CN103636416B - MgCl2在促进植物硝态氮吸收中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种MgCl₂的新用途，即MgCl₂在作为植物硝态氮促进吸收剂中的应用。使用时，采用物质的量浓度为130-180μmol/L的MgCl₂溶液对植物进行预处理6-8h，随后将植物放在含硝态氮的农田废水中，观察植物的生长指标；实验结果表明，采用MgCl₂处理的植物，对农田废水中硝态氮的吸收能力增强，质膜H⁺-ATPase及硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶等氮代谢相关的酶活性增强，MgCl₂能够促进植物对氮素吸收同化。

Description

MgCl2在促进植物硝态氮吸收中的应用

技术领域

本发明属于促进植物硝态氮吸收的领域，具体涉及无机化学试剂MgCl₂在促进植物硝态氮吸收中的新用途。

背景技术

近年来，设施栽培技术的成熟和推广加速了我国农业的发展。目前我国的大棚农业生产面积不断扩大，2011年国内设施园艺栽培面积超过240万hm²，居世界第一位。但在生产过程中大棚环境产生的环境问题比露天环境严重。设施蔬菜、花卉栽培周期短、复种指数高、种植结构单一，加上设施栽培土壤常年覆盖得不到雨水冲洗、一般在使用3-5年后均会发生不同程度的次生盐渍化。设施土壤的盐分阴离子主要是NO₃ ^-，是设施蔬菜生产的主要障碍因子。不能耕种后的土地去盐渍化的方式是用水浸泡农田，进一步使含有大量氮素的废水进入河流湖泊，进一步引起水体的富营养化。上述既涉及资源和生态环境问题，也与农业的持续发展息息相关，是目前设施蔬菜生产中亟待解决的问题。因此，发明一种高效、简便、价格低廉和易被接受的植物硝态氮吸收促进剂具有重要意义。

美人蕉（Canna indica）为美人蕉科球茎类花卉植物，多年生直立草本，喜高温和阳光，开花期长，适应性强，具有较高的观赏价值。近年来随着人工湿地处理污水技术的发展，人们对其研究表明，美人蕉根系比较发达，对TN、TP、COD的去除效果较好，已经成为富营养化水体治理的常用植物,具有广阔的应用和推广前景。

镁参与了一切生命体的全部生长过程，被土肥学者看作氮、磷、钾之后植物的第四大必须营养元素。已知镁是叶绿素的重要组成部分，也是叶绿素中唯一的金属元素。镁是各种酶的基本要素和最活跃的部分，广泛的参与了植物的新陈代谢过程，是植物形成淀粉和蛋白质不可缺少的部分。镁对植物的影响已成为国际农学界和土肥界研究的热点问题。已有的研究表明，植物对氮素的吸收、同化是一个非常复杂的过程。硝态氮是植物主要吸收的无机态氮形式之一，经植物根系吸收后还需要经过硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶等一系列作用才能被植物同化。质膜H⁺-ATPase是植物细胞膜上重要的功能蛋白，被称为植物生命活动过程的“主宰酶”,能够建立跨膜质子电动势，促进离子和营养物质的跨膜转运。硝酸还原酶（NR）可以将体内的硝酸盐转化为亚硝酸盐，是硝酸盐同化过程的第一步，是氮代谢的限速酶。谷氨酰胺合成酶（GS）是植物氮代谢的关键酶之一，它在氮同化循环中催化谷氨酸（Glu）与NH₃缩合形成谷氨酰胺（Gln），并参与植物含氮化合物的新陈代谢途径。目前，关于植物吸收氮素机理的研究已有较大进展，但是还没有找到直接有效的提高植物吸收氮素的方法。实际生产中人们还是主要通过增加氮肥的使用量来提高植物对氮素的吸收，但是收效非常有限并引起了上述问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种MgCl₂的新用途，作为植物硝态氮吸收促进剂，即MgCl₂在作为高效快速促进植物对硝态氮吸收、同化中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下：

（1）配制物质的量浓度为130-180μmol/L的MgCl₂溶液；

（2）将湿地土壤中株高30-40cm的美人蕉幼苗置于上述步骤（1）MgCl₂溶液中，对美人蕉根进行6-8h的预处理；

（3）预处理后的植物放在不同浓度硝态氮的农田废水中，观察植物对硝态氮的吸收速率并测定硝态氮吸收、同化关键酶的活性。

本发明提供的MgCl₂促进剂使用方便，成本较低；该促进剂显著增加了植物对硝态氮的吸收和同化。本发明开辟了促进植物氮素吸收、同化的新途径，有助于科技工作者对MgCl₂刺激植物生长的分子机理的研究，在农业生产上有广阔的前景。

本发明的有益效果：本发明所述促进植物氮同化的MgCl₂促进剂，具有投入低、操作简单、效率高的特点，在常温下，MgCl₂是比较理想的促进植物硝态氮吸收的促进剂，氯化镁预处理可以提高美人蕉细胞膜上H⁺-ATPase、硝酸还原酶及谷氨酰胺合成酶等氮素吸收和同化相关酶的活性，提高氮素的吸收和同化效率；有助于减少因过量施肥引起的土壤盐渍化等问题，对农业的可持续发展具有重要意义。

附图说明

图1是本发明添加促进剂150μmol/L MgCl₂处理8h前后美人蕉净化废水效率的结果示意图，其中A图为未经MgCl₂处理美人蕉根对硝酸盐的吸收结果；B图为经MgCl₂处理后美人蕉根对硝酸盐的吸收结果；

图2是本发明添加促进剂MgCl₂对美人蕉质膜H⁺-ATPase活性的影响结果示意图，其中A图为MgCl₂处理前后美人蕉根中质膜H⁺-ATPase活性结果，CK为未经MgCl₂处理的美人蕉；B图为MgCl₂处理前后美人蕉叶中质膜H⁺-ATPase活性结果，CK为未经MgCl₂处理的美人蕉；

图3是本发明添加促进剂MgCl₂对美人蕉根部质膜H⁺-泵活性影响结果示意图，其中A图为未经过MgCl₂处理的对照组，用CK表示；B图为经过MgCl₂处理的实验组；

图4是本发明添加促进剂MgCl₂对美人蕉硝酸还原酶活性的影响结果示意图，其中A图为MgCl₂处理前后美人蕉根中硝酸还原酶活性结果，CK为未经MgCl₂处理的美人蕉；B图为MgCl₂处理前后美人蕉叶中硝酸还原酶活性结果，CK为未经MgCl₂处理的美人蕉；

图5是本发明添加促进剂MgCl₂对美人蕉谷氨酰胺合成酶活性的影响结果示意图，其中A图为MgCl₂处理前后美人蕉根中谷氨酰胺合成酶活性结果，CK为未经MgCl₂处理的美人蕉；B图为MgCl₂处理前后美人蕉叶中谷氨酰胺合成酶活性结果，CK为未经MgCl₂处理的美人蕉；

图6是本发明添加促进剂130μmol/L MgCl₂处理6h前后美人蕉净化废水效率的结果示意图，其中A图为未经过MgCl₂处理美人蕉根对硝酸盐的吸收结果；B图为经过MgCl₂处理后美人蕉根对硝酸盐的吸收结果。

图7是本发明添加促进剂180μmol/L MgCl₂处理7h前后美人蕉净化废水效率的结果示意图，其中A图为未经过MgCl₂处理美人蕉根对硝酸盐的吸收结果；B图为经过MgCl₂处理后美人蕉根对硝酸盐的吸收结果。

具体实施方式

   下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规市购试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：促进美人蕉硝态氮吸收同化的MgCl₂促进剂的应用，包括如下步骤：

（1）实验材料为美人蕉幼苗；选择湿地土壤中株高30-40cm的美人蕉幼苗挖出，放在自来水中水培，每隔两天换一次水，培养30天左右至新根长成用于本实验；

（2）配制物质的量浓度为150μmol/L的MgCl₂溶液；

（3）将（1）中美人蕉置于上述步骤（2）MgCl₂溶液中，对美人蕉根进行8h预处理；然后将处理过的植物转移到体积为3L含有不同硝态氮浓度的农田废水中；同时以未经过氯化镁预处理的美人蕉为对照（CK），也放在体积为3L含有不同硝态氮浓度的农田废水中；测定氯化镁对美人蕉吸收农田废水中硝态氮效率及相关生理指标的影响。

 实施例2：采用实施例1处理后的美人蕉验证MgCl₂促进剂对美人蕉吸收硝酸盐速率的影响，包括如下步骤：

分别在处理的2h、12h、22h三个时间点取实验组和对照组美人蕉处理的农田废水水样5 mL，加入2滴氢氧化铝悬浮液，静置絮凝，离心后上清液用于硝态氮浓度测定，测定时用光程长为10 mm的石英比色皿，以新鲜去离子水为参比，分别在220 nm和275 nm波长处检测，硝态氮吸光度的校正值为OD220值减去2倍的OD275值，从标准曲线中查得硝态氮浓度。每个处理都做3个重复，取测定结果的平均值；通过此方法验证MgCl₂激活剂使用对美人蕉吸收硝酸盐速率的影响。

图1显示，A图为未经MgCl₂处理美人蕉根对硝酸盐的吸收结果，B图为经MgCl₂处理后美人蕉根对硝酸盐的吸收结果。MgCl₂处理对美人蕉吸收硝酸盐速率的影响结果表明，采用本发明MgCl₂处理剂处理美人蕉后，美人蕉苗对硝酸盐的吸收速率显著高于未经过MgCl₂处理的对照组。

 实施例3：采用实施例1处理后的美人蕉验证MgCl₂促进剂对美人蕉质膜H⁺-ATPase活性的影响，包括如下步骤：

A、不同浓度硝态氮废水处理后，取不同处理下美人蕉的根、叶组织0.5 g，用液氮快速冻存，经液氮研磨呈粉末后加入1 mL的质膜提取液(0.25 mol/L山梨醇，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L MgSO₄，10 mmol/L Tris-HCl pH7.4)；匀浆液以9000 g，4 ℃离心20min，去除沉淀，上清经30000g，4℃离心1h；收集沉淀并使其悬浮于0.5mL上述提取液中，所得为细胞质膜蛋白；

B、用Brodford法测定质膜蛋白浓度：在800μL的蒸馏水中加入5μL的质膜蛋白混匀，然后加入200μL的市购Brodford溶液，在OD595波长下检测蛋白浓度，并计算500μg质膜蛋白对应的体积；

C、H⁺-ATPase活性的测定在0.5 mL的反应体系中进行的；反应体系包含50 mmol/L BTP/MES、5 mmol/L MgSO₄、50 mmol/L KCl、0.02% 十二烷基聚乙二醇醚(w/v)、50 mmol/L KNO₃、1 mmol/L（NH₄）₂MoO₄、1 mmol/L NaN₃、4 mmol/L ATP-Na₂，加入500μg的质膜蛋白提取液后启动反应；

将反应混合物置于30℃水浴30min后，加入反应终止液1 ml （2 % H₂SO₄ (v/v)，5 % SDS(w/v)和0.7 % (NH₄)₂MoO₄ (w/v)）后，立即加入50 μL 10% Vc （w/v）并于室温下放置20 min，测定波长为700 nm处的吸光值。

D、根据无机磷标准曲线计算无机磷的释放含量，1单位的质膜H⁺-ATPase活性定义为：在30 ℃的反应条件下，在1分钟内每毫克蛋白催化ATP分解释放无机磷酸的微摩尔数。

图2显示，A图为MgCl₂处理前后美人蕉根中质膜H⁺-ATPase活性变化，其中未经MgCl₂处理的美人蕉为对照组，用CK表示，经过MgCl₂处理的美人蕉为试验组；B图为MgCl₂处理前后美人蕉叶中质膜H⁺-ATPase活性变化，其中未经MgCl₂处理的美人蕉为对照组，用CK表示，经过MgCl₂处理的美人蕉为试验组。MgCl₂处理对美人蕉质膜H⁺-ATPase活性的影响结果表明，采用本发明MgCl₂处理剂处理美人蕉后，美人蕉苗根和叶中质膜H⁺-ATPase活性显著高于对照组CK。

 实施例4：采用实施例1处理后的美人蕉验证MgCl₂促进剂对美人蕉根中H⁺-泵活性的影响，包括如下步骤：

A、不同浓度硝态氮废水处理后，取不同处理下美人蕉的根0.5 g，用液氮快速冻存，经液氮研磨呈粉末后加入1 mL的质膜提取液(0.25 mol/L山梨醇，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L MgSO₄，10 mmol/L Tris-HCl pH7.4)；匀浆液以9000g， 4℃离心20 min，去除沉淀，上清经30000g，4℃离心1h；收集沉淀并使其悬浮于0.5ml上述提取液中，所得为细胞质膜蛋白；

B、用Brodford法测定质膜蛋白浓度。在800 μL的蒸馏水中加入5 μL的质膜蛋白提取液混匀，然后加入200μL的市购Brodford溶液，在OD595波长下检测蛋白浓度，并计算100 μg质膜蛋白对应的体积；

C、反应体系1.5 ml中含有5 mmol/L BTP/MES (pH 6.0)、12 μmol/L AO、300 mmol/L KCl、250 mmol/L 蔗糖、0.5 mmol/L EGTA（使用BTP调pH至6.0）、1 mmol/L NaN₃、1 mmol/L Na₂MoO₄、50 mmol/L KNO₃ , 0.05%十二烷基聚乙二醇醚（w/v）和100 μg 质膜蛋白；添加去垢剂十二烷基聚乙二醇醚使原位膜翻转，反应混合液在室温下放置20 min后，加入5 mmol/L ATP/BTP (pH 6.0)以启动反应；

D、质子从膜内向外的泵出是根据测定吖啶橙（AO）在492 nm处吸光值淬灭的方法进行；通过此方法验证MgCl₂激活剂使用对美人蕉根中H⁺-泵活性的影响。

图3 显示，A图为未经过MgCl₂处理的对照组，B图为经过MgCl₂处理的实验组。经过MgCl₂处理对美人蕉根部H⁺-泵活性的影响结果表明，采用本发明MgCl₂处理剂处理美人蕉后，美人蕉根部H⁺-泵活性显著高于对照组CK。

 实施例5：采用实施例1处理后的美人蕉验证MgCl₂促进剂对美人蕉硝酸还原酶活性的影响，包括如下步骤：

A、不同浓度硝态氮废水处理后，取不同处理下美人蕉的根、叶组织0.5g，用液氮快速冻存，经液氮研磨呈粉末后加入1.5mL提取液(25 mmol/L磷酸缓冲液pH7.4，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L 半胱氨酸)研磨匀浆，转移至2 mL EP管中， 4000 rpm, 4 ℃，离心15 min，去除沉淀上清即为酶提取液；

B、取0.2 mL酶提取液于2 mL EP管中，加入0.5 mL 0.1 mmol/L KNO₃磷酸缓冲液和0.3 mL NADH溶液，混匀，25℃水浴30 min，水浴结束后加入0.5 mL磺胺终止反应，再加入0.5 mL α-萘胺，混合均匀，显色15 min后用分光光度计于520 nm处进行比色测定，记下OD值，以不加NADH（加入0.2mL水）作为空白对照；

C、根据标准曲线计算反应液中亚硝态氮含量，以每小时每克鲜重产生的亚硝态氮微克数表示硝酸还原酶活性；

图4 显示，A图为MgCl₂处理前后美人蕉根中硝酸还原酶活性变化，其中未经MgCl₂处理的美人蕉为对照组，用CK表示，经过MgCl₂处理的美人蕉为试验组；B图为MgCl₂处理前后美人蕉叶中硝酸还原酶活性变化，其中未经MgCl₂处理的美人蕉为对照组，用CK表示，经过MgCl₂处理的美人蕉为试验组。MgCl₂处理对美人蕉硝酸还原酶活性的影响结果表明，采用本发明MgCl₂处理剂处理美人蕉后，美人蕉根、叶中硝酸还原酶的活性显著高于对照组CK。

 实施例6：采用实施例1处理后的美人蕉验证MgCl₂促进剂对美人蕉谷氨酰胺合成酶活性的影响，包括如下步骤：

A、不同浓度硝态氮废水处理后，取不同处理下美人蕉的根、叶组织0.5g，用液氮快速冻存，经液氮研磨呈粉末后加入1.5 mL提取液研磨匀浆，将其转移至离心管中4500 rpm/min，4 ℃离心10 min ，弃沉淀，取上清液再次4500 rpm离心10 min，沉淀为叶绿体部分，取上清液在4 ℃下12000rpm离心20 min，沉淀为线粒体部分，上清即为粗酶液；

B、用Brodford法测定粗液蛋白浓度，在800 μL的蒸馏水中加入5 μL的GS蛋白粗酶液混匀，然后加入200μL的市购Brodford溶液，在OD595波长下检测蛋白浓度，并计算0.7 mL粗酶液可溶性蛋白含量；

C、取0.7 mL粗酶提取液和0.7 mL ATP(40 mmol/L)溶液加入1.6 mL反应液B中（80 mmol/L盐酸羟胺，80 mmol/L MgSO₄，20 mmol/L 谷氨酸钠，20 mmol/L 半胱氨酸，2 mmol/L EGTA，0.1 mol/L Tris-HCl pH7.4），颠倒混匀，37 ℃静置30 min，加入1ml显色剂（0.2 mol/L TCA、0.37 mol/L FeCl₃和0.6 mol/L HCl 混合液），颠倒混匀，5000 rpm离心10 min，取上清在540nm处读取吸光度。以不加粗酶提取液加入0.7mL反应液A（80 mmol/L MgSO₄，20 mmol/L 谷氨酸钠，20 mmol/L 半胱氨酸，2 mmol/L EGTA，0.1 mol/L Tris-HCl pH7.4 ）作为空白对照；

D、GS活力(A/mg protein·h)= OD540nm/（可溶性蛋白含量×0.5）计算出酶活；通过此方法验证MgCl₂促进剂对美人蕉各组织谷氨酰胺合成酶活性的影响。

图5显示， A图为MgCl₂处理前后美人蕉根中谷氨酰胺合成酶活性变化，其中未经MgCl₂处理的美人蕉为对照组，用CK表示，经过MgCl₂处理的美人蕉为试验组；B图为MgCl₂处理前后美人蕉叶中谷氨酰胺合成酶活性变化，其中未经MgCl₂处理的美人蕉为对照组，用CK表示，经过MgCl₂处理的美人蕉为试验组。MgCl₂处理对美人蕉谷氨酰胺合成酶活性的影响结果表明，采用本发明MgCl₂处理剂处理美人蕉后，美人蕉根和叶中谷氨酰胺合成酶的活性显著高于对照组CK。

 实施例7：促进美人蕉硝态氮吸收同化的MgCl₂促进剂的应用，包括如下步骤：

（1）配制物质的量浓度为130μmol/L的MgCl₂溶液；

（2）选择湿地土壤中株高30-40cm的美人蕉幼苗挖出，放在自来水中培养，每隔两天换一次水，培养30天左右至新根长成用于本实验；

（3）将（2）中美人蕉置于上述步骤（1）MgCl₂溶液中，对美人蕉根进行6h预处理；然后将处理过的植物转移到体积为3L含有不同硝态氮浓度的农田废水中；同时以未经过氯化镁预处理的美人蕉为对照（CK），也放在体积为3L含有不同硝态氮浓度的农田废水中；测定MgCl₂促进剂对美人蕉吸收硝酸盐速率，方法同实施例2。

图6显示，A图为未经过MgCl₂处理的对照组，B图为经过MgCl₂处理的实验组。MgCl₂处理对美人蕉吸收硝酸盐速率的影响结果表明，采用本发明MgCl₂处理剂处理美人蕉后，美人蕉苗对硝酸盐的吸收速率高于对照组CK。

实施例8：促进美人蕉硝态氮吸收同化的MgCl₂促进剂的应用，包括如下步骤：

（1）配制物质的量浓度为180μmol/L的MgCl₂溶液；

（2）选择湿地土壤中株高30-40cm的美人蕉幼苗挖出，放在自来水中培养，每隔两天换一次水，培养30天左右至新根长成用于本实验；

（3）将（2）中美人蕉置于上述步骤（1）MgCl₂溶液中，对美人蕉根进行7h预处理；然后将处理过的植物转移到体积为3L含有不同硝态氮浓度的农田废水中；同时以未经过氯化镁预处理的美人蕉为对照（CK），也放在体积为3L含有不同硝态氮浓度的农田废水中；测定MgCl₂促进剂对美人蕉吸收硝酸盐速率，方法同实施例2。

图7显示，A图为未经过MgCl₂处理的对照组，B图为经过MgCl₂处理的实验组。MgCl₂处理对美人蕉吸收硝酸盐速率的影响结果表明，采用本发明MgCl₂处理剂处理美人蕉后，美人蕉苗对硝酸盐的吸收速率高于对照组CK。

Claims (1)

1.MgCl₂作为植物硝态氮吸收促进剂的应用，其特征在于：采用物质的量浓度为130-180μmol/L的MgCl₂溶液对植物进行处理6-8h，随后将植物放在含硝态氮的农田废水中，检测废水中硝态氮浓度及植物的生长指标。