CN1036305A - 果实特异性转录因子 - Google Patents

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Abstract

使用CDNA筛选法鉴定了果实特异性调节 区。操作所得的果实特异性调节区用以将外来顺序 列入植物细胞内，以提供改变了果实表现型性质的转 化的植物，作为本发明具体例证是在果实成熟的整个 阶段都是有活性的番茄果实特异性启动子。

Description

本申请是1988年3月15日提交的168190号申请的后续部分，后者又是1987年5月26日提交的054369号申请的后续部分，这些申请均列为本文的参考文献。
本发明涉及能够在体外构建并能在植物体内指导果实特异性表达的DNA表达暗盒（DNA    expression    cassettes），本发明将通过在蕃茄中用于果实特异性转录的启动子为例说明。
已经证明，植物的遗传操作要比原核生物及哺乳动物宿主的遗传操作困难得多，而且我们对植物细胞和植物的生物化学及细胞生物学的了解要比对原核生物和哺乳动物细胞了解少得多。转化植物细胞并再生植物的能力是植物群所独具的，因此其他已分化的植物品种即可很容易地得到可转化的胚细胞，后者则可受精并被引入活的宿主内发育成成熟胚胎。已对使用可诱导的转录起始区修饰卵子、以使引入卵内的基因进行可诱导的转录和表达，而不是结构表达（其可导致整个成熟胚的表达）的方法产生了很大兴趣。
另外，对于植物来说，常常期望能够在植物或某特殊部分的特定生长阶段中控制表达过程。在植物生长的不同阶段，以及就植物的各个部分而言，则常常期望能够控制已被引入完整植物或其特定部分的构建物，和/或在植物细胞分化的特定阶段引入的构建物的功能。为此目的，需使用能在适当类型细胞中和/或在植物发育的适当时间提供预期之转录起始的调节顺序，同时对植物发育和繁殖又不会造成严重的有害影响。
因此，重要的是能够分离出可经受操作以便在植物生长周期内于植物细胞宿主中提供预期之转录调节的顺序。其中的一个方面就是使植物获得改变果实之表现型的能力，以提供具有改善了储存、加工、烹调、感官性质、冷冻、营养价值等特征的果实。
已分离并鉴定了在果实发育期间表现差别表达的蕃茄cDNA克隆（Mansson等，Mol.Gen.Genet.（1985）200∶356-361;Slater等，Plant Mol.Biol.（1985）5∶137-147）。研究的重点主要集中于果实成熟期间所积聚的mRNA上。已将一种由成熟特异性CDNA编码的蛋白质鉴定为多聚半乳糖醛酸酶（Slater等，Plant Mol.Biol.（1985）5∶137-147），并已测定了编码蕃茄多聚半乳糖醛酸酶之cDNA克隆的核苷酸顺序（Grierson等，Nucleic Acids Research（1986）14∶8395-8603）。在果实发育的未成熟绿色阶段至赤熟阶段，多聚半乳糖醛酸酶mRNA的浓度增加达200倍。这一点揭示酶的表达是受特异性mRNA浓度调节的，而后者本身又是受转录作用的增强控制的（Della Penna等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1986）83∶6420-6424）。在果实发育的后期，pSbA（光***Ⅱ的一个组分）的成熟质粒mRNA达到其最高水平，而在成熟过程开始后，有色体中光***Ⅰ和Ⅱ的其他组成的质粒mRNA则下降低到测不出的水平（Piechulla等，Plant Mol.Biol.（1986）7∶367-376）。其他研究集中于处在可诱导之调节下的cDNA编码基因，如蕃茄对创伤反应中所表达的蛋白酶抑制物（Graham等，J.Biol.Chem.（1985）260∶6555-6560;Graham等，J.Biol.Chem.（1985）260∶6561-6564）以及与创伤后果实和叶子成熟中乙烯合成酶有关的mRNA（Smith等，Planta（1986）168∶94-100）。
McCormick等人（Plant    Cell    Reports（1986）5∶81-89）描述了培养之蕃茄的叶盘转化作用（Leaf    disc    transformation）。
使用与有用DNA顺序及转录终止区相连接的“果实特异性启动子”、特别是在开花期开始时或开花期后短时间内或变异期开始时具有活性的“果实特异性启动子”，以制备新的DNA构建物。可将DNA构建物引入植物细胞，以使之整合到基因组中并在开花期或开花期后启动可调节的转录过程。以这种方式，可在果实形成和/或成熟期间获得高水平的RNA，并在适当情况下产生相应的多肽。
图1显示了cDNA克隆pCGN 1299（2A11）和pCGN 1298（3H11）的核苷酸顺序。同时示出了由开放读码编码的氨基酸顺序。
图2是2A11与豌豆储存蛋白及其他丰富储存蛋白的比较：
（a）是2A11（残基33-46）与pA1b及某些蛋白酶抑制物PA1b（残基6-23）、鹰豌豆抑制物（残基11-23）利马豆抑制物（残基23-35）、人α1抗胰蛋白酶反应性部位肽的比较。箭头指出了反应性位点。
（b）是2A11的氨基末端与某些种子蛋白质之氨基末端顺序的比较。其中对数据作了修改或删除，以达到最大程度的相符;保留的残基示于方框中。这些顺序分别来源于：PA1b;大麦氯仿/甲醇可溶性蛋白d、小麦白蛋白、小麦α淀粉酶抑制物0.28、小米双功能抑制物、蓖麻籽2S小亚基以及napin小亚基。
图3是构建二元质粒pCGN783的程序图，（a）到（f）参见实施例6.1中所述的质粒结构。
图4显示克隆到pCGN    1273中之2A11基因组DNA的完整顺序，从XhoⅠ位点（5′端位置1）到EcoRⅠ位点（位置4654）。
图5显示多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因组克隆的核苷酸顺序。
根据本发明的目的，其提供了能在果实成熟和熟化期间改变植物表现型的DNA构建物。该DNA构建物包含一与果实发育和成熟相关的转录起始调节区。接在其下游并处于果实相关起始区之转录起始调节之下的是目的基因顺序，其可用于改变果实的表现型。可望制得整合构建物，以便将转录暗盒整合到植物宿主的基因组中。为方便起见，所用载体可在果实相关转录起始区的下游包含一多克隆位点，从而可依某种有效方式将该整合构建物用于多种不同的顺序。
特别有用的是可在开花期或稍后激活转录起始区，从而可在果实发育的早期即使目的顺序得到预期水平的转录。正常情况下，目的顺序将参予影响果实的早期形成过程，或在果实生长（膨大）期间或收获时及收获后使之获得期望的特性。
蕃茄的成熟期可分为成熟绿、变异、转变、粉红、浅红及红色阶段。期望转录起始区在绿色果实膨大和成熟阶段，以至在成熟和红色果实期一直保持其活性。其他水果的相应发育期称为成熟期。本发明不仅限于在开花期或刚过开花期时被激活的转录起始区，而且包括在果实成熟的任何阶段被激活的转录起始区。
转录起始区可以是宿主本身固有的或与之同源的、或外来的或与宿主异源的。所谓外来的是指在野生型宿主中找不到的由人工引入其中的转录起始区。其中特别有意义的是称为2A11的蕃茄果实特异性转录起始区，其可调节实验部分所述之2A11cDNA顺序的表达。2A11转录起始区提供了充分的信息，其可在开花期或开花期稍后被激活，且其活性可保持到红果期。被表达的蛋白质是在硫含量及大小上与其他植物储存蛋白相似的富含硫蛋白质。另外特别提到的是调节多聚半乳糖醛酸酶（一种在果实成熟期起重要作用的酶）的转录起始区。多聚半乳糖醛酸酶启动子至少可在变异至红果阶段是有活性的。
其他果实特异性启动子可以在开花期以后，如绿色果实阶段或之前或成熟期前（如变异阶段）甚至在进入红色果实阶段时被激活。
转录起始区可用于改变果实的表现型。可根据需要从不同角度改变果实的表现型。这些改变包括对某特定糖之形成的向上或向下调节、特定的糖可以是单糖或多糖、参与调节的酶有多聚半乳糖醛酸酶、果聚糖蔗糖酶、葡聚糖蔗糖酶及转化酶等;促进蕃茄红素的生物合成和细胞激动素及monellin的合成。修饰作用的其他有益特征包括对压力、微生物、除草剂、挤压、机械搅拌等的反应，改变生长调节剂、感官性质等。用于反义或互补顺序转录时，该顺序通常至少为12个、更常见为至少16个核苷酸（nt）。有用的反义顺序包括多聚半乳糖醛酸酶、蔗糖合成酶及转化酶的基因顺序。
转录暗盒在5′-3′转录方向上将包括一个转录和翻译起始区、一个有意义基因及一个同样在植物中有功能活性的转录和翻译终止区。其中亦可能存在一个或多个内含子。DNA顺序可具有编码目的肽（如一种酶）的任何开放读码、或一基因组顺序的互补顺序，其中基因组顺序可以是开放读码、内含子、非编码的前导顺序或任何其他顺序，而互补顺序则可抑制转录、信使RNA加工（如拼接）或翻译过程。有用的DNA顺序可以是合成的、天然得到的或结合这两种途径制成的。可根据有用DNA顺序的性质，合成具有植物优选密码子的顺序。可将在目的植物中以最大量表达蛋白质时出现有最高频率的密码子定为植物的优选密码子。
在制备转录暗盒时，可以操纵各种DNA片段，以便能以适当方向及适当情况下，在特定读码中提供DNA顺序。为此目的，可使用接合物或连接子来连接DNA片段，或者进行其他操作以提供方便的限制性切点、去除多余的DNA、去除限制性切点等。为此可使用体外诱变、引物修复、限制性切断、退火、切除、连接等方法，其中涉及到***、缺失或取代（如转换和颠换）等技术。
所采用的终止区应主要从方便角度考虑，因为终止区似乎是相对可交换的。终止区可以是与转录起始区同源的、亦可以是与目的DNA顺序同源的，或者是其他来源的。方便的终止区可由根瘤土壤杆菌（A·tumefaciens）的Ti质粒中制得，如章鱼碱合成酶和nopaline合成酶终止区。
通过限制性切断、剪除或填充突出部分以得到钝性末端、用连接子连接等方法制得适于结合或连接的片段的互补末端。
为完成上述各步骤，须使用克隆方法以扩增DNA的量并对DNA进行分析，以确保以适当方式工作。可利用多种不同的克隆载体，所说的克隆载体包括一可在大肠杆菌中发挥作用的复制***及一用于选择转化细胞的标志顺序。所用载体有pBR332、pUC系列、M13mp系列及pACYC184等。这样便可将该顺序在适宜的限制性位点处***载体、用所得质粒转化大肠杆菌宿主、在适宜培养基中培养大肠杆菌转化株、收获并溶解细胞以回收质粒。分析包括顺序分析、限制性酶切分析及电泳分析等。对每次操作后所得用于最终构建物的DNA顺序，均可进行限制性切断并与下一次序相连接，而每一个部分构建物又都可以克隆到同一或不同质粒中。
除了转录构建物外，依据将转录构建物引入植物的方法，还需要有其他DNA顺序。例如，当用Ti或Ri质粒转化植物细胞时（如下面所述），至少要将Ti或Ri质粒之T-DNA的左侧边缘区、且通常是左右两侧边缘区作侧接区连接到转录构建物上。有关用T-DNA转化植物细胞的方法已作过广泛研究，并已在下列文献中作过详细描述：欧洲专利申请（EPA）120516号;Hoekema，The Binary Plant Vector System Offsetdrukerij Kanters B.V.，Alblasserdam，1985，第5章;Knauf等，Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium，In∶Moleculer Genetics of the Bacteria-Plant Interaction，Puhler，A.ed.，Springer-Verlag，NY，1983，245页以及An等，EMBO J.（1985）4∶277-284。
另外，为了促使构建物转化到植物基因组中，可将转座子的末端重复顺序作为边缘区与一转座子酶基因相连接。在这种情况下，转座子酶的表达应是可诱导的，致使转录构建物一旦整合到基因组中即可以是相对稳定地整合了的，并可避免跳跃。
通常将转录构建物与适于在植物细胞中进行选择的标志基因相连。常用的标记基因是对杀虫剂特别是抗生素如卡那霉素、G418、博莱霉素、潮霉素、氯霉素等有抗性的。根据所使用的特殊标志，可将转化细胞与缺乏外来特定DNA的细胞区分开。
可使用多种技术将DNA引入植物细胞宿主内。这些技术包括用根瘤土壤杆菌或生根土壤杆菌（A·rhizogenes）作转化剂以Ti-DNA转化、原生质体融合、微量注射、电穿孔等。为了用土壤杆菌转化，可以在大肠杆菌中制备含有与Ti质粒特别是Ti-DNA同源之DNA的质粒。该质粒可以能或不能在土壤杆菌中复制，即是说，其可以有或没有广谱原核生物复制***（如RK290），而出现上述不同的情况将部分地取决于转录构建物是否已整合到Ti质粒中或被留在独立的质粒上。可借助辅助质粒，用转录构建物转化根瘤土壤杆菌并用所得已转化的生物体转化植物细胞。
可将离体植物细胞与根瘤土壤杆菌或生根土壤杆菌一起培养，以使转录构建物转化到植物细胞中，然后将植物细胞分散于适当选择的培养基上进行选择、使之生长成愈创组织、生出枝芽并在生根培养基中由愈创组织再生成植物。土壤杆菌宿主细胞包含一具有Vir基因（其为T-DNA转化到植物细胞中所必需的）的质粒，并且有或没有T-DNA。为进行微量注射和电穿孔，可将失去感染力的Ti质粒（缺少肿瘤基因，特别是没有T-DNA区）引入植物细胞中。
可使用任何一种带果实的植物作为宿主细胞的来源，而其中有用的植物部分则得自于子房壁。这些植物包括真浆果如蕃茄、葡萄、欧洲越桔、蔓越桔、穗醋粟和茄子;坚果（核果）植物如樱桃、李、杏、桃和鳄梨;复合果（小核果）植物如山莓和黑莓。在柑桔类果实（橙子、柠檬）中，可以期望使表达暗盒在果实的“多汁液”部分内表达。在瓠果（如西瓜、棱瓜、密露、黄瓜和南瓜）中表达的相应组织很可能是内部可食部分，而在荚果（如豌豆、绿豆、大豆）中其相应组织则是种子荚。
可用多种方法来鉴定有用的转录起始区。其中果实部分已被分离或刚被分离，其可以部分测定了顺序，从而即可设计一探针来鉴定果实特异性信使RNA（mRNA）。为了进一步提高与果实有特异关联之信使RNA的浓度，可制备cDNA并用信使RNA取代cDNA或由非果实相关细胞制得cDNA。然后用残留的cDNA自植物细胞的适用基因库中探查有互补顺序的基因组。分离与cDNA杂交的顺序、进行基因操作并分离与编码区相联的5′非翻译区，然后将其用于表达构建物以鉴定5′非翻译区的转录活性。某些情况下，可直接使用探针筛选基因组库并鉴定与探针杂交的顺序。可按上述方法操作这些顺序以鉴定5′非翻译区。
例如，可按下述方法鉴定本发明的特别有用的启动子，即由可编码实验部分称为2A11之蛋白质的DNA顺序得到的果实特异性转录起始区（启动子）：使用自成熟果实绿色果实和叶片mRNA制得的cDNA探针筛选自成熟果实得到的cDNA克隆。选择出与叶片cDNA相比可与果实DNA有更强杂交的克隆。重复筛选以鉴定称为2A11的特定cDNA。在凝胶上测定mRNA的大小后，用2A11cDNA筛选根、茎、叶和果实发育七个阶段的RNA。筛选表明在果实发育的所有七个阶段均存在特定信息。在被试的其他组织中则没有与特异cDNA互补的mRNA。然后筛选基因组库并选择与目的cDNA杂交的片段。分离并操作5′和3′非编码区，以使***的外来顺序得以在2A11启动子调节下被转录。
可按照常规方法（如参见McCormicK等，Plant    Cell    Reports（1986）5∶81-84）将已转化的细胞培养成植物。继续培养植物，并用同一转化品系或不同品系传粉，然后鉴定所得具有预期表现型特征的杂种植物。经两次或更多次传代以确保目的表现型特征得以稳定地保留并遗传，然后收获种子用于生产具有新的表现型特性的果实。
提供了一种具有实验部分所述顺序的蛋白质，并定名为2A11。该蛋白质可以是贮存蛋白质并可用于提高食物中含硫氨基酸（半胱氨酸和蛋氨酸）的量。可将开放读码***包含转录起始区的表达暗盒中使之在原核或真核生物（如酵母）中表达，制得基本上纯的蛋白质2A11。各种表达暗盒都可由市场上购得并已在文献中述及（参见美国专利4532207、4546082、4551433及4559302号）。如果产物是细胞内的，则可溶解细胞分离之并经电泳、亲合层析、HPLC等方法纯化之。可得到基本上纯的、无其他植物杂蛋白的产物，一般纯度到少为95%，通常至少99%左右。
下列实施例旨在进一步阐明而不是限定本发明。
实验
实施例1
构建蕃茄成熟果实cDNA库并筛选果实特异性克隆
于温室条件下培养蕃茄植物（Lycopersicon esculentum CV UC 82B）并按Mansson等人（Mol·Gen·Genet·（1985）200∶356-361）所述的方法分离poly（A）+RNA。由所得poly（A）+RNA合成cDNA，将其克隆到质粒pUC9的PstⅠ位点中并转化到大肠杆菌载体内（Mansson等人，Mol·Gen·Genet·（1985）200∶356-361）。
筛选基因组库
与由蕃茄红色果实mRNA、成熟绿色果实mRNA及叶片mRNA制得的放射标记的cDNA进行菌落杂交以筛选两千个重组体克隆。在1.5M NaCl?.5M NaOH中处理固定于Gene Screen Plus滤膜上的细菌菌落使之变性，然后在含0.5M Tris-HCl（pH8）的1.5M NaCl中中和并风干。按Maniatis等人（Molecular Cloning∶A Laboratory Manual（1982）Cold Spring Harbor，New York）所述的方法进行杂交、洗涤及放射自显影。
选择出65个较之叶片cDNA来说与果实cDNA有更强杂交的克隆，为此可见，相对于果实mRNA群体来说，叶片mRNA群体是处于未呈现状态的。使用自选择的克隆纯化的DNA制备复制槽形印迹滤膜并按前述方法与得自叶、绿色果实和红色果实的放射活性标记的cDNA杂交。这样筛选出的cDNA克隆2A11亦称为pCGN1299，其在果实阶段（红色和绿色果实）及落叶时均保有高含量。
实施例2
克隆的分析
合成RNA探针
自pCGN1299上切下一长约600bp（在琼脂糖凝胶测定之）的EcoRⅠ到HindⅢ的cDNA***片段，并再克隆到Riboprobe载体pGEM1（Promega    Biotec）中，得到pCGN488。使用SP6或T7聚合酶由pCGN488***片段的每一股制得32P标记的转录本，然后用其作为探针来分离含叶、成熟绿色和成熟红色果实之mRNA的Northern印迹。自SP6启动子转录的RNA转录本不与蕃茄mRNA杂交。然而，由T7启动子转录的转录本可与一长约700nt之绿色和红色果实的mRNA杂交，但不与蕃茄叶的mRNA杂交。从而确定了相应mRNA的转录方向。
依下述方法证明pCGN1299cDNA的组织特异性。按照Maniatis等人（1982）所述方法在甲醛-琼脂糖凝胶上电泳分析根、茎、叶和果实发育七个阶段（末成熟绿、成熟绿、变异、变色、粉红、淡色和红果阶段）之RNA的大小、固定于硝酸纤维素滤膜上并与32P标记的RNA（其为体外使用T7聚合酶由pCGN488合成的）杂交。除两个泳道（粉红和浅红）含10μg总RNA外，其余各泳道均含有100ng的POlyA+RNA。对根、茎、叶和果实发育各阶段之mRNA的Northern分析表明，从开花后的旱期至果实红熟期的各个阶段均可表达pCGN1299cDNA。在叶、茎或根组织中未见有可与pCGN1299杂交的mRNA。与pCGN488探针杂交之mRNA的大小约为700nt。
比较使用SP6聚合酶由pCGN488体外合成之已知量RNA与Northern印迹分析中得自红色蕃茄果实之mRNA的杂交强度，以测定相应于pCGN1299cDNA的信息量。将使用T4聚合酶体外由pCGN488合成的32P标记的转录本作为探针。与标准品比较，这一Northern分析结果表明，pCGN1299cDNA代表了蕃茄果实内的丰富的mRNA，其约为总信息的1%。
实施例3
测定pCGN1299及pCGN1298cDNA克隆的核苷
酸顺序
DNA顺序分析
由pCGN1299cDNA上删去poly A+顺序。从而即可根据其是否与pCGN488探针杂交，来鉴定一更长的cDNA克隆-pCGN1298。使用Maxam-Gilbert和Sanger的双脱氧法测定两cDNA***片段的完整DNA顺序（如图1所示）。与pCGN1299比较，pCGN1298的顺序中另外含有5′和3′末端顺序。如图1所示，两个克隆这个区域内的核苷酸顺序是完全相同的。
氨基酸顺序
在三个读码中翻译pCGN1299cDNA顺序。其中指出了最长的开放读码（其由第一个ATG开始）。pCGN1299和pCGN1298均有一编码96氨基酸多肽的开放读码（图1）。该蛋白质有一疏水N未端，其可能表明为蛋白质进入靶部位的前导肽。疏水性图形是使用Hopp和Woods（Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1981）78∶3824-3828）计算法计算的。残基10-23具有一极端疏水区。图2中显示了2A11与豌豆贮存蛋白及其他丰富贮存蛋白的比较。近年已述及果实特异性蛋白的富硫组分与豌豆贮存蛋白的相似性（Higgins等人，J.Biol Chem，（1986）261∶11124-11130，参考个别肽）。此可能表明这种见于多种植物的果实特异性蛋白的贮存作用。
实施例4
筛选基因组克隆
Southern杂交
按Maniatis等人（1982）所述的方法完成Southern分析。用EcoRⅠ或HindⅢ消化得自培养株UC82B的蕃茄总RNA，经琼脂糖凝胶电泳分离并转移到硝酸纤维素滤膜上。使用经pCGN488的缺口翻译所产生的32P标记的探针进行Southern杂交（Maniatis等，1982）。单一杂交带表明蕃茄基因组中存在很少甚至只有一个编码pCGN1299cDNA基因的拷贝。
分离基因组克隆
在由蕃茄培养株VFNT-Cherry的DNA构建的Charon35/Sau3A中确立基因组库，并用转录自cDNA克隆pCGN488的〔32p〕-RNA作探针筛选之。分离出一含有约12.5kb之蕃茄基因组顺序的基因组克隆。与pCGN488探针杂交的区域跨越见于cDNA顺序的XbaⅠ限制性位点并包括定名为2A11的转录起始区。
基因组克隆的顺序分析
图4中示出了依Sanger双脱氧法测定的基因组克隆的顺序。该克隆与pCGN1299cDNA克隆所共有的区域具有完全相同的顺序。
再克隆
再克隆围绕XbaⅠ限制性点的区域，即5′方向上长约2.4kb的区域及3′方向上长约2.1kb的区域，以提供一表达暗盒。将来自2A11基因组克隆的5′XhoⅠ至XbaⅠ片段及3′XbaⅠ至EcoRⅠ片段***到pUC衍生的含唯一XhoⅠ位点但不含Xba位点的氯霉素抗性质粒中。该启动子暗盒质粒被定名为pCGN1273。
实施例5
构建果实特异性反义暗盒
反义片段的***
将PG以反义方向***pCGN1273启动子暗盒的唯一XbaⅠ位点，得到用PG反义顺序标记的2A11基因组片段。该***顺序增长了转录本之mRNA的长度，因此该构建物的表达型式与以相似于Eckes等人（Mol.Gen.Genet.（1986）205∶14-22）所述检测块茎特异性马铃薯基因之方法经单一Northern杂交所测得的内源性基因差不多。
实施例6
将带标志的基因组构建物***土壤杆菌二元质粒中
利用侧翼XhoⅠ限制性酶切点切断带标志的基因组构建物并克隆到在其左右边缘区之间含有一植物卡那霉素抗性标志之二元质粒pCGN783的唯一Sa1Ⅰ位点中，得到质粒pCGN    1269。
将大肠杆菌C2110中的这一质粒二元载体接合到含有无攻击性Ti质粒（该质粒能够将多聚半乳糖醛酸酶反义暗盒及卡那霉素抗性标志转移到植物宿主基因组中）的根瘤土壤杆菌中。
其中所使用的土壤杆菌***为根瘤土壤杆菌PC2760（G.Ooms等，Plasmid（1982）7∶15-29;Hoekema等，Nature（1983）303∶179-181;欧州专利申请84-200239.6、2424183）。
1、pCGN    783的构建
pCGN    783为一含有根瘤土壤杆菌章鱼碱Ti质粒pTiA    6（Currier和Nester，J.Bacteriol.（1976）126∶157-165）之左和右T-DNA边缘区、pPH1J1（Hirsch等，Plasmid（1984）12∶139-141）之庆大霉素抗性基因、花菜镶嵌病毒（CaMV）之35S启动子（Gardner等，Nucleic    Acid    Res.（1981）9∶1871-1880）、Tn5（Jorgensen，Mol.Gen.（1979）177∶65）之卡那霉素抗性基因以及pTiA    6（Currier和Nester，上述文献（1976）〕转录本7之3′区的二元质粒。图中给出了构建pCGN783的流程图。下面（a）至（f）详细描述了该质粒的构建程序。
（a）pCGN587的构建
将含有APH3′Ⅱ（Jorgensen等，Mol.Gen.（1979）177∶65）全部结构基因之Tn5的HindⅢ-SmaⅠ片段克隆到pUC8中（Vieira和Messing，Gene（1982）19∶259），因为其中有一个直接相谟赟maⅠ位点的ECoRⅠ位点，所以可将该片段转变为HindⅢ-EcoRⅠ片段。然后将含有APH3′Ⅱ基因之3′部分的PstⅠ-EcoRⅠ片段连同EcoRⅠ-BamHⅠ-Sa2Ⅰ-PstⅠ连接子一起克隆到PUC7的EcoRⅠ位点中（PCGN546W）。因为该构建物并不提供卡那霉素抗性，所以须将APH3′Ⅱ基因的Bg1Ⅰ-PstⅠ片段***到BamHⅠ-PstⅠ位点而得到卡那霉素抗性（pCGN546X）。这一程序重新装配了APH3′Ⅱ基因，从而使EcoRⅠ位点侧接到基因上。一ATG密码子位于接有APH3′Ⅱ之ATG起始密码子的读码下游和外面。将APH3′Ⅱ之5′末端的Sau3A-PstⅠ片段（该片段没有多余的ATG）***PCGN546W的BamHⅠ-PstⅠ位点中以去掉不需要的ATG，得到质粒pCGN550。然后将含有APH3′Ⅱ基因之pCGN550的EcoRⅠ片段克隆到pUC8-pUC13（K.Buckley，上述文献（1985））的EcoRⅠ位点中，得到pCGN551。
再将各含APH3′Ⅱ基因的EcoRⅠ片段克隆到pCGN451（其含有章鱼碱合成酶的表达暗盒）的唯一EcoRⅠ位点中，得到pCGN548（2ATG）和pCGN552（1ATG）。用EcoRⅠ消化在适当方向上含OCS    5′和OCS    3′的质粒pCGN451并将来自含完整卡那霉素抗性基因之pCGN551的EcoRⅠ片段***EcoRⅠ位点，得到在适当方向上含卡那霉素抗性基因的pCGN552。该OCS/KAN基因为转换型二元载体pCGN587提供了可选择的标志。
工程化章鱼碱合成酶启动子暗盒的5′部分由来自bp15208-13644处（Barker等，上述文献（1983））XhoⅠ位点的PTiA6    DNA组成，其还含有交织在T-DNA转移部分中的T-DNA边缘顺序（边缘区）。在质粒pCGN587中，来自pCGN552的OSC/KAN基因提供了一个可选择的标志及右侧边缘区。首先将左侧边缘区作为HindⅢ-SmaⅠ片段（pCGN502）（碱基对602-2212）克隆到M13mp9中，再作为KpnⅠ-EcoRⅠ片段克隆到pCGN565中，得到pCGN580。pCGN565是一基于pUC8-Cm但含有pUC18连接子的克隆载体。用BamHⅠ将pCGN580切成线形并用以置换pVCK102（Knauf和Nester，plasmid（1982）8∶45）的较小的Bg1Ⅰ片段，产生pCGN585。用来自含OCS/KAN基因之pCGN552的XhoⅠ片段置换pCGN585的较小的Sa1Ⅰ片段，得到pCGN587。
（b）pCNG739（二元载体）的构建
为了得到庆大霉素抗性标志，自pPHIJI（Hirsch等，Plasmid（1984）12∶139-141）的3.1kb    EcoRⅠ-PstⅠ片段中分离出抗性基因并克隆到pUC9（Vieira等，Gene（1982）19∶259-268）中，得到pCGN549。
用含有庆大霉素抗性基因的pCGN549HindⅢ-BamHⅠ片段置换pCGN587（用于构建，见6.1（a），上述文献）的HindⅢ-Bg1Ⅱ片段，产生pCGN594。
用pUC18（Yanisch-Perron，Gene（1985）33∶103-119）的HindⅢ-BamHⅠ多聚连接子区置换含有OCS-卡那霉素-OCS片段的pCGN594HindⅢ-BamHⅠ区，制得pCGN739。
（c）726c（1ATG-卡那霉素-3′区）的构建
将含有pUC18（Yanisch-Perron，文献同上）之EcoRⅠ-HindⅢ连接子的pCGN566***到pUC13-Cm（K.Buckley，Ph.D.Thesis，University    of    California，San    Diego，1985）的EcoRⅠ-HindⅢ位点。将含有ORF1和2（Barker等，Plant    Mol.Biol（1984）2∶335-350）之pNW31c-8，29-1（Thomashow等，Cell（1980）19∶729）的HindⅢ-Bg1Ⅰ片段再克隆到pCGN566的HindⅢ-BamHⅠ位点中，产生pCGN703。
将含有得自pTiA6的转录本7之3′区（相当于PTi    15955的碱基2396-2920）〔Baker等人，上述文献（1984）〕的pCGN703的Sau3A片段再克隆到pUC18〔Yanisch-Perron等人，上述文献，（1985）〕的BamHⅠ位点中，得到pCGN709。
用得自pCGN587（见6.1（a），上述文献）的EcoRⅠ-SmaⅠ片段〔其含有卡那霉素抗性基因（APH3′Ⅱ）〕置换pCGN709的EcoRⅠ-SmaⅠ多聚连接子区，产生pCGN726。
pCGN726的EcoRⅠ-SalⅠ片段加上pUC8-pUC13-cm（氯霉素抗性质粒，K.Buckley，Ph，D.Thesis，University    of    California，San    Diego，1985）的BglⅡ-SalⅠ位点得到pCGN738。为了构建pCGN734，M13mp19（Norrander等，Gene（1983）26∶101-106）的HindⅢ-SphⅠ位点，使用相当于碱基3287-3000的寡核苷酸由该模板引发DNA合成。用S1处理及HindⅢ消化后，将所得片段克隆到pUC19〔Yanisch-Perron等，上述文献（1985）〕的HindⅢ-SmaⅠ位点中。将所得pTiA6的EcoRⅠ-HindⅢ片段（相当于碱基3390-4494）克隆到pUC8的EcoRⅠ位点中（Vieira    and    Messing，上述文献（1982）），得到pCGN734。由pCGN738上删除900bpEcoRⅠ-EcoRⅠ片段，得到pCGN726c。
（d）pCGN167的构建
pCGN167为一含有全长度CaMV启动子、1ATG-卡那霉素基因、3′末端及细菌Tn903型卡那霉素基因的构建物。MI为得自pCGN550（见pCGN587的构建）的EcoRⅠ片段，并被克隆到接近于M13mp9多聚连接子区之1ATG-卡那霉素基因内的EcoRⅠ克隆位点中（见1986年10月17日提交的共同待批专利申请920579号，该申请列为本文参考文献）。
为了构建pCGN167，经用AluⅠ消化得到CaMV的AluⅠ片段（bp7144-7735）（Cardner等，Nucl.Acids    Res·（1981）9∶2871-2888），将其克隆到M13mp7（Vieira，Gene（1982）19∶259）的HincⅡ位点中，产生C614。用EcoRⅠ消化C614，自含有35S启动子的C614产生EcoRⅠ片段，将其克隆到pUC8（Vieira等，Gene（1982）19∶259）的EcoRⅠ位点得到pCGN146。为了修剪启动子区，用Bg1Ⅱ和Bal31处理Bg1Ⅱ位点（bp7670），然后将-Bg1Ⅱ连接子接到Ba131处理过的DNA上，产生pCGN147。
用Bg1Ⅱ消化pCGN528（见下述）并***一得自pCGN147的BamHⅠ-Bg1Ⅱ启动子片段，制得含有启动子区、可选择标志（带有2个ATG的卡那霉素抗性基因）及3′区的pCGN148a。将该片段克隆到pCGN528的Bg1Ⅱ位点，从而使Bg1Ⅱ位点接近于克隆到pCGN528的卡那霉素基因。
按下述方法制备用于这一构建物的穿梭载体pCGN528。用HindⅢ-BamHⅠ消化含有Tn5的质粒（其中包含有卡那霉素基因）（Jorgenson等，Mol.Gen.（1979）177∶65）并将含有卡那霉素基因的HindⅢ-BamH    Ⅰ片段***pACYC184（Chang和Cohen，J·Bacteriol·（1978）134∶1141-1156）之四环基因内的HindⅢ-BamHI位点中，制得pCGN525。将pTiA6的BamHI片段19（Thomashow等，Cell（1980）19∶729-739）***pCGN525的BamHI位点，制得pCGN526。由XhoI消化pCGN526并再连接以删除小的XhoI片段，从而得到pCGN528。
将得自pMB    9    KanXXI的BamHI卡那霉素基因片段克隆到pCGN148a的BamHI位点，制得pCGN149a。
pMB    9    KanXXI为pUC4K变体（Vieira    and    Messing，Gene（1982）19∶259-268），其缺失XhoI位点，但含有来自Tn903的功能性卡那霉素基因，故可在土壤杆菌中有效地选择之。
用Bg1Ⅱ和SphI消化pCGN149a。用BamHI和Sph    I消化MI（见下述）并分离BamHI-Sph    I片段，再用该片段置换pCGN149a的小的Bg1Ⅱ-SphⅠ片段即得到pCGN167。
（e）pCGN766c（35S启动子-3′区）的构建
将含有CaMV-35S启动子、1ATG-卡那霉素基因和PTiA6之BamHI片段的pCGN167的HindⅢ-BamHI片段克隆到pUC19〔Norrander等，上述文献（1985）;Yanisch-Perron等，上述文献（1985）〕的BamHI-HindⅢ位点中产生pCGN976。
将pCGN976的0.7kb    HindⅢ-EcoRI片段（35S启动子）和pCGN709的0.5kb    EcoRI-Sa1I片段（用于构建的转录本7∶3′，见上述文献）***到pCGN566的HindⅢ-Sa1I位点中，以由转录本7展开35S启动子和3′区得到pCGN766c。
（f）最后构建pCGN783
将pCGN766的0.7kb    HindⅢ-EcoRI片段（CaMV-35S启动子）连接到pCGN726c的1.5kb    EcoRI-Sa1I片段（1-ATG-KAN-3′区）上，然后将连接物克隆到pUC119（J.Vieira，Rutgers    University，New    Jersey）的HindⅢ-Sa1I位点中，产生pCGN778。用pCGN778的2.2kb区，即含有CaMV35S启动子的HindⅢ-SalI片段（1-ATG-KAN-3′区）取代pCGN739的HindⅢ-SalI多聚连接子区，产生pCGN783。
实施例7
通过共培养将基因组构建转移到蕃茄中
由已在含Murashige-SKoog盐培养基和0.8%琼脂（PH6.0）的100×25mm培养皿中于24℃经16小时/8小时日/夜循环培养的籽苗得到基本上无菌的蕃茄子叶组织。可以使用任何蕃茄品种，但这里使用的是得自加洲大学蔬菜作物系（Department of Vegetable Crops，University of California，Davis，CA 95616）的近交品系UC82B。将子叶切成三片，中间一片放在滋养皿上预保温24小时。滋养皿的制备是将0.5ml烟草悬浮液培养物（106细胞/ml）用吸管吸移到含有Murashige基本有机培养基（K.C.Biologicals）2，4-D（0.1mg/L）、激动素（1mg/L）、硫胺素（0.9mg/L）和磷酸氢钾（200mg/L，PH5.5）的0.8%琼脂培养基上。于使用前两天制备滋养皿。悬浮细胞生长两天后，将一含滋养培养基的无菌的3mm直径的滤纸片放在烟草细胞的顶上。
预保温期之后，将子叶的中间三分之一部分置于根瘤土壤杆菌菌株之液体MG/L培养基（1-5ml）中。通过接合或转化作用将二元质粒pCGN1269转化到根瘤土壤杆菌菌株2760中，并根据质粒pCGN1269编码的庆大霉素抗性来选择转化株。子叶切片在滋养皿上与细菌共培养48小时，然后转移到含有500mg/L羧苄青霉素和100mg/L卡那霉素的再生培养基中。再生培养基为加有玉米素（2mg/L）、肌醇（100mg/L）、蔗糖（20g/L）、Nitsch维生素并含0.8%琼脂（PH6.0）的K.C.Biologicals    Murashige-Skoog盐培养基。2-3周内即观察到嫩芽长出。当幼苗发育到约1.25cm长时，将其切下并移入含羧苄青霉素（50mg/L）和卡那霉素（50mg/L）的Murashige-SKoog培养基中。于10-12天内生根。
检测于含有卡那霉素之培养基中发育并生根的幼苗的APH3′Ⅱ酶活性。
对假定已转化的蕃茄植物和幼苗作氨基糖苷磷酸转移酶（APH3′Ⅱ）活性分析。APH3′Ⅱ可提供抗卡那霉素和新霉素的抗性。可使用电泳法将APH3′Ⅱ与其他干扰蛋白质分离开并根据卡那霉素的原位磷酸化作用来检测其酶学活性，从而分析了该酶活性（Reiss等，Gene（1984）30∶211-218）。用卡那霉素和〔r-32p〕ATP作为底物并包埋于琼脂糖凝胶内，然后将该凝胶铺敷于含蛋白质之聚丙烯酰胺凝胶的顶上。酶促反应完成后，将磷酸化了的卡那霉素转移到P-81磷酸纤维素离子交换滤纸上，并经放射自显影后观测放射标记的卡那霉素。对Reiss等人方法的改进在于最后用0.1mg/ml蛋白酶K淋洗P-81离子交换滤纸。
实施例8
在二元载体中构建带标志的2A11质粒
将2A11基因组DNA的完整顺序克隆到pCGN1273的Xho    I位点（5′未端位置1）至EcoRI位点（位置4654）中（图4）。由pCGN1273删去从EcoR    V位点至BamH    I位点的质粒多聚连接子部分以构建pCGN1267。将两DNA顺序在唯一的XbaI位点（位置2494）***pCGN1273中。该位点在poly    A位点的前面，2A11基因组克隆的3′非编码区内。
用得自蕃茄多聚半乳糖醛酸酶（PG）cDNA克隆，F1（Sheehy等，Mol.Gen.Genet（1987）208∶30-36）的360bp片段（碱基1至360）在唯一的Xba I限制性酶切点处标记pCGN1273。以反义方向***标志得到质粒pCGN1271，以有意义方向***标志则产生质粒pCGN1270。在唯一的Bg1Ⅱ限制性酶切点将各质粒切成线形并在唯一的BamH I限制性酶切点处将其***二元载体pCGN783中。
同时用得自PG基因组克隆、跨越外显子/内含子接合点之5′端的0.5kb片段（碱基1626至2115）标记pCGN1273（见图5）。将该片段克隆到Xba    I位点中，得到质粒pCGN1215。在唯一的Bg1Ⅱ位点处将pCGN1215切成线形并在BamH    I位点处克隆到pCGN783中，得到两个质粒，pCGN1219和pCGN1220，它们的区别仅仅是pCGN1215在pCGN783内的定向不同。
将三个DNA顺序在唯一的Cla I位点（位置2402，2406）处***pCGN1267中。这些位点在2A11基因组克隆的3′非编码区，离终止密码子21bp处。用Klenow片段充填Xba I和Cla I末端并进行平端连接后，将PGcDNA克隆的383bpXba I片段克隆到pCGN1267的Cla I位点中。如片段以有意义方向***即产生质粒pCGN1263，以反义方向***则得到质粒pCGN1262。在唯一的Bg1Ⅱ位点切断pCGN1263使成线形并在BamHI位点克隆到pCGN783中，由此得到pCGN1260。同时在Bg1Ⅱ位点将pCGN1262切成线形并在BamH I位点处克隆到pCGN783中，得到两个质粒pCGN1255和pCGN1258，它们差异只在于pCGN1262在二元载体pCGN783中的定向不同。
将跨越外显子/内含子接合处的PG基因组克隆的0.5kb片段（文献同上）在ClaⅠ位点以反义方向克隆到pCGN1267中，产生质粒pCGN1225。在Bg1Ⅱ限制性酶切点将该质粒切成线形并在BamH    I位点克隆到pCGN783中得到两个质粒pCGN1227和pCGN1228，它们的差异仅在于pCGN1225在二元载体中的定向不同。
将得自根瘤土壤杆菌章鱼碱质粒pTiA6（Knauf    and    Nester，Plasmid（1982）8∶45-54）的Eco7片段（碱基5545至12，823）（Barker等，Plant    Mol    Biol.（1983）2∶335-350）再克隆到pUC19中的EcoRI位点，得到质粒pCGN71。用RsaI消化Eco    7片段之碱基8487至9036的DNA，使之得以克隆到载体m13Blue-Script    Minus（Stratagene    Inc.）的SmaI位点中，得到质粒pCGN1278。该片段含有定名为tmr的基因部位的编码区，其可编码二甲烯丙基转异酶（异戊烯基转移酶）（Akiyoshi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1984）81∶5994-5998;Barry等，文献同上（1984）81∶4776-4780）。经用绿豆核酸外切酶（Promega    Biotech）处理，产生tmr基因之5′末端到起始密码子之39碱基5′处缺失的片段。将来自pCGN1272的tmr基因再克隆到pCGN1267的ClaI位点中。tmr基因以有意义方向***即得到质粒pCGN1261，以反义方向***则得到质粒pCGN1266。在Bg1Ⅱ位点处将pCGN1261切成线形并克隆到pCGN783的BamHI位点中，得到质粒pCGN1254。同时在Bg1Ⅱ位点处将pCGN1266切成线形并再克隆到pCGN783的BamHI位点中，产生两个质粒，即pCGN1264和pCGN1265，两者差异只是pCGN1266在pCGN783中***的定向不同。
在转移基因植物中表达的分析
由已被含有pCGN1264之无感染性土壤杆菌菌株转化了的两株蕃茄植物变种UC82B中收获未成熟绿色果实（长度约3.2cm）转移基因的植物被定名为1264-1和1264-11。自每株植物的各两只果实中剥离果皮，于液氮下研磨成粉末，从中提取总RNA并分离Poly A+ mRNA（Mansson等，Mol.Gen.Genet.（1985）200∶356-361）。同时由每株植物上采集绿色嫩叶并分离出Poly A+ mRNA。
分别将被转化植物1264-1和1264-11的果实总RNA（19μg）、果实PolyA+ mRNA（70ng）和叶PolyA+ mRNA（70ng）加到0.7%琼脂糖甲醛Northern凝胶上跑电泳，然后吸印到硝酸纤维素滤膜上（Maniatis等，Molecular Cloning∶A Laboratory Manual（1982）Cold Spring Harbor，New york）。另外凝胶上还包括作为阴性对照的约50ng未转化UC82B植物的叶PolyA+ mRNA和未成熟绿果PolyA+ mRNA。
为用作阳性对照并帮助定量mRNA水平，用T3聚合酶（Stratagene，Inc.）体外合成了由pCGN1272转录的RNA。将19Pg和1.9Pg这种体外合成的RNA加于Northern凝胶上。
用于Northern滤膜的探针是以琼脂糖凝胶电泳法〔Maniatis上述文献（1982）〕分离并使用α32P dCTP（Amersham）经缺口翻译（Bethesda Research Laboratory药盒）标记的pCGN1272的1.0kb tmr***物DNA（KpnI至SacI片段）。
Northern滤膜在下述溶液中于42℃预杂交5小时：25ml甲酰胺、12.5ml 20XSSC、2.5ml 1M NaP、5ml 50X Denhardts、0.5ml 10%SDS、1ml 250mM EDTA、1ml 10mg/ml ssDNA和2mlH2O。然后加入1/5体积50%葡聚糖硫酸酯和大约2.2×107CPm探针并于42℃杂交15小时。
将Northern滤膜置于2xSSC和0.1%SDS中各洗1次，每次20分钟。将滤膜风干然后使之与柯达XAR胶片及加强膜于-70℃接触2天。
转移基因植物的Northern吸印分析结果
在Northern印迹分析中，果实总RNA和PolyA+ mRNA泳道中观察到与一长约1.7kb之mRNA杂交的缺口tmr探针。这正是所预期从反意义方向重新引入之用tmr基因（1.0kb）标记的2A11基因（0.7kb）的长度。重新引入之标记基因的表达水平要比内源性2A11基因的表达水平稍低些。重新引入之基因在未成熟绿色果实中的表达水平高于在叶组织中的表达水平，同时这些转化体中有小量杂交的叶组织mRNA。
实施例9
自基因组库筛选多聚半乳糖醛酸酶基因组克隆
基因组克隆的分离
在由Lycopersicon esculentum DNA构建的Charon4中建立EcoRI部分基因库，并用得自多聚半乳糖醛酸酶cDNA的探针筛选之（Sheehy等，Mol.Gen.Genet.（1987）208∶30-36）。自基因组库中分离含长约16kb***片段的λ噬菌体克隆，并测定其中长2207bp的内部HindⅢ-EcoRI片段的核苷酸顺序。该HindⅢ-EcoRI片段含有多聚半乳糖醛酸酶启动子区。
基因组克隆的顺序
以Sanger氏双脱氧法测定基因组克隆的DNA顺序（见图5）该基因组顺序中碱基1427至1748同源于多聚半乳糖醛酸酶cDNA顺序。
上述结果证明有可能鉴定植物基因组中的调节顺序，同时可分离并操纵之。这样就可生产转录暗盒和表达暗盒以根据需要来生产不同的细胞产品。从而，不必在所有组织中产生调节产物即可改变特定植物部分的表现型，以避免对植物的生长、健康和生产能力造成不良影响。特别是提供了果实特异性转录起始能力，以改变各种果实的表现型特征，进而改善果实的生产加工、感官性质、储存和产量等有用特性。
本说明书中提到的所有出版物和专利申请均适合于与本发明有关之领域内普通技术人员的知识水平。列入本文参考文献的所有出版物和专利申请均与它们在具体和个别指出的文献中有着同样的内容。
虽然为充分公开起见，已在说明书中通过阐述和实施例较详细地描述了本发明，但显然可以在不违背待批权利要求之范围的前提下作出某些改变和改进。

Claims (10)

1、在转录方向上包括来自于开花期或开花期稍后或变异阶段表达之基因的果实特异性转录起始区，以及转录终止号的DNA构建物，所说的基因至少在成熟期以前一直是可以表达的，其连接到与所说起始区相联的并非野生型顺序的目的DNA顺序上，且其中所说的目的DNA顺序是处于所说之起始区的转录调节之下的。
2、根据权利要求1的DNA构建物，其中所说的转录起始区是2A11区。
3、根据权利要求1的DNA构建物，其中所说的目的DNA顺序是在反义方向上至少有12个nt的多聚半乳糖醛酸醛基因或其片段。
4、适于整合到植物基因组中的DNA顺序，其至少包括与权利要求1的DNA构建物相连的右侧T-DNA边缘区。
5、在转录方向上包括一连接到非野生型顺序上的、在开花期或开花期稍后有活性并至少在成熟期之前仍保留活性之植物贮存蛋白的果实特异性转录起始区以及一转录终止区的DNA构建物，其中所说的DNA顺序包括一适于***处于所说起始区转录调节下之目的顺序的唯一的限制性位点。
6、根据权利要求5的DNA构建物，其中所说的转录起始区是2A11区。
7、特异性修变实质上不同于其他植物组织之果实的表现型的方法，所说的方法包括：
在基因组整合条件下用-DNA构建物转化蕃茄植物细胞，其中所说的DNA构建物在转录方向上包括一与DNA多聚半乳糖醛酸酶基因顺序连接的2A11果实特异性转录起始区，其中所说的顺序是以反义方向定向的并处于所说起始区的转录调节下，从而使所说的DNA构建整合到所说植物细胞的基因组中，使所说的反义顺序被转录并抑制果实中多聚半乳糖醛酸酶的表达;
由所说被转化的植物细胞再生植物，并
培养所说的植物以生产改变了表现型的果实。
8、根据权利要求7的方法，其中所说的转录起始区是2A11区。
9、特异性修变实质上不同于其他植物组织之蕃茄果实的表现型的方法，所说的方法包括：
于基因组整合条件下用-DNA构建物转化植物细胞，其中所说的DNA构建物在转录方向上包括一在开花期或开花期稍后有活性的果实特异性转录起始区以及一转录终止区，所说的基因至少在成熟期以前是保留活性的，其与野生型顺序以外的DNA顺序相连接并能够基于转录修变果实细胞的表现型，其中所说的顺序是处于所说起始区之转录调节下的，从而可使所说的DNA构建物整合到所说植物细胞的基因组中;
由所说已转化的植物细胞再生植物;并
培养所说的植物以生产改变了表现型的果实。
10、包含根据权利要求1之DNA构建物的植物。
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