAChRs亚型比肌肉型nAChRs复杂得多,至少有8种α亚基、3种β亚基,分别为α2-α7、α9、α10(在雏鸡中存在α8)、以及β2-β4。其中α2,α3和α4可以分别同β2或者β4结合,形成功能性受体,比如α2β2、α3β2、α2β4等。此外,α7和α9可以形成同源多聚体。由于缺乏针对各种亚型的高选择性配体化合物,要研究和阐明各种各样的nAChRs亚型的精细结构和功能面临诸多挑战。
据调查,疼痛影响几乎1/6的人群,包括关节炎、神经痛、肿痛。其中神经痛影响4-8%的人群,包括酒精中毒、坐骨神经痛、癌症与癌症化疗、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤等都会引起神经痛。含有α3-亚基的nAChRs,包括α3β2与α3β4亚型主要表达在外周神经***,是神经痛药物作用的靶点。阻断α3β2或α3β4nAChRs的α-芋螺毒素在临床前多种顽固性疼痛(chronic pain)模型上显示出很好的镇痛活性,且不成瘾。顽固性疼痛是一个世界性的健康难题,急需新的治疗药物面世(Napier,I.A.;Klimis,H.;Rycroft,B.K.;Jin,A.H.;Alewood,P.F.;Motin,L.;Adams,D.J.;Christie,M.J.,Intrathecal α-conotoxins Vc1.1,AuIB and MII acting on distinctnicotinic receptor subtypes reverse signs of neuropathic pain.Neuropharmacology 2012,62(7),2202-2207.Blyth,F.M.;March,L.M.;Brnabic,A.J.;Jorm,L.R.;Williamson,M.;Cousins,M.J.,Chronicpain in Australia:a prevalence study.PAIN 2001,89(2-3),127-34.Cousins,M.J.;Brennan,F.;Carr,D.B.,Pain relief:a universal humanright.PAIN 2004,112(1-2),1-4.Eisenberg,E.;McNicol,E.D.;Carr,D.B.,Efficacy and safety of opioid agonists in the treatment of neuropathicpain of nonmalignant origin:systematic review and meta-analysis ofrandomized controlled trials.JAMA:the journal of the AmericanMedical Association 2005,293(24),3043-52.)。
药物成瘾既是医疗难题亦是严重的社会问题。烟瘾是由烟草中的烟碱(尼古丁)引起的,其体内受体就是烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)(Azam L,McIntosh JM.Alpha-conotoxins as pharmacologicalprobes of nicotinic acetylcholine receptors.Acta Pharmacol Sin.2009;30(6):771-783)。新近研究表明,阻断含有α3β4的nAChRs可有效防止烟瘾、***和***毒瘾的发作,显著抑制吸烟和吸毒的欲望(Brunzell DH,Boschen KE,Hendrick ES,Beardsley PM,McIntoshJM.Alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic acetylcholine receptors inthe nucleus accumbens shell regulate progressive ratio respondingmaintained by nicotine,Neuropsychopharmacology,2010,35(3):665-73)。
研究表明,表达在多巴胺能(DA)神经元的nAChRs是治疗神经精神疾病,如烟碱、***与***等的成瘾、帕金森病、痴呆、精神***症、抑郁等的药物作用靶点(Larsson,A.;Jerlhag,E.;Svensson,L.;Soderpalm,B.;Engel,J.A.,Is an alpha-conotoxin MII-sensitivemechanism involved in the neurochemical,stimulatory,and rewardingeffects of ethanol?Alcohol 2004,34(2-3),239-50.Jerlhag,E.;Egecioglu,E.;Dickson,S.L.;Svensson,L.;Engel,J.A.,Alpha-conotoxinMII-sensitive nicotinic acetylcholine receptors are involved in mediatingthe ghrelin-induced locomotor stimulation and dopamine overflow innucleus accumbens.European neuropsychopharmacology,2008,18(7),508-18)。
α3β4nAChR是感觉的以及自律的神经中枢中主要的乙酰胆碱受体亚型。α3β4nAChRs也是中枢神经***(CNS)神经元的分支,譬如向中枢延伸的松果体缰、背部骨髓,涉及到烟碱及其他滥用药物的成瘾(Millar,N.S.;Gotti,C.,Diversity of vertebrate nicotinic acetylcholinereceptors.Neuropharmacology 2009,56(1),237-46;Tapper,A.R.;McKinney,S.L.;Nashmi,R.;Schwarz,J.;Deshpande,P.;Labarca,C.;Whiteaker,P.;Marks,M.J.;Collins,A.C.;Lester,H.A.,Nicotineactivation of alpha4* receptors:sufficient for reward,tolerance,andsensitization.Science 2004,306(5698),1029-32.)。α3β4nAChR涉及到中枢边缘多巴胺途径,对于滥用某种物质(如毒品)产生的奖赏效应起着非常重要的作用。并且在β4亚基敲除的老鼠中,烟碱引起的运动和奖赏效应显著减少,这意味着α3β4nAChR在CNS中烟碱成瘾的重要作用(24 Salas,2004)。α3β4 nAChR在恐惧反应中也起着很重要的作用,对于调节谷氨酸和去甲肾上腺素的释放至关重要(Zhu,P.J.;Stewart,R.R.;McIntosh,J.M.;Weight,F.F.,Activation of nicotinicacetylcholine receptors increases the frequency of spontaneousGABAergic IPSCs in rat basolateral amygdala neurons.Journal ofneurophysiology 2005,94(5),3081-91.Alkondon,M.;Albuquerque,E.X.,A non-alpha7 nicotinic acetylcholine receptor modulates excitatoryinput to hippocampal CA1 interneurons.Journal of neurophysiology2002,87(3),1651-4.Luo,S.;Kulak,J.M.;Cartier,G.E.;Jacobsen,R.B.;Yoshikami,D.;Olivera,B.M.;McIntosh,J.M.,alpha-conotoxinAuIB selectively blocks alpha3 beta4 nicotinic acetylcholine receptorsand nicotine-evoked norepinephrine release.The Journal ofneuroscience:the official journal of the Society for Neuroscience 1998,18(21),8571-9.Kulak,J.M.;McIntosh,J.M.;Yoshikami,D.;Olivera,B.M.,Nicotine-evoked transmitter release from synaptosomes:functional association of specific presynaptic acetylcholine receptorsand voltage-gated calcium channels.Journal of neurochemistry 2001,77(6),1581-9.)。
可见,α-芋螺毒素在疼痛,戒烟,戒毒,治疗帕金森病、痴呆、抑郁和精神***等新药的研发领域具有巨大的潜力,市场亦急需能治疗成瘾的创新药物上市,以缓解吸烟吸毒等带来的疾病损失和严重的社会问题。目前,亟需发现新的高特异性的nAChRs阻断剂。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性地劳动,发现了一个新的α-芋螺毒素肽,其能够特异性地阻断乙酰胆碱受体,特别是对成瘾药物靶点α3β4nAChR具有选择性强阻断活性,具有在制备戒烟戒毒、镇痛药物、有关抑郁、痴呆、精神***症、帕金森症等,以及神经科学工具药等方面的良好应用前景。由此提供了下述发明:
本发明的一个方面涉及一种多肽,其为或者包含选自如下(1)至(3)中任一项所述的氨基酸序列:
(1)SEQ ID NO:5-7或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;
(2)与上述(1)中所述的氨基酸序列至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、尤其优选至少95%、最优选至少97%相同的氨基酸序列;或
(3)被1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加而与上述(1)或(2)所示序列有所不同的氨基酸序列。
为了本发明的一个目的,两个或更多个氨基酸序列之间的相同程度是通过BLAST2.0蛋白质数据库查询程序(Aaltschul等,1997,核酸研究25:3389-3402)并采用下列参数确定的:blastall p blastp-a4-e10-E0-v500-b250-I[查询文档]-d prot_all,其中-p指程序名称,-a指将要用到的服务器数,-e指期望值,-E指延伸缺口的代价,-v指单线描述(one-line description)数,-b指将要显示的比对数,-I指查询文档,-d指用于查询的数据库。
同源多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:5-7或SEQ ID NO:9中任一氨基酸序列不同之处可能在于取代、***、添加和/或缺失了1或多个、优选1-5个、更优选1-3个、尤其优选1-2个、最优选1个氨基酸残基。优选地,氨基酸改变是性质改变较小的变化,即是不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代;小片段缺失,通常是1到大约5个、优选1-3个、更优选1个氨基酸的缺失;小的氨基或羧基末端延伸,如氨基端添加的甲硫氨酸残基;有多达大约20-25个残基的小连接肽;或可通过改变净电荷或者其它功能而有助于纯化的小延伸如多聚组氨酸片段、抗原表位或结合区。
保守性取代的例子是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)内进行的取代。通常不会改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的,并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,在《蛋白质》一书,Academic Press,New York中描述过。最常见的替换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly以及反向进行的替换。因此,本发明还涉及上述氨基酸替换得到的多肽。
本发明还包括在本发明α-芋螺毒素肽的N-末端和/或C末端融合了其它肽/多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。产生融合多肽的技术为本领域内已知,包括连接编码本发明肽的编码序列与编码所述其它肽/多肽的编码序列,使它们在同一读框中,并且融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。
根据本发明任一项所述的多肽,其中,所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键,并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键;或所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键,并且第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键;或所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸形成二硫键,并且第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键;具体地,所述多肽的羧基末端是酰胺化的。
本发明的上述多肽即为芋螺毒素肽;具体地,是α-芋螺毒素肽。
上述芋螺毒素肽可以从我国海南产的织锦芋螺(Conus textile)中提取。也可以化学合成氨基酸序列(例如参考实施例2中的方法);或者通过基因重组的手段表达其核苷酸(核苷酸序列的制备参考实施例1或者直接按照实施例2中的方法进行多肽的人工合成),得到多肽。也可以参考下面的方法:
本发明的另一方面涉及本发明任一项所述的多肽的制备方法,包括下述步骤:
1)在ABI Prism 433a多肽合成仪上或者手工方法合成线性多肽,Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys);半胱氨酸用Trt或Acm保护基团,分别在相应的半胱氨酸之间定点形成二硫键;
2)将步骤1)中得到的线性多肽从树脂上切割下来,并用冰***沉淀和洗涤回收线性多肽粗品,用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化;
3)将步骤2)中得到的产物进行两步氧化折叠。
本发明的再一方面涉及一种多核苷酸,其编码本发明任一项所述多肽的氨基酸序列。
根据本发明任一项所述的多核苷酸,其为或者包含选自如下的(1)至(3)中任一项所述的核苷酸序列:
(1)SEQ ID NO:1-4或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列;
(2)上述(1)中核苷酸序列的互补序列;
(3)在严谨条件下能够与上述(1)中所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
关于多核苷酸之间的杂交,在现有技术中有众多的文献可供参考,包括例如Sambrook等,分子克隆实验室手册,第二版,冷泉港实验室,冷泉港,1989。杂交中可以应用各种程度的严谨条件,例如中度、中度-高度,或者高度严谨条件。越严谨的条件,形成双螺旋要求的互补程度越高。可以通过温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间等等控制严谨程度。对于双链DNA基因探针,杂交于低于DNA杂合体熔解温度[melting temperature,Tm])20-25℃下在6X SSPE、5XDenhardt氏溶液、0.1%SDS、0.1mg/ml变性DNA中进行过夜。清洗通常如下进行:于Tm-20℃在0.2X SSPE、0.1%SDS中一次15分钟(中度严谨条件清洗)。
本发明的再一方面涉及一种核酸构建体,其包含本发明任一项所述的多核苷酸。
本发明的再一方面涉及一种表达载体,其包含本发明任一项所述的核酸构建体。
本发明的再一方面涉及一种转化的细胞,其包含本发明任一项所述的表达载体。
本发明的再一方面涉及一种融合蛋白,其包含本发明任一项所述的多肽。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物,其包含本发明任一项所述的多肽,和/或包含本发明的融合蛋白;可选地,其还包含药学上可接受的载体或辅料。
本发明的再一方面涉及一种阻断乙酰胆碱受体的方法,包括使用有效量的本发明任一项所述的多肽或融合蛋白的步骤;具体地,所述乙酰胆碱受体是α3β4乙酰胆碱受体。
本发明的再一方面涉及一种筛选乙酰胆碱受体抑制剂或者确定乙酰胆碱受体亚型的方法,该方法包括:通过在存在和不存在候选化合物存在的情况下将乙酰胆碱受体与本发明任一项所述的多肽或融合蛋白进行接触的步骤;具体地,所述乙酰胆碱受体为α3β4乙酰胆碱受体。当α-芋螺毒素TxIC/Txd1能够特异阻断α3β4乙酰胆碱受体时,则推断该乙酰胆碱受体是α3β4亚型的乙酰胆碱受体。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽或融合蛋白用于阻断乙酰胆碱受体的用途;具体地,所述乙酰胆碱受体是α3β4乙酰胆碱受体。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽或融合蛋白在制备阻断乙酰胆碱受体的药物或试剂中的用途;具体地,所述乙酰胆碱受体是α3β4乙酰胆碱受体。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽或融合蛋白在制备治疗或预防神经***疾病例如成瘾、神经痛、帕金森症、或痴呆等的药物,或者用于制备杀灭害虫、镇痛、戒烟、或戒毒的药物的用途;具体地,所述神经痛由如下原因导致:癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、***、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防神经***疾病例如疼痛、烟酒和毒品成瘾、智障、痴呆、精神***症、中枢神经紊乱、癫痫症、帕金森病、精神病、神经肌肉阻滞、重症肌无力、抑郁症、高血压、心率不齐、哮喘、肌肉松弛、中风、乳腺癌和肺癌等的方法,或者一种杀灭害虫、镇痛、戒烟、或戒毒的方法,包括给予有效量的本发明的多肽(芋螺毒素肽或其前肽)或融合蛋白或者本发明的药物组合物的步骤;具体地,所述成瘾由烟碱、***、***、酒精等能引起上瘾的物质;所述神经痛由如下原因导致:癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、***、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。
本发明的芋螺毒素肽可通过结合α3β4乙酰胆碱受体(nAChR)发挥作用,具有戒除成瘾与镇痛的活性。可应用于研究、诊断和治疗成瘾、神经痛、帕金森病、痴呆、精神***症、抑郁等神经***疾病、以及作为有用的分子探针用于研究等方面。不同的α-CTX对脊椎动物受体的亲和性不同,有时相差几个数量级。这种种系间的差异使得α-CTX可作为有用的探针用于研究脊椎动物nAChR的种系发生,可作为分子探针来确定nAchR的不同亚型。它们是新药开发的候选药物、先导药物和治疗药物。
下面给出了本发明涉及的术语的解释。
成瘾(addiction)
本发明所述多肽涉及到能治疗各种有依赖性物质引起的成瘾。成瘾是指反复使用精神活性物质者处于周期性或慢性中毒状态。精神活性物质指尼古丁、***、***、甲基***(***)、***、***、***以及国家规定管制的其他能够使人形成瘾癖的***品和***等。成瘾与大脑中大量产生的多巴胺(Dopamine)有关。表现为不可遏制地应用偏爱的物质和难以自制或难以矫正使用行为,为获取精神活性物质达到感觉良好或避免戒断痛苦之目的,可以不择手段。典型情况是耐受性增高,并在物质使用中断后常出现戒断症状。成瘾者的生活可能完全由物质使用主宰,因而严重影响,甚至抛弃了其他重要活动和一切责任。因此,物质使用既给个人,也给社会带来损害。当用于酒精使用时,与慢性酒精中毒的概念等同。成瘾一词还涵盖躯体及心理两方面的内容。心理成瘾强调对饮酒、服药的自控力受损体验,而躯体成瘾指耐受和戒断症状。
神经痛
本发明所述多肽涉及到治疗各种神经痛的用途。神经痛是周围或中枢神经***原发或继发性损害或功能障碍或短暂紊乱引起的疼痛,表现为自发性疼痛、痛觉超敏、痛觉过敏等。很多疾病都会引起神经痛,包括癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎(血管炎)/局部缺血、***、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明所述核酸序列及与之可操作连接的1或多个调控序列的核酸构建体,所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中进行表达。表达应理解为包括多肽生产中所涉及的任何步骤,包括,但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
“核酸构建体”在文中定义为单链或双链核酸分子,它们分离自天然基因,或者经修饰而含有以非天然方式组合和并列的核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明所述编码序列必需的所有调控序列时,术语核酸构建体与表达盒同义。术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括,但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
可以以多种方式操作编码本发明所述肽的分离的核酸序列,使其表达所述肽。可能期望或必须在***载体之前对核酸序列进行加工,这取决于表达载体。应用重组DNA方法修饰核酸序列的技术为本领域所熟知。
本文中术语“调控序列”定义为包括表达本发明肽所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括,但不限于,前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度,调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接,可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象,其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置,以使调控序列指导多肽的表达。
调控序列可以是合适的启动子序列,即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列,包括突变的、截短的和杂合的启动子,可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
调控序列还可以是合适的转录终止序列,即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。
调控序列还可以是合适的前导序列,即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。
调控序列还可以是信号肽编码区,该区编码一段连在多肽氨基端的氨基酸序列,能引导编码多肽进入细胞分泌途径。核酸序列编码区的5’端可能天然含有翻译读框一致地与分泌多肽的编码区片段自然连接的信号肽编码区。或者,编码区的5’端可含有对编码序列是外来的信号肽编码区。当编码序列在正常情况下不含有信号肽编码区时,可能需要添加外来信号肽编码区。或者,可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽分泌。但是,任何能引导表达后的多肽进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。
调控序列还可以是肽原编码区,该区编码位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被称为酶原或多肽原。多肽原通常没有活性,可以通过催化或自我催化而从多肽原切割肽原而转化为成熟的活性多肽。
在多肽的氨基末端即有信号肽又有肽原区时,肽原区紧邻多肽的氨基末端,而信号肽区则紧邻肽原区的氨基末端。
添加能根据宿主细胞的生长情况来调节多肽表达的调控序列可能也是需要的。调控***的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应,从而开放或关闭基因表达的***。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中,应将编码多肽的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。
表达载体
本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体,该载体可以包括1或多个方便的限制位点,以便在这些位点***或取代编码多肽的核酸序列。或者,可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体***适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时,可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。
重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。
载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构,可独立于染色体进行复制),例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者,载体是一个当导入宿主细胞时,将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外,可应用单个载体或质粒,或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒,或转座子。
优选本发明所述载体含有1或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因,其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性,或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。
优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中,或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。
就进行自主复制的情况而言,载体还可以包含复制起点,使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如,fEhrlich,1978,美国国家科学院学报75:1433)。
可以向宿主细胞***1个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少1个附加拷贝***宿主细胞基因组中,或者与该核酸序列一起***一个可扩增的选择标记,通过在有合适选择试剂存在下培养细胞,挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。
用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等,分子克隆实验手册,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989)。
宿主细胞
本发明还涉及包含可用来重组生产多肽的本发明所述核酸序列的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞,从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。
宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞,例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。
制备方法
本发明还涉及重组制备本发明肽的方法,该方法包括:(a)在适于产生所述肽的条件下,培养含有核酸构建体的宿主细胞,该核酸构建体包含编码所述肽的核酸序列;和(b)回收该肽。
在本发明所述制备方法中,用本领域已知方法在合适多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如,可以在合适的培养基中,在允许多肽表达和/或分离的条件下,通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中,采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如,美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中,则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌,可以从细胞裂解物中回收。
可以用本领域已知方法回收所产生的多肽。例如,可以通过常规操作(包括,但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收多肽。
可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述多肽,这些操作包括,但不限于层析(例如,离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、HPLC、电泳(例如,制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如,蛋白质纯化,J.C.Janson和Lars Ryden编,VCHPublishers,New York,1989)。
转基因动物和植物
本发明还涉及转化了本发明的核酸序列的动物或植物细胞,优选小麦、玉米等植物细胞,赋予被转化宿主新的性状(如抗虫性)。这可以通过本领域技术人员熟知的技术,用此处公开的构建体转化动物或植物细胞而实现。
用于控制害虫的方法和制剂
可以通过本领域技术人员知道的多种方法,使用本发明的芋螺毒素肽或多核苷酸来实现控制害虫。这些方法包括例如将重组微生物应用于害虫(或它们的所在地)、和用编码本发明的芋螺毒素肽的基因转化植物。转化可以由本领域技术人员使用常规技术进行。此处公开了用于这些转化的必要物质,或者熟练的技术人员可以通过其它方法容易的获得。
可以将配制的含有芋螺毒素肽、或包含本发明所述多核苷酸的重组微生物的制剂应用于土壤。还可以将配制的产品作为种子覆料或根部处理或作物生长周期晚期的完整植株处理应用。制剂可以包括扩散-增稠佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂、或表面活性剂。液体制剂可以是基于水的或非水的,并以泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化浓缩物等等形式使用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂、或聚合物。
本领域技术人员可以理解,杀虫剂浓度将由于特殊制剂的本性广泛变化,特别是可作为浓缩物或直接使用。杀虫剂将以至少1%(重量计)存在,而且可能是100%(重量计)。干燥制剂通常有大约1-95%(重量计)的杀虫剂,而液体制剂将通常是液相中固体重量大约1-60%。含有细胞的制剂将通常含有大约102-大约104个细胞/mg。这些制剂将以每公顷大约50mg(液体的或干的)-1kg或更多的量使用。通过喷、撒、洒等等,可以将制剂应用于害虫环境,例如土壤和植物。
药物组合物
本发明还涉及含有本发明肽和药学可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物可用于研究、诊断、缓解或治疗与成瘾、神经痛、智障、疼痛、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力、癌症等有关的疾病或病症。在一个实施方案中,含有治疗有效量的本发明肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药,并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。
含治疗有效量的本发明多肽的药物组合物非肠道给药、口服、脑池内给药、鞘内给药等。“药学可接受载体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下、鞘内和关节内注射和输注。本发明多肽还可通过缓释***恰当地给药。
本发明还涉及特异阻断nAChRs的药物组合物。
可应用本发明的芋螺毒素肽作为有用的探针来用于研究动物nAChR的种系发生;作为分子探针来确定nAChR的不同亚型;作为分子模型,设计新药;作为研究、诊断神经性疾病如成瘾、帕金森氏病、行动障碍、精神***症等的工具药和治疗药物;治疗乳腺癌、肺癌、小细胞肺癌等的侯选药物。作为多肽杀虫剂,开发为新型生物农药等。
发明的有益效果
本发明得到了一种新型α4/6-芋螺毒素(命名为α-CTX TxIC),是α3β4nAChR的强阻断剂,也是迄今为止发现的最强的α3β4nAChR阻断剂,其对α6/α3β4nAChR也有一定的阻断作用,对α2β4nAChR具有极弱的阻断活性。α-CTX TxIC是α3β4nAChR结构与功能研究的新型工具,并有助于开发针对成瘾、疼痛、恐惧等有关的治疗药物。
本发明的α-芋螺毒素肽能够特异地阻断乙酰胆碱受体(nAChRs),并且具有戒除成瘾与镇痛活性,以及治疗帕金森症、痴呆、精神***症、抑郁、恐惧等疾病的功效。
附图说明
图1:α-芋螺毒素TxIC/Txd1(TxIC)前肽基因序列及其编码产生的前肽与翻译后修饰产生的成熟肽。箭头所指为翻译后修饰的加工位点。推断的蛋白酶水解加工位点1(processing site 1)在碱性氨基酸精氨酸(R)的后面;C末端酰胺化加工位点在箭头所指的甘氨酸的位置,用字符底纹表示,即processing site 2.成熟肽C末端紧挨半胱氨酸(Cys)的第一个甘氨酸残基往往是酰胺化翻译后修饰的加工位点,从processing site 2进行酰胺化产生的成熟肽命名为TxIC/Txd1(或TxIC),序列为:GCCSHPVCSAMSPIC#(#表示C末端酰胺化)。前肽区用斜体字表示,成熟肽用下划线表示,其中的半胱氨酸(C)用黑体字显示,终止密码子用*表示。
图2:A显示的是成熟肽α-TxIC/Txd1(SEQ ID NO:7)序列及其二硫键连接方式I-III,II-IV。B显示的是含有I-III,II-IV二硫键连接方式的α-TxIC/Txd1的HPLC色谱图,该毒素肽的色谱分析条件为:用Vydac C18 HPLC反相分析柱,在40分钟内进行线性梯度洗脱,B液从15%到50%,A液从85%到50%,A液是0.65%的三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),B是0.5% TFA与90%乙腈(acetonitrile)的水溶液。紫外分析波长为214nm,TxIC的出峰时间,即保留时间是23.366分钟。
图3:α-TxIC是α3β4nAChR的选择性强阻断剂。A显示的是1μMα-TxIC对α3β4nAChR的电流影响情况。图A中“C”是指的对照电流,箭头所指的是1μMα-TxIC温育5分钟后,第一个Ach脉冲形成的电流轨迹(~0nA)。B显示的是α-TxIC对其他10个nAChRs各种亚型的浓度剂量反应曲线,图中横坐标为所用α-TxIC的摩尔浓度(M)的对数值(Log[TxIC]M);纵坐标为剂量反应百分数(%Response),是相应浓度的毒素作用下乙酰胆碱受体电流与对照电流的比值百分数。α-TxIC特异阻断α3β4nAChR,其半阻断剂量(IC50)仅为12.5nM;α-TxIC对α6/α3β4nAChR也有一定的阻断作用,其半阻断剂量(IC50)为94nM;α-TxIC对α2β4nAChR有很微弱的阻断作用,其半阻断剂量高达4550nM。在10μM毒素浓度下,TxIC对其他亚型没有阻断作用,其IC50>10μM。图中各个数值是取自3-8个非洲爪蟾***的电流平均值。
图4:显示的是1μMα-TxIC对α3β4nAChR(A),以及10μMα-TxIC对其很接近的α4β4(B),α7(C)nAChRs的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流,紧接“C”后面的是α-TxIC的毒素浓度。箭头所指的是温育5分钟后,TxIC阻断相应受体亚型的第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。1μMα-TxIC特异阻断α3β4nAChR,而10μM完全不阻断α4β4(B)与α7(C)nAChRs亚型。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)、相应的参考文献、或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:α-芋螺毒素TxIC/Txd1的基因克隆和序列分析
1.织锦芋螺毒腺基因组DNA的提取
分别以从海南岛、西沙群岛等沿海采集的织锦芋螺(C.textileLinnaeus)活体为材料,储存在-80℃备用。先将芋螺毒腺解剖出来,并称重。然后用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(购自中国北京天根生化科技有限公司),提取毒腺的基因组DNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。得到毒腺的基因组DNA。
将提取的毒腺基因组DNA溶于100μL TE中,取5μL进行1.0%琼脂糖凝胶电泳,以λ-EcoT14 I digest DNA Marker为标准,检测所得DNA的完整性和大小。用核酸蛋白质分析仪测定DNA溶液的OD260、OD280值以及OD260/OD280比值,并计算DNA的浓度(μg·ml-1)、纯度和DNA产率(μg·g-1)。
所提取的DNA作为进行芋螺毒素基因克隆的模板,用于下面的PCR扩增。
2.PCR反应及其产物的克隆、测序、和序列分析
根据α-CTX前体基因内含子序列及其3’端非翻译区(3’-UTR)序列,设计α-CTX特异引物。每条引物均为18个碱基的寡核苷酸片段。
上游内含子引物序列:
5’-GTGGTTCTGGGTCCAGCA-3’(SEQ ID NO:11);
下游3’-UTR引物序列:
5’-GTCGTGGTTCAGAGGGTC-3’(SEQ ID NO:12)。
将所提取的毒腺基因组DNA原液稀释至终浓度为3μg·ml-1,作为PCR扩增的模板待用。
分别对引物浓度和退火温度等条件进行优化,最后确定理想的PCR体系为:DNA模板4μl、引物(各5μmol/L)各0.5μl、2×Taq PCRMasterMix 12.5μl、灭菌双蒸水补充至25μl。
PCR反应程序为:94℃加热7min进行预变性,然后按照94℃,30s变性;50℃,1min退火;72℃,2min延伸进行扩增,共35个循环,72℃延伸10min,反应后4℃保存。
取8μl扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,电压90V,电泳20min,以DL2000 DNA Marker为标准,检测扩增产物的大小。
3.PCR产物的克隆、测序、和序列分析
回收PCR扩增产物,与T-easy载体(Promega)连接后转化大肠杆菌XL1菌株(也可以使用其它商业化的感受态大肠杆菌),利用蓝白菌落和氨苄青霉素抗性挑选重组子,抽提纯化重组子质粒用于测序分析。得到两个测序结果,即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2(图1,168bp),分别如下:
GTGGTTCTGGGTCCAGCATTTGATGGCAGGA ATGCTGCA GGCAACGACAAAATGTCCGCCCTGATGGCTCTGACCA CAGG GGATGCTGTTCCCATCCTGTCTGTAGCGCGATGAGTCCAATCT GTGGCTGAAGACGCTGATGCTCCAGGACCCTCTGAACCACGACA(SEQ ID NO:1)或,
GTGGTTCTGGGTCCAGCATTTGATGGCAGGAATGCTGCA GGCAACGACAAAATGTCCGCCCTGATGGCTCTGACCA CAGG GGATGCTGTTCCCATCCTGTCTGTAGCGCGATGAGTCCAATCT GTGGCTGAAGACGCTGATGCTCCAGGACCCTCTGAACCACGACA(SEQ ID NO:2)。
上面的两个序列只有第77位的碱基不同,用加框标出。
所获的PCR扩增产物的测序结果经DNAStar软件分析,获知其编码蛋白序列、3’-非翻译区(UTR)序列。经序列分析比较,获得了本发明的新型α4/6-CTX TxIC/Txd1的前体基因。即EQ ID NO:1和EQ ID NO:2中带下划线的部分,其为编码TxIC/Txd1芋螺毒素前肽的核苷酸序列,如下(114aa):
TTTGATGGCAGGAATGCTGCAGGCAACGACAAAATGTCCGCCCTGATGGCTCTGACCACAGGGGATGCTGTTCCCATCCTGTCTGTAGCGCGATGAGTCCAATCTGTGGCTGA(SEQ ID NO:3);
TTTGATGGCAGGAATGCTGCAGGCAACGACAAAATGTCCGCCCTGATGGCTCTGACCACAGGGGATGCTGTTCCCATCCTGTCTGTAGCGCGATGAGTCCAATCTGTGGCTGA(SEQ ID NO:4)。
根据前体基因及芋螺毒素特点,推测出TxIC/Txd1芋螺毒素前肽,它具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(37aa),下文中也称为α-conotoxin TxIC/Txd1 precursor或α-TxIC/Txd1precursor或TxIC/Txd1 precursor或TxIC precursor):
FDGRNAAGNDKMSALMALTTR↓GCCSHPVCSAMSPIC G(SEQ ID NO:5);
FDGRNAAGNDKMSALMALTIR↓GCCSHPVCSAMSPIC G(SEQ ID NO:6)。
芋螺毒素前体蛋白的信号肽、前肽以及成熟肽的预测,采用在线ProP 1.0 Server进行分析(Duckert,P.;Brunak,S.;Blom,N.,Predictionof proprotein convertase cleavage sites.Protein engineering,design &selection:PEDS 2004,17(1),107-12.)。推断的方法和原理请参考LuoS,Zhangsun D,Zhang B,Quan Y,Wu Y.Novel alpha-conotoxinsidentified by gene sequencing from cone snails native to Hainan,andtheir sequence diversity.J Pept Sci.2006,12(11):693-704。推导过程和结果亦参见图1。
根据前肽序列推测出成熟肽TxIC/Txd1,它具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(下文中也称为α-conotoxin TxIC/Txd1或α-TxIC/Txd1或TxIC/Txd1或TxIC):
GCCSHPVCSAMSPIC #(SEQ ID NO:7,#表示C末端酰胺化,15aa)
TxIC/Txd1含有α-CTX所特有的CC-C-C半胱氨酸模式,二硫键连接方式I-III,II-IV(图2A),即在第一和第三个半胱氨酸之间,以及第二和第四个半胱氨酸之间分别形成两对二硫键。TxIC/Txd1为4/6型α-CTX(图1和图2A)。TxIC/Txd1是新的α-芋螺毒素,与其他α-CTX的序列和活性比较见表1。
实际上,本发明的成熟肽TxIC/Txd1也可由前肽(SEQ ID NO:5或6或9)在体内或体外经过相应的加工(例如图1所示)得到,可选地,在体内或体外通过酰胺化酶对其C末端进行酰胺化。
编码TxIC/Txd1成熟肽的核苷酸序列如下(45bp):
GGATGCTGTTCCCATCCTGTCTGTAGCGCGATGAGTCCAATCTGT(SEQ ID NO:8)。
本发明还涉及成熟肽在未经第二个加工位点(processing 2)的序列(16aa):
GCCSHPVCSAMSPIC G(SEQ ID NO:9),
其对应的核苷酸序列如下(51bp):
GGATGCTGTTCCCATCCTGTCTGTAGCGCGATGAGTCCAATCTGTGGCTGA(SEQ ID NO:10)。
实施例2:α-芋螺毒素TxIC的人工合成
根据α-芋螺毒素TxIC成熟肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:7,C末端酰胺化),采用Fmoc方法人工合成TxIC线性肽(图2A)。具体方法如下:
树脂肽采用Fmoc化学方法进行人工合成,可用多肽合成仪或手工合成法合成树脂肽。除了半胱氨酸外,其余氨基酸用标准的侧链保护基团。TxIC的第1和第3个半胱氨酸(Cys)的-SH用Trt(S-trityl)保护,第2和第4个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对保护。其合成步骤为:采用固相合成法中的Fmoc与FastMoc方法,在ABI Prism 433a多肽合成仪上合成了3个异构体线性肽。Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys).采用Fmoc HOBT DCC方法,Rink酰胺化树脂及Fmoc氨基酸,合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全,在哌啶脱保护及偶合时间上分别适当延长,对难接氨基酸采用双偶合,获得树脂肽。用reagent K(trifluoroacetic acid/water/ethanedithiol/phenol/thioanisole;90:5:2.5:7.5:5,v/v/v/v/v)将线性肽从树脂上切割下来,并用冰***沉淀和洗涤回收线性肽粗品,用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化,洗脱线性梯度为在0-40min内15-50% B90,第40-45min 50-100% B90.溶剂B90是90% ACN(acetonitrile),10% H20,0.5% TFA(trifluoroacetic acid);溶剂A是0.65% TFA的水溶液。紫外吸收值分析在214nm波长下进行。纯化后的线性肽用分析型的HPLC C18柱(Vydac)进行纯度检测,洗脱梯度为0–40min 2–42% B60,42-47min 42–100% B60,流速为1mL/min。其纯度达95%以上,用于氧化折叠。
参照文献(Dowell,C.;Olivera,B.M.;Garrett,J.E.;Staheli,S.T.;Watkins,M.;Kuryatov,A.;Yoshikami,D.;Lindstrom,J.M.;McIntosh,J.M.,Alpha-conotoxin PIA is selective for alpha6 subunit-containingnicotinic acetylcholine receptors.The Journal of neuroscience 2003,23(24),8445-52.)对TxIC的线性肽进行两步氧化折叠反应,过程简述如下:
首先通过铁***氧化法(20mM potassium ferricyanide,0.1MTris,pH 7.5,30min)在Trt保护基团的两个半胱氨酸之间形成第一对二硫键。单环肽经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化后,进行碘氧化(10mM iodine in H2O:trifluoroacetic acid:acetonitrile(78:2:20by volume,10min),移去另外2个半胱氨酸上的Acm,同时在这2个半胱氨酸之间形成第二对二硫键。二环肽再经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化,洗脱线性梯度仍为在0-40min内15-50% B90,第40-45min 50-100% B90.溶剂B90是90% ACN(acetonitrile),10% H2O,0.5% TFA(trifluoroacetic acid);溶剂A是0.65% TFA的水溶液。紫外吸收值分析在214nm波长下进行。即获得按照从N端至C端的顺序在相应的半胱氨酸之间定向形成二硫键的α-芋螺毒素,TxIC的出峰时间为23.366min(图2B),并通过质谱(MS)鉴定为正确。
氧化折叠后的TxIC的理论分子量(monoisotopic mass)与测定分子量一致:TxIC的理论分子量为1488.81Da,TxIC的测定分子量为1488.4266Da,比它的线性肽分子量1492.815Da减少4Da。多肽浓度用280nm波长下比色测定,根据Beer-Lambert方程(equation)计算多肽浓度和质量。这些定量过的折叠好的毒素肽用于下面实施例中的活性实验。
实施例3:α-芋螺毒素TxIC特异阻断α3β4nAChR实验
参照文献(Azam L,Yoshikami D,McIntosh JM.Amino acidresidues that confer high selectivity of the alpha6 nicotinicacetylcholine receptor subunit to alpha-conotoxinMII[S4A,E11A,L15A].J Biol Chem.2008;283(17):11625-32.)中的方法,以及体外转录试剂盒(mMessage mMachine in vitro transcriptionkit(Ambion,Austin,TX))说明书,制备各种大鼠神经型nAChRs亚型(α3β4,α6/α3β4,α9α10,α4β2,α4β4,α3β4,α2β2,α2β4,α7)、人类α3β4、以及小鼠肌肉型nAChRs(α1β1δε)的cRNA,其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾(Xenopuslaveis)***(蛙卵),将cRNA注射入蛙卵中,每个亚基的注射量为5ng cRNA。肌肉nAChR每个亚基注射0.5-2.5ng DNA。蛙卵在ND-96中培养。蛙卵收集后的1-2天内注射cRNA,注射后1-4天内用于nAChRs的电压钳记录。
将1个注射过cRNA的蛙卵置于30uL的Sylgard记录槽中(直径4mm×深度2mm),重力灌注含有0.1mg/ml BSA(bovine serumalbumin)的ND96灌流液(96.0mM NaCl,2.0mM KCl,1.8mM CaCl2,1.0mM MgCl2,5mM HEPES,pH 7.1-7.5)或含有1mM atropine的ND96(ND96A),流速为1ml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有0.1mg/ml BSA以减少毒素的非特异性吸附,用转换阀(SmartValve,Cavro Scientific Instruments,Sunnyvale,CA)可以在灌注毒素或乙酰胆碱(ACh)之间进行自由切换,以及一系列三通螺线阀(solenoid valves,model 161TO31,Neptune Research,Northboro,MA)使灌注ND96与ACh等之间进行自由切换。Ach门控的电流由双电极电压箝放大器(model OC-725B,Warner Instrument Corp.,Hamden,CT)设置在“慢”箝,以及clamp gain在最大值(×2000)位置时进行在线记录。用1mm外径×0.75内径mm的玻璃毛细管(fiber-filled borosilicatecapillaries,WPI Inc.,Sarasota,FL)拉制玻璃电极,并充满3M KCl作为电压和电流电极。膜电压箝制在-70mV.整个***均由电脑控制和记录数据。ACh脉冲为每隔5min自动灌注1s的ACh。ACh的浓度分别为,表达肌肉型的nAChRs和神经型α9α10 nAChRs卵为10μM;表达神经型的nAChRs之α7为200μM,其它的亚型都为100μM。至少记录4个卵表达某个亚型对不同毒素浓度的电流反应情况,以及电流轨迹。
测试的电流数据用GraphPad Prism软件(San Diego,CA)进行统计分析,绘制剂量反应曲线,计算芋螺毒素的半阻滞浓度IC50等多种有关毒素阻断nAChRs的各种参数。
结果表明,TxIC(实施例2制备)对大鼠α3β4 nAChR均有特异阻断作用,洗脱较快(图3)。TxIC是迄今为止发现的α3β4nAChR的活性最强的阻断剂,其半阻断剂量IC50仅为12.5nM,与其他已知的芋螺毒素的活性比较见下面的表1。
1μM α-TxIC/Txd1完全阻断了由Ach门控的大鼠α3β4 nAChR开放产生的电流,洗脱较快,阻断是可逆的(图3A)。TxIC对α3β4nAChR的阻断活性最强,其半阻断剂量IC50和误差范围为12.5nM(9.4-16.5nM);TxIC对α6/α3β4 nAChR的阻断活性次之,其半阻断剂量IC50和误差范围为94.1nM(73-121nM);TxIC对α2β4nAChR的阻断活性很微弱,其半阻断剂量IC50和误差范围为4550nM(3950-5230nM)。TxIC对它们的剂量反应曲线的斜率(Hillslope)和误差范围分别为:α3β4 nAChR,0.19(0.66-1.44);α6/α3β4 nAChR,0.26(0.73-1.87);α2β4 nAChR,0.20(1.48-2.42)。α-TxIC对其他nAChRs亚型没有阻断活性,包括α4β4、α4β2、α6/α3β2β3、α2β2、α9α10、α7、α1β1δε,其IC50>10μM(图3B,表2),相比之下,α-TxIC阻断α3β4比阻断α6/α3β4的活性要强7.5倍,比阻断α2β4的活性要强524倍(图3B,表2)。
α-TxIC/Txd1对α3β4 nAChR的阻断选择性高。从1μMα-TxIC/Txd1对α3β4 nAChR,以及10μM α-TxIC/Txd1对其非常接近的α4β4(B),α7(C)nAChRs的电流影响情况可以看出(图4),1μMα-TxIC/Txd1特异阻断α3β4 nAChR(图4A),而比之高10倍浓度的毒素对α4β4(图4B),与α7(图4C)nAChRs亚型没有阻断活性。对人类α3β4 nAChR,α-TxIC具有与大鼠α3β4 nAChR相似的阻断活性。
因此,α-TxIC是目前发现的对α3β4 nAChR活性最强的α-芋螺毒素,其活性比较见下面的表1。
表1:α-TxIC与其他α-芋螺毒素序列及其活性比较
表中星号(*)表示C末端酰胺化,半胱氨酸用字符边框和黑体显示。短线(-)表示缺口。
表2:α-TxIC对各种nAChRs亚型的半阻断剂量IC50和剂量反应曲线的斜率
亚型 | IC50(nM)a | 比率b | 斜率a | 亚型 | IC50(nM)c |
α3β4 | 12.5(9.4-16.5) | 1 | 0.19(0.66-1.44) | α6/α3β2β3 | >10000 |
α6/α3β4 | 94.1(73-121) | 7.5 | 0.26(0.73-1.87) | α2β2 | >10000 |
α2β4 | 4550(3950-5230) | 524 | 0.20(1.48-2.42) | α9α10 | >10000 |
α4β4 | >10000 | -- | -- | α7 | >10000 |
α4β2 | >10000 | -- | -- | α1β1δε | >10000 |
表中a是置信度为95%的区间;b是其他亚型与α3β4 nAChR半阻断剂量(IC50)的比值;c是在10μM下没有阻断活性。
现有技术的研究表明,α3β4 nAChR是治疗神经精神疾病,如烟碱、***与***等的成瘾、神经痛、帕金森病、痴呆、精神***症、抑郁、恐惧等的药物作用靶点(参见背景技术中的相关文献)。因此,本发明的新的α-芋螺毒素TxIC/Txd1在上述疾病的机理研究、诊断、治疗方面具有极高的应用价值。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (15)
1.一种多肽,其为或者包含选自如下(1)至(3)中任一项所述的氨基酸序列:
(1)SEQ ID NO:5-7或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;
(2)与上述(1)中所述的氨基酸序列至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、尤其优选至少95%、最优选至少97%相同的氨基酸序列;或
(3)被1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加而与上述(1)或(2)所示序列有所不同的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽,其中,所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键,并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键;或所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键,并且第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键;或所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸形成二硫键,并且第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键;具体地,所述多肽的羧基末端是酰胺化的。
3.一种融合蛋白,其包含权利要求1或2所述的多肽。
4.一种多核苷酸,其编码权利要求1或2所述多肽的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸,其为或者包含选自如下的(1)至(3)中任一项所述的核苷酸序列:
(1)SEQ ID NO:1-4或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列;
(2)上述(1)中核苷酸序列的互补序列;
(3)在严谨条件下能够与上述(1)中所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
6.一种核酸构建体,其包含权利要求4或5所述的多核苷酸。
7.一种表达载体,其包含权利要求6所述的核酸构建体。
8.一种转化的细胞,其包含权利要求7所述的表达载体。
9.一种药物组合物,其包含权利要求1或2所述的多肽,或者包含权利要求3所述的融合蛋白;可选地,其还包含药学上可接受的载体或辅料。
10.一种在体内或体外阻断乙酰胆碱受体或者调节乙酰胆碱水平的方法,包括使用有效量的权利要求1或2所述的多肽或权利要求3所述的融合蛋白的步骤;具体地,所述乙酰胆碱受体是α3β4乙酰胆碱受体。
11.一种筛选乙酰胆碱受体抑制剂或者确定乙酰胆碱受体亚型的方法,该方法包括:通过在存在和不存在候选化合物存在的情况下将乙酰胆碱受体与权利要求1或2所述的多肽或权利要求3所述的融合蛋白进行接触的步骤;具体地,所述乙酰胆碱受体为α3β4乙酰胆碱受体。
12.权利要求1或2所述的多肽或权利要求3所述的融合蛋白用于阻断乙酰胆碱受体的用途;具体地,所述乙酰胆碱受体是α3β4乙酰胆碱受体。
13.权利要求1或2所述的多肽或权利要求3所述的融合蛋白在制备阻断乙酰胆碱受体的药物或试剂中的用途;具体地,所述乙酰胆碱受体是α3β4乙酰胆碱受体。
14.权利要求1或2所述的多肽或权利要求3所述的融合蛋白在制备治疗和/或预防神经***疾病例如成瘾与神经痛,以及治疗帕金森症、痴呆、精神***症、抑郁、癌症等的药物的用途,或者用于制备杀灭害虫、镇痛、戒烟、戒毒的药物的用途;具体地,所述成瘾由如下原因导致:各种精神活性物质,包括尼古丁、***、***、甲基***(***)、***、***、***以及国家规定管制的其他能够使人形成瘾癖的***品和***等。具体地,所述神经痛由如下原因导致:癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、***、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、或过敏症。
15.权利要求1或2所述的多肽的制备方法,包括下述步骤:
1)在ABI Prism 433a多肽合成仪上或者手工方法合成线性多肽,Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys);半胱氨酸用Trt或Acm保护基团,分别在相应的半胱氨酸之间定点形成二硫键;
2)将步骤1)中得到的线性多肽从树脂上切割下来,并用冰***沉淀和洗涤回收线性多肽粗品,用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化;
3)将步骤2)中得到的产物进行两步氧化折叠。
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Citations (1)
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---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
胡洁等: "中国南海新α-芋螺毒素Mrl.8的合成及二硫键测定", 《生物技术通讯》, vol. 23, no. 1, 20 April 2012 (2012-04-20), pages 102 - 104 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016169028A1 (zh) * | 2015-04-23 | 2016-10-27 | 深圳华大基因研究院 | 三种芋螺毒素肽、其制备方法及应用 |
EP3560950A4 (en) * | 2016-12-21 | 2020-12-16 | Hainan University | NOVEL MUTANT OF ALFA-CONOTOXIN-PEPTIDE-TXID, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE OF IT |
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