CN103642722B

CN103642722B - 一种烟碱降解菌及其应用

Info

Publication number: CN103642722B
Application number: CN201310616712.1A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 呙亚屏; 王瑞; 冀志霞; 杨亮; 秦兴成; 伍良伟; 徐迪红; 施河丽
Original assignee: HUBEI TBACCO Co ENSHI BRANCH; Huazhong Agricultural University
Current assignee: HUBEI TBACCO Co ENSHI BRANCH; Huazhong Agricultural University
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2015-06-24
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: CN103642722A

Abstract

本发明涉及一种烟碱降解菌及其应用，其特征在于烟碱降解菌，该菌分类学命名为噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17，于2013年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2013405。菌株经2M3发酵罐发酵生产后与自制腐熟剂以1:10的质量比混合，再以1%的接种量接入烟草秸秆堆体，经30～45d发酵后，烟秆可腐熟，与传统堆肥发酵相比，烟碱降解率提高了60%～78%，总氮增加量为7%～9%、总磷增加量为0.3%～0.6%、总钾增加量为6%～8%。

Description

一种烟碱降解菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种烟碱降解菌及其应用。

背景技术

在烟草种植生产中，有大量烟秆这一农业废弃物的产生。烟秆含有高浓度的恶性污染物质烟碱，且携带病原菌和虫卵等，将大量烟秆丢弃或焚烧将产生严重的土壤、大气污染和加重土传病害的传播。所以，合理处理烟秆，使废弃烟秆得到资源化利用，是烟草种植良性发展的基础。烟秆富含N、P、K等植物所需营养元素和有机质，通过高温堆肥技术利用微生物降解可以将烟秆转变为优质的有机肥料。且高温堆肥的高温环境可以杀死烟秆中的各种病原菌和寄生虫，减少烟秆有机肥还田后作物生长过程中病虫害的发生和杂草的出现。所以，烟秆的高温堆肥化利用在处理废弃烟秆方面有着良好的实际应用价值。

目前包括烟秆在内的作物秸秆高温堆肥腐熟，主要是利用能分解木质纤维素的自然界微生物或可促进发酵的复合微生物菌剂。然而烟草秸秆具有其特殊性，它含有较高浓度烟碱，烟碱本身会抑制微生物的生长，另外，由于烟碱本身是一种生物碱，烟秆中大量烟碱的存在，使烟秆的pH呈碱性，一般在8.5以上，较高的pH也会影响烟秆堆体中微生物的生长，从而影响烟秆堆肥的腐熟速度及腐殖化程度等。

发明内容

本发明目的是为了解决现有技术在烟秆堆肥过程中微生物受烟秆中高浓度烟碱抑制、烟秆腐熟进程延缓、堆肥产品品质降低等问题，利用烟碱降解菌加快烟草秸秆腐熟，提高堆肥质量。

本发明所述的一种烟碱降解菌，其特征在于烟碱降解菌，该菌分类学命名为噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17，于2013年9月10日保藏于武汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2013405。

本发明所述的一种烟碱降解菌，其特征在于烟碱降解菌EA-17工业生产为二级发酵，其生产方法为：将活化菌种接于LB液体培养基，30-37℃培养10-18h，制备成一级种子；再将一级种以0.1%-0.5%的接种量接种于装有液体LB培养基的2M³发酵罐中，发酵罐装液量为60%，30-37℃，搅拌转速250rpm，通气比0.2VVM-1VVM，发酵16-24h，生物量达3×10⁹CFU/mL。

本发明所述的一种烟碱降解菌在烟秆堆体中的应用。

本发明所述的一种烟碱降解菌在烟秆堆体中的应用，其特征在于所述的烟碱降解菌EA-17使用方式为：烟碱降解菌发酵液与自制腐熟剂以1:10的质量比混合后，按1%的接种量接入烟秆堆体，保持堆体水分60%-65%，发酵30-45d，即可腐熟，所述的自制腐熟剂含有黑曲霉孢子10⁷个/g，枯草芽孢杆菌10⁸CFU/g。

本发明所述的一种烟碱降解菌在烟秆堆体中的应用，其特征在于所述的烟碱降解菌EA-17，经30-45d发酵后，烟秆堆体中烟碱降解率可达43%-50%，与不接种烟碱降解菌只添加腐熟剂的传统堆肥发酵工艺相比，烟碱降解率提高了60%-78%，总氮增加量为7%-9%、总磷增加量为0.3%-0.6%、总钾增加量为6%-8%，纤维素降解率增加了15%-20%，半纤维素降解率增加了25%-30%。

本发明所述的一种烟碱降解菌在烟秆堆体中的应用：

烟碱降解菌EA-17菌液制备

本发明所用的烟碱降解菌为噬组氨醇节杆菌（Arthrobacterhistidinolovorans），保藏编号为CCTCCM2013405，菌种代号EA-17。

LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0-pH7.2，121℃，灭菌30min。

菌种发酵

将烟碱降解菌EA-17接种于LB培养基上（LB培养基基础上添加2%琼脂），30℃-37℃培养18-24h。

将上述培养好的烟碱降解菌EA-17转接于液体LB培养基中，30℃-37℃，180r/min培养10-18h。

将上述培养好的液体菌种转接到含液体LB培养基的2M³发酵罐中，发酵参数为：温度30℃-37℃，发酵16-24h，装液量60%，搅拌转速250rpm，通气比0.2VVM～1VVM。

在发酵罐中发酵16-24h后，发酵液应生物量可达3×10⁹CFU/mL。

烟碱降解菌的使用，EA-17发酵液和自制烟秆腐熟剂（黑曲霉孢子：10⁷个/g，枯草芽孢杆菌10⁸CFU/g）以1:10的质量比混合，按1%的接种量接入烟草秸秆堆体中，保持堆体水分60%-65%，发酵30～45d，即可腐熟。

本发明利用生物技术生产烟秆有机肥，用高效烟碱降解菌EA-17促进烟草秸秆腐熟。

本发明针对烟草秸秆，利用从自然环境中筛选出的高效烟碱降解菌，开发促进烟草秸秆腐熟的新工艺。

附图说明：

图1为本发明所述烟碱降解菌堆肥过程中堆体温度变化图；

图2为本发明所述烟碱降解菌T处理堆肥过程中烟碱降解菌生物量变化图；

图3为堆肥过程中堆体烟碱含量变化图；

图4为本发明所述烟碱降解菌堆肥过程中堆体pH值变化图；

图5为本发明所述裂褶菌堆肥过程中堆体有机质含量变化图；

图6为本发明所述裂褶菌堆肥过程中堆体总N含量变化图；

图7为本发明所述烟碱降解菌堆肥过程中堆体铵态氮和硝态氮含量的变化图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1:本发明一种烟碱降解菌，该菌分类学命名为噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17，于2013年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2013405。烟碱降解菌EA-17工业生产为二级发酵，其生产方法为：将活化菌种接于LB液体培养基，30-37℃培养10-18h，制备成一级种子；再将一级种以0.1%-0.5%的接种量接种于装有液体LB培养基的2M³发酵罐中，发酵罐装液量为60%，30-37℃，搅拌转速250rpm，通气比0.2VVM-1VVM，发酵16-24h，生物量达3×10⁹CFU/mL。

一种烟碱降解菌在烟秆堆体中的应用，烟碱降解菌EA-17使用方式为：烟碱降解菌发酵液与自制腐熟剂以1:10的质量比混合后，按1%的接种量接入烟秆堆体，保持堆体水分60%-65%，发酵30-45d，即可腐熟，所述的自制腐熟剂含有黑曲霉孢子10⁷个/g，枯草芽孢杆菌10⁸CFU/g。烟碱降解菌EA-17，经30-45d发酵后，烟秆堆体中烟碱降解率可达43%-50%，与不接种烟碱降解菌只添加腐熟剂的传统堆肥发酵工艺相比，烟碱降解率提高了60%-78%，总氮增加量为7%-9%、总磷增加量为0.3%-0.6%、总钾增加量为6%-8%，纤维素降解率增加了15%-20%，半纤维素降解率增加了25%-30%。

实施例2:本发明一种烟碱降解菌EA-17菌液制备

1培养基

2菌剂制备

2.1菌种活化：烟碱降解菌EA-17接种于LB培养基上（LB培养基基础上添加2%琼脂），30℃培养18-24h。

2.2菌株一级种培养：将上述培养好的烟碱降解菌EA-17转接于液体LB培养基中，装液量50ml/500ml三角瓶，培养温度30℃，摇床转速180r/min，摇床培养12h。

2.3发酵罐培养：发酵罐体积2M³，1200L培养基，上述一级种子接种量为2.4L，搅拌转速250rpm，通气比0.5VVM，发酵温度30℃，发酵20h。

3发酵液生物量

发酵液所含烟碱降解菌EA-17的生物量为3×10⁹CFU/mL。

烟碱降解菌EA-17在烟草秸秆腐熟中的应用：

2.1烟碱降解菌EA-17应用方法

EA-17发酵液和自制腐熟剂（黑曲霉孢子：10⁷个/g，枯草芽孢杆菌10⁸CFU/g）以1:10的质量比混合，按1%的接种量接入烟草秸秆堆体中，保持堆体水分60%-65%，发酵30-45d，即可腐熟。对照实验为接种1%腐熟剂的烟秆堆体。

2.2烟碱降解菌加快烟秆腐熟的应用效果

本发明的烟碱降解菌为噬组氨醇节杆菌EA-17，可有效降解烟草秸秆中的烟碱，加快烟秆堆肥腐熟，提高有机质、纤维素等的降解率，从而提高堆肥总N、K等元素的含量。

本发明对堆体接入菌剂的腐熟效果进行验证实验，设置两个不同处理，分别为接种自制烟秆腐熟剂（CK），接入自制烟秆腐熟剂和烟碱降解菌（T），实验结果如下。

2.2.1温度

由图1可以看出，加入微生物菌剂后，堆体温度迅速上升，在5d内，堆体CK、T处理均达到了50℃以上。CK达到最高温度56℃用时14d，维持50℃以上温度为25d。而T处理达到最高温度58℃用时10d，维持50℃以上温度为32d。单从堆体的温度变化分析，添加了烟碱降解菌，改善了其他微生物的生长环境，微生物活动相对活跃，使堆体更快的达到了最高温度且最高温度相对较高。

2.2.2烟碱降解菌生物量

由图2，烟碱降解菌在前8d缓慢增长，然后迅速生长繁殖，到第26d时生物量达到最大1.28×10⁸CFU/g，而菌株初始添加量约为10⁶CFU/g，证明烟碱降解菌可以很好的适应堆肥环境，有效的利用烟秆生长。

2.2.3烟碱含量

堆体中烟碱含量变化如图3。两堆体处理中烟碱含量都呈不断降低的趋势，但T处理的烟碱降解较CK更高。堆肥结束时，CK处理中烟碱降解率为28.27%，T处理为49.33%。说明烟碱降解菌的添加可有效的降解烟秆中的烟碱。

2.2.4pH值

由图4可以看出，CK和T处理堆肥后期pH分别为7.87，7.17。烟碱降解菌有效降解了堆体中释放的碱性物质烟碱，因而降低了堆体pH值。纤维素降解菌适宜生长pH环境为中性和偏酸性，因而T处理可提供更适宜纤维素降解菌生长的pH环境，从而有利于降解烟草秸秆。

2.2.5有机质含量

由图5，堆肥开始时，堆体有机质含量为52%，在堆肥结束时，CK处理有机质含量降至37.17%，T处理降至34.65%，分别降低了28.93%和33.49%，T处理较CK处理有机质降解率提高了15.76%。

2.2.6总氮及水溶性铵态氮、硝态氮含量

由图6可以看出，在堆肥终点时，T处理总氮含量略高出CK8.05%。由图7，整体上呈铵态氮不断减少和硝态氮不断增多的趋势，在发酵终点时，CK处理和T处理氨氮含量分别降至120mg/Kg和59mg/Kg，小于400mg/Kg，达到了高温堆肥腐熟标准。实验结果证实了铵态氮和硝态氮之间的转化关系，很好的指示了堆肥腐熟进程。且T处理硝态氮含量高于CK处理，高出27.78%。说明添加烟碱降解菌有效地减少了氮素的散失，增高了烟秆堆肥总氮和硝态氮含量。

2.2.7总磷钾含量

由表1，堆肥前后，总磷含量在两处理中增长变化差异不大，而CK处理和T处理的总钾含量增加量分别为10.36%，17.67%，即加入烟碱降解菌发酵的烟草秸秆有机肥中的K含量较高。

2.2.8木质纤维素含量

由表2，CK处理中纤维素、半纤维素降解率分别为50.81%和52.27%，添加烟碱降解菌的T处理中，纤维素、半纤维素降解率为59.71%和66.01%，与CK相比提升了17.52%和26.29%，说明烟碱降解菌的加入可有效的提高烟秆的木质纤维素降解。

Claims

1.一种烟碱降解菌，其特征在于烟碱降解菌，该菌分类学命名为噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17，于2013年9月 10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M2013405。

2.按照权利要求1所述的一种烟碱降解菌，其特征在于烟碱降解菌EA-17工业生产为二级发酵，其生产方法为：将活化菌种接于LB液体培养基，30-37℃培养10-18h，制备成一级种子；再将一级种以0.1%-0.5%的接种量接种于装有液体LB培养基的2M³发酵罐中，发酵罐装液量为60%，30-37℃，搅拌转速250rpm，通气比0.2VVM-1VVM，发酵16-24h，生物量达3×10⁹CFU/mL。

3.按照权利要求1所述的一种烟碱降解菌在烟秆堆体中的应用。

4.按照权利要求3所述的一种烟碱降解菌在烟秆堆体中的应用，其特征在于所述的烟碱降解菌EA-17使用方式为：烟碱降解菌发酵液与自制腐熟剂以1:10的质量比混合后，按1%的接种量接入烟秆堆体，保持堆体水分60%-65%，发酵30-45d，即可腐熟，所述的自制腐熟剂含有黑曲霉孢子10⁷个/g，枯草芽孢杆菌10⁸CFU/g。

5.按照权利要求4所述的一种烟碱降解菌在烟秆堆体中的应用，其特征在于所述的烟碱降解菌EA-17，经30-45d发酵后，烟秆堆体中烟碱降解率可达43%-50%，与不接种烟碱降解菌只添加腐熟剂的传统堆肥发酵工艺相比，烟碱降解率提高了60%-78%，总氮增加量为7%-9%、总磷增加量为0.3%-0.6%、总钾增加量为6%-8%，纤维素降解率增加了15%-20%，半纤维素降解率增加了25%-30%。