CN103645185A - 一种可视化检测碱性磷酸酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可视化检测碱性磷酸酶的方法，包括步骤：利用碱性磷酸酶催化其底物氨基磷酸酚（p-APP）产生具有强还原性的物质对氨基苯酚（p-AP），而p-AP能在纳米金的存在下将Ag+还原成Ag0沉积到纳米金表面形成Au/Ag纳米颗粒，从而利用胶体金溶液的颜色变化及紫外可见吸收光谱的变化实现对酶活性的检测。将酶促金属化和纳米金诱导银沉积相结合，建立了一种超高灵敏的可视化检测碱性磷酸酶的方法，该方法具有操作简单，特异性强，灵敏度高，且不需要复杂仪器等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种可视化检测酶活性的方法，属于分析检测领域。
背景技术
可视化检测由于其对仪器要求低、操作简单，作为一种快速检测的有效方法而在临床诊断方面被广泛应用。基于金属纳米颗粒的比色分析法由于其简单、方便以及金属纳米颗粒独特的光学性质而受到人们的广泛关注。但是基于金属纳米颗粒聚集的比色法在实际应用中仍然存在一些缺陷，例如：金属纳米颗粒容易受到一些外部因素的影响，例如高的离子强度，实际样品中的复杂物质等，从而导致金属纳米颗粒的非特异性聚集；另外这些检测方法的灵敏度也有待于进一步提高。
据报道，有众多类型的酶，如氧化酶，羟化酶，水解酶，或NAD(P)+依赖的酶等，都可以作为生物催化剂合成金属纳米粒子，从而发生酶促金属化反应。文献中已经有利用酶催化金的沉积应用到酶的底物的可视化检测。但是由于氯金酸具有比较强的氧化性，即使在具有弱还原性的溶液中也能够被还原（例如葡萄糖溶液），因此该检测方法很容易受到干扰。另外该方法的灵敏度也有待于进一步提高。
基于此我们将酶促金属化和纳米金诱导银沉积相结合，建立了一种超高灵敏且抗干扰能力强的非聚集的金属纳米颗粒比色法，该方法结合了酶催化反应的专一性和催化放大性及金属纳米颗粒独特的光学性质等优点，大大增加了检测的灵敏度及特异性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速、高灵敏、可视化检测碱性磷酸酶的方法。
该方法包括如下步骤：将碱性磷酸酶加入到含有对氨基磷酸酚、硝酸银、纳米金的二乙醇胺缓冲液中孵育，利用缓冲液的颜色变化及紫外可见吸收光谱的变化实现对碱性磷酸酶的检测。
上述碱性磷酸酶可以催化检测液中对氨基磷酸酚（p-APP）磷酸基团的水解，产生具有强还原性的对氨基苯酚（p-AP），而p-AP能在纳米金的存在下将Ag+还原成Ag单质沉积在纳米金表面形成Au/Ag纳米颗粒，从而导致检测液的颜色变化及其紫外可见吸收光谱的变化。
所述二乙醇胺缓冲液为0.5mol/L pH9.8的二乙醇胺缓冲液，其中含有8mmol/L的对氨基磷酸酚、2mmol/L的硝酸银和15nmol/L的纳米金。
本发明方法将酶促金属化和纳米金诱导银沉积相结合，通过胶体金颜色的变化对碱性磷酸酶的浓度进行检测，步骤非常简单，无需进行纳米金的标记，而且灵敏度高，特异性好。通过紫外可见分光光度计进行定量检测，在孵育时间为30分钟时，检测限为12fmol/L，相当于50μL体系中可以检测到0.6amol的碱性磷酸酶，而且增加孵育时间可以进一步提高检测的灵敏度。通过将吸光度随时间的变化同碱性磷酸酶的浓度作图，得到很好的定量关系，线性范围50fmol/～20pmol/L，R2=0.998。检测过程非常简单，且灵敏度高，特异性强。
附图说明
图1检测碱性磷酸酶的原理示意图。
图2透射电镜及紫外可见光谱表征：(A)为纳米金的透射电镜图；(B)为纳米金的紫外可见吸收光谱图；(C)和（E）分别是在不同浓度的碱性磷酸酶的存在下进行酶促金属化反应以后所得到的Au/Ag纳米颗粒的透射电镜图；(D)和(E)分别是他们的紫外可见吸收光谱图；内部插图为对应的纳米金及Au/Ag纳米颗粒的放大透射电镜图。
图3不同浓度碱性磷酸酶检测的颜色变化照片（A），紫外可见光谱图（B）(孵育时间为30min)。
图4检测液370nm处的吸光度随时间的变化。
图5(A)不同孵育时间条件下检测液370nm处吸光度与ALP浓度的关系曲线；(B)检测液每分钟370nm处吸光度的变化与ALP浓度的关系曲线。
图6检测碱性磷酸酶方法的特异性柱状图，插图为其对应的紫外可见吸收光谱图。
具体实施方式
以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1碱性磷酸酶的检测
下面以碱性磷酸酶为例，对基于酶促金属化的可视化检测酶的方法进行详细的说明。
一、方法
1、纳米金的制备
称取7.5mg谷胱甘肽，溶于0.1mL超纯水中，搅拌状态下加入到1mL1%氯金酸溶液中，混匀后用10mol/L NaOH调节pH值至2.5-3.0，产生浅黄色沉淀。离心（7000rpm，3分钟）收集沉淀得到Au(I)配合物。
将上述Au(I)配合物用1mL5mmol/L氢氧化钠溶液溶解，得到金前体溶液。将金前体溶液用9mL超纯水稀释，并调节pH至5.5左右。然后向反应体系中加入4mg还原型辅酶Ⅱ（NADPH）和2个单位的谷胱甘肽还原酶（GR），室温下搅拌反应2小时。反应产物用Amicon超滤管(MWCO30kD)纯化，除去溶液中多余的物质，最后分散在超纯水中，4℃保存。
2、碱性磷酸酶的检测
将40μL不同浓度的碱性磷酸酶加入到0.5mol/L二乙醇胺检测液中（pH9.8，且含有8mmol/L对氨基磷酸酚，2mmol/L AgNO3和15nmol/L纳米金），在37℃孵育一定的时间后观察其颜色变化或者用紫外可见光谱仪测定其吸收光谱。
3、特异性实验
采用一定浓度的葡萄糖、尿素、抗坏血酸、细胞色素和凝血酶作为对照，分别按照步骤2进行实验。
4、血清样品中ALP的检测
取1μL的人新鲜血清，用pH9.8的二乙醇胺溶液稀释40倍后直接采用步骤2检测人血清中的ALP。另外还将一定量的ALP加入到人血清中测定其标准回收率。
二、结果
1、酶促金属化的表征
检测碱性磷酸酶的原理如图1所示，在碱性磷酸酶的催化作用下，银离子能够被还原沉积到纳米金表面，通过检测溶液的颜色变化及紫外可见吸收光谱变化而对碱性磷酸酶进行定性和定量的检测。该发明中所制备的纳米金平均粒径约为6nm，具有良好的分散性和稳定性，且在520nm处具有纳米金的SPR特征峰（图2B）。当将碱性磷酸酶加入到含有纳米金、对氨基磷酸酚和硝酸银的检测液中时，就能发生如图1B所示的酶促金属化的反应，其反应方程式为：
该反应的最终结果就是在纳米金表面沉积了银单质，生成Au/Ag纳米颗粒（图2C、2E），伴随着银纳米颗粒在370nm处的特征吸收峰的出现（图2D）。如图2C、2E所示，随着在检测体系中加入碱性磷酸酶浓度的增加，所生成的Au/Ag纳米颗粒粒径变大，检测液的颜色从纳米金的红色逐渐变成纳米银的黄色再变成灰黑色。
2、碱性磷酸酶的检测
如图3A所示，随着碱性磷酸酶浓度的增大，检测液的颜色从纳米金的红色逐渐变成纳米银的黄色，再进一步变成棕色甚至灰黑色。图3B所示的是紫外可见吸收光谱随碱性磷酸酶的浓度变化，随着检测液中碱性磷酸酶浓度的增大，纳米银370nm处的吸光度逐渐增加，证明有更多的银被还原并附着在纳米金表面。如图4所示检测液370nm处的吸光度随着孵育时间的延长呈线性增加，而ALP浓度越高A370增加的越快，证明银的沉积对ALP的活性几乎没有影响。当孵育时间为30分钟时，该方法的检测限为12fmol/L，相当于50μL体系中可以检测到0.6amol的碱性磷酸酶，而且增加孵育时间可以进一步提高检测的灵敏度（图5A）。
由于该检测方法具有超高的灵敏度，检测液370nm处的吸光度很容易就超过了紫外可见吸光光度计的量程，因此具有比较窄的线性范围。由于检测液370nm处的吸光度随着孵育时间的延长呈线性增加，因此采用每分钟370nm处吸光度的变化对ALP浓度作图，可以得到很好的定量关系，其线性范围为50fmol/～20pmol/L，R2=0.998。
3、特异性
图4是用10mmol/L葡萄糖、10mmol/L尿素、10μmol/L抗坏血酸、5μmol/L细胞色素及1μmol/L凝血酶作为对照所得到的370nm处吸光强度柱状图，从图中可以看出对照组的信号均在阴性域值的范围内，只有在碱性磷酸酶的存在下才会在370nm处产生大的吸收峰。证明该方法具有比较好的特异性。
4、人血清样品中ALP的检测
本方法可以直接应用于人血清样品中ALP的检测，检测结果如表1所示，加标回收率在95.0%～106.8%之间，说明该法有望应用于复杂实际样品。
表1人血清样品中碱性磷酸酶的检测
通过以上各项检测，证明本发明方法可以应用于碱性磷酸酶的检测，操作简单、快速且灵敏度高，检测限可达到12fmol/L，而且该方法不需要复杂的仪器，可以实现可视化检测。本发明方法还可以推广到其他酶的检测。
Claims (2)
1.一种检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，将碱性磷酸酶加入到含有对氨基磷酸酚、硝酸银、纳米金的二乙醇胺缓冲液中孵育，利用缓冲液的颜色变化及紫外可见吸收光谱的变化实现对碱性磷酸酶的检测。
2.根据权利要求1所述的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述二乙醇胺缓冲液为0.5 mol/L pH 9.8的二乙醇胺缓冲液，其中含有8 mmol/L的对氨基磷酸酚、2 mmol/L的硝酸银和15 nmol/L的纳米金。
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