CN103645229B - 用于检测细菌的阵列式多重电化学恒温扩增芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学检测技术领域，具体为一种用于细菌检测的阵列式多重电化学的恒温扩增芯片及其制备方法。该芯片由激光刻蚀的ITO玻璃电极基底和聚二甲基硅氧烷微芯片组成。以ITO玻璃和聚二甲基硅氧烷为材料，通过激光刻蚀和微加工技术制备而成。该芯片空间阵列有序排列，利用扩增信号的空间区分来实现多重核酸目标物的同时检测；每个扩增池中分别含有一套三电极体系：工作电极、对电极、参比电极，通过与外界多通道电化学工作站相连接，并进行LAMP恒温反应，进行实时检测；通过对实时曲线图进行数据处理得到定量分析结果。该芯片制作简单，操作方便，易于大规模制备，为LAMP方法实现临床多种病原体同时定量检测提供了有效方案。
Description
技术领域
本发明属于电化学检测技术领域，具体涉及一种阵列式多电化学恒温扩增芯片及其制备方法。
背景技术
上呼吸道感染，是指发生在呼吸道的急性感染，包括普通感冒、流行性感冒、鼻咽炎、咽扁桃腺炎及喉炎等，多呈自限性，但发生率较高。感染的病原体80%是病毒，其次为细菌。而78%的病人被诊断服用对病毒无效的抗生素，这将严重导致细菌耐药性的产生。临床上诊断一般通过血清学和细菌培养的方法诊断，灵敏度较低，耗时长。因此，及时定性定量检测引起感冒的细菌，对于临床上对症下药及判断疾病程度有重大意义。
环介导等温核酸扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）最早由日本科学家发明，该及时具有灵敏度高、特异性好、反应速度快、反应条件简单等优点，经过近10年的学术研究，现以各种检测试剂盒的形式进入市场。但是LAMP反应的定量分析需要昂贵精密的仪器，设备精良的实验室和受过专门训练的技术人员。这对于及时诊断，尤其是在经济不发达的地区的诊断是不适用的。电化学微阵列技术，集合了微流控技术和电化学方法，利用了微流控技术在微米尺度下层流效应、表面张力效应、毛细管效应的大幅度增强，和电化学仪器经济易得，便于操作的优点。传统的电极制备方法包括电极印刷，电镀，电沉积技术，但电镀和电沉积技术较为繁琐，不易于商品化，印刷电极导电性和重现性一般。而激光刻蚀铟锡氧化物（indium tin oxide, ITO）玻璃电极，利用激光精准的刻蚀出电极，既保留了印刷电极的价格低廉，易于大规模制作的优点，同时改善其缺点，做到导电性，重现性好，能根据个人意图设计任何图案的目的。该技术将对电化学、生命科学和临床医学等领域产生深远影响。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于细菌检测的阵列式多重电化学恒温扩增芯片及其制备方法。
本发明提供的用于细菌检测的阵列式多重电化学恒温扩增芯片，它由激光刻蚀的ITO玻璃电极基底和聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）微芯片构成。见附图1所示。其中，ITO玻璃电极，由多个单独阵列独立构成，每个阵列均由三电极体系组成，阵列数量可依据模板检测物的需求设计，如三重，五重，八重等等，不受限制。电化学信号通过加入电化学活性分子亚甲基蓝来检测，其与LAMP反应中不断生成的双链DNA有相互作用，在不同反应阶段有不同作用，并有多通道电化学工作站进行实时检测，从而达到多重实时检测的目的。
本发明还提供上述扩增芯片的制备方法，其具体步骤为：
a.ITO 玻璃电极基底的制备：电极是可以任何形状，由激光精准的刻蚀在一定大小的ITO玻璃上，只要刻蚀图案的地方是导电的。它可以包括若干个单独的工作电极，若干个对电极相，互连接形成一个大环，并引出电化学池，以便与外部导线连接；所有的参比电极汇集到中间形成一个圆，并沉积Ag/AgCl；
b.ITO玻璃电极的预处理：将刻蚀好的ITO玻璃电极依次用蒸馏水、无水乙醇及二次蒸馏水超声清洗干净，待用；
c. PDMS芯片的构造：包括有若干个圆形扩增池，每个通道分别有加样孔、排液孔，所有扩增池都互相隔离，不受干扰；
d.芯片模板的制作：利用微加工技术（如MEMS、光刻等），制作芯片模板，模板结构与上述PDMS芯片构造相对应，模板材料可以为硅材料；
e. 芯片浇注，脱气和固化：将二甲基硅氧烷和固化剂混合均匀后，倾倒于芯片模板上，真空脱气，固化，分别开若干个加样孔、排液孔，将芯片裁减成相应的形状；
f.通过等离子处理，将处理好的ITO玻璃电极与PDMS芯片键合；
g.将键合的芯片用导电银胶连接导线，晾干后，使用万能胶再次固定。
本发明提供的上述扩增芯片可直接用于细菌DNA的电化学检测；其检测方法如下：
将所述芯片的工作电极、对电极和参比电极与多通道电化学工作站相连接，组成多个三电极***；将配置好的适量LAMP反应混合液从加样孔加入，LAMP反应混合液中含一定量的亚甲基蓝溶液，一定量细菌裂解液和LAMP反应试剂；将芯片置于恒温加热板上加热，当温度达到63℃时，开始电化学测量；在一定电位范围内进行方波伏安法扫描，每隔1分钟测量一次，得到实时检测数据；处理所得结果，得到不同浓度细菌的时间与浓度的对数的线性关系曲线，利用标准曲线法对临床样本进行分析检测。
本发明的优点和特点如下：
（1）本发明利用了ITO刻蚀电极的优点，可由激光精准刻蚀出任意电极图案，不仅避免了复杂的电沉积、电镀等复杂的工艺流程，还保留了印刷电极大批量生产，成本低的优点，其导电性和重现性优异。
（2）本发明利用LAMP技术恒温扩增的优点，并结合电化学工作站成本低，简单，易操作等优点，避免了使用昂贵的实验器材，非常有利于LAMP方法在基层的推广和应用。
（3）利用电化学工作站多通道检测的优点，实现多重检测，以便快速鉴定多重病原体。
（4）从加样到得到定量检测结果，不超过1h，简单快速。
附图说明
图1为阵列式多重电化学恒温扩增芯片图示。其中，上部分为扩增芯片实物图，下部分为ITO刻蚀玻璃电极基底结构示意图。
图2为引起呼吸道感染的肺结核杆菌（a-e, 2.8×105, 2.8×104, …, 2.8×101 copies/ μL）的时间-电流微分曲线图。其中，右图为细菌的标准溶液的时间-log(浓度)曲线图。
图3为引起呼吸道感染的流感嗜血杆菌（a-e, 1.7×105, 1.7×104, …, 1.7×101 copies/ μL）的时间-电流微分曲线图。其中，右图为细菌的标准溶液的时间-log(浓度)曲线图。
图4为引起呼吸道感染的肺炎克雷伯菌（a-e, 1.6×105, 1.6×104, …, 1.6×101 copies/ μL）的时间-电流微分曲线图。其中，右图为细菌的标准溶液的时间-log(浓度)曲线图。
图中标号：1为扩增池，2为加样孔，3为排液孔，4为工作电极，5为对电极，6为参比电极。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明做进一步描述，但具体实例并不对本发明做任何限定。
实施例
利用此阵列式多重电化学恒温扩增技术平台，开发了一款八通道的，肺结核杆菌，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯菌分型的阵列式多重电化学恒温扩增芯片。
本实施例中的用于细菌检测的阵列式多重电化学恒温扩增芯片的制备步骤如下：
(1) ITO玻璃电极基底的制备：由激光精准的刻蚀在4cm宽，1mm厚的ITO玻璃上刻蚀出八卦阵形状的阵列式电极，只有刻蚀图案的地方是导电的。它包括八个单独的工作电极，一个对电极相互连接形成一个大环，并引出电化学池以便与外部导线连接。所有的参比电极汇集到中间形成一个圆，并沉积Ag/AgCl；将刻蚀好的ITO玻璃电极依次用蒸馏水、无水乙醇及二次蒸馏水超声清洗干净，待用；
(2) PDMS芯片的制备：它包括若八个圆形扩增池，每个通道分别有加样孔、排液孔。所有扩增池都互相隔离，不受干扰；利用微加工技术（MEMS、光刻等）的方法制作芯片模板，模板结构与上述PDMS芯片构造相对应，模板材料可以为硅材料；将二甲基硅氧烷和固化剂烷氧基硅烷按质量比5-12:1混合均匀后，小心倾倒于芯片模板上，真空脱气30min后80℃固化2h，分别开若干个加样孔，排液孔和；将芯片裁减成八边形；
(3) 用于细菌检测的阵列式多重电化学恒温扩增芯片的制备：通过等离子处理，将上述处理好的ITO玻璃电极与PDMS芯片永久键合；将键合的芯片用导电银胶连接导线，过夜晾干后，使用万能胶再次固定。
本实施例的电化学监测
在6个扩增池中两两分别加入含有1.6 μL的三种细菌标准样本和10 μM亚甲基蓝的LAMP反应液20 μL，其中含10 μM亚甲基蓝溶液；另外两个扩增池中不含细菌样本，作为空白对照。封闭反应孔，相应电极与八通道电化学工作站的导线相连，并将芯片置于恒温加热板上加热，当温度达到63℃时，开始电化学测量；从-0.6 V到-0.1 V的电位范围内进行方波伏安法扫描，每隔1分钟测量一次，得到实时检测数据；处理所得结果，得到三组不同浓度细菌的时间与浓度的对数的线性关系曲线，利用标准曲线法对临床样本进行分析检测，如图2、图3和图4所示。肺结核杆菌（a-e, 2.8×105, 2.8×104, …, 2.8×101 copies/ μL），流感嗜血杆菌（a-e, 1.7×105, 1.7×104, …, 1.7×101 copies/ μL），肺炎克雷伯菌（a-e, 1.6×105, 1.6×104, …, 1.6×101 copies/ μL）的线性方程分别为y1=-4.62x+45.930；y1=-6.95962x+51.928; y3=-6.26595x+44.8908，线性相关系数分别为，r1= 0.9917; r2=0.9944; r3=0.9943；检测限分别为28 copies/ μL，17 copies/ μL ，16 copies/ μL。
本发明通过阵列式微流控芯片与电化学方法相结合，实现多种细菌的LAMP信号实时检测，改善了LAMP反应需要精密昂贵仪器的现状，非常有利于LAMP方法在基层的推广和应用。通过激光刻蚀ITO玻璃制备电极的方法，避免了复杂的电沉积、电镀等复杂的工艺流程，同时可以根据需要实现芯片上扩增池的任意多重空间阵列排布。该芯片结构模式理论上具有无限的可扩展性，可以根据实际需求完成任意多重的LAMP有效扩增，实现多靶点的快速定量检测，从而满足临床任意多种病原体或遗传性疾病的快速诊断。
Claims (2)
1.一种用于细菌检测的阵列式多重电化学恒温扩增芯片的制备方法，该芯片由激光刻蚀的ITO玻璃电极基底和聚二甲基硅氧烷PDMS微芯片构成；其中，ITO玻璃电极由多个单独阵列独立构成，每个阵列均由三电极体系组成，阵列数量依据模板检测物的需求设计；所述电极为任何形状，由激光精准的刻蚀在一定大小的ITO玻璃上，刻蚀图案的地方导电；它包括若干个单独的工作电极，若干个对电极相，互连接形成一个大环，并引出电化学池，以便与外部导线连接；所有的参比电极汇集到中间形成一个圆，并沉积Ag/AgCl；
其特征在于具体步骤为：
a.ITO玻璃电极基底的制备：电极为任何形状，由激光精准的刻蚀在一定大小的ITO玻璃上，刻蚀图案的地方导电；它包括若干个单独的工作电极，若干个对电极相，互连接形成一个大环，并引出电化学池，以便与外部导线连接；所有的参比电极汇集到中间形成一个圆，并沉积Ag/AgCl；
b.ITO玻璃电极的预处理：将刻蚀好的ITO玻璃电极依次用蒸馏水、无水乙醇及二次蒸馏水超声清洗干净，待用；
c.PDMS芯片的制备：PDMS芯片包括有若干个圆形扩增池，每个通道分别有加样孔、排液孔，所有扩增池都互相隔离，不受干扰；
d.芯片模板的制作：利用微加工技术制作芯片模板，模板结构与上述PDMS芯片构造相对应，模板材料为硅材料；
e.芯片浇注，脱气和固化：将二甲基硅氧烷和固化剂烷氧基硅烷按质量比5-12:1混合均匀后，倾倒于芯片模板上，真空脱气，固化，分别开若干个加样孔、排液孔，将芯片裁减成相应的形状；
f.通过等离子处理，将处理好的ITO玻璃电极与PDMS芯片键合；
g.将键合的芯片用导电银胶连接导线，晾干后，使用万能胶再次固定。
2.如权利要求1所述制备方法制备获得的阵列式多重电化学恒温扩增芯片在细菌DNA电化学检测中的应用，其特征在于具体步骤如下：
将所述芯片的工作电极、对电极和参比电极与多通道电化学工作站相连接，组成多个三电极***；将配置好的 LAMP反应混合液从加样孔加入，LAMP反应混合液中含一定量亚甲基蓝溶液、细菌裂解液和LAMP反应试剂；将芯片置于恒温加热板上加热，当温度达到63℃时，开始电化学测量；在一定电位范围内进行方波伏安法扫描，每隔1分钟测量一次，得到实时检测数据；处理所得结果，得到不同浓度细菌的时间与浓度的对数的线性关系曲线，利用标准曲线法对临床样本进行分析检测。
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