CN103616520B - 高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒 - Google Patents

高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN103616520B
CN103616520B CN201310645509.7A CN201310645509A CN103616520B CN 103616520 B CN103616520 B CN 103616520B CN 201310645509 A CN201310645509 A CN 201310645509A CN 103616520 B CN103616520 B CN 103616520B
Authority
CN
China
Prior art keywords
food allergen
magnetic bead
food
add
washing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310645509.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103616520A (zh
Inventor
沈晓亮
钱兵
刘意
宋伟杰
方序
叶俊英
董婧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HANGZHOU SAIEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
ZHEJIANG TIANKE HIGH-TECH DEVELOPMENT Co Ltd
Original Assignee
HANGZHOU SAIEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
ZHEJIANG TIANKE HIGH-TECH DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HANGZHOU SAIEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd, ZHEJIANG TIANKE HIGH-TECH DEVELOPMENT Co Ltd filed Critical HANGZHOU SAIEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201310645509.7A priority Critical patent/CN103616520B/zh
Publication of CN103616520A publication Critical patent/CN103616520A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103616520B publication Critical patent/CN103616520B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4716—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒。1）食物过敏原蛋白偶联磁珠，所述的食物过敏原包括但不限于水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白；2）构建标准曲线：梯度稀释抗食物过敏原的IgG抗体标准品与食物过敏原蛋白偶联磁珠进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，根据平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；3）筛查食物过敏原，利用食物过敏原蛋白偶联磁珠与过敏患者的血清进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，然后确定食物过敏原的种类及对应的抗体的浓度。本发明灵敏度范围不高于2pg/mL，可适用于转基因食品的过敏原检测。

Description

高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及食物安全及过敏检测领域，尤其涉及一种高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒。
背景技术
过敏性疾病影响全世界近四分之一的人口，被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。食物过敏医学上也称***反应, 是指机体受抗原(包括半抗原)刺激后, 产生相应的抗体或致敏淋巴细胞, 当再次接触同一种抗原后在体内引起体液或细胞免疫反应, 由此导致组织损伤或机体生理机能障碍。它是一种复发率很高的疾病。据食品过敏或过敏性反应网络统计，约有90％的过敏反应是由花生、果仁、鱼、贝类、鸡蛋、牛奶、大豆、鱼虾、蘑菇和小麦等食物引起（以花生引起的过敏最为严重），10%的过敏是由170多种其他食物引起。根据流行病学调查, 近年来过敏症发病率呈逐年上升的趋势。据调查西方大概有20-25%的人受过过敏原的袭扰，我国大约有5-10%的人受过敏原的袭扰。上海、浙江、广东等沿海地区收过敏原袭扰的人群已超过10%，随着工业的快速发展，生活水平的提高，饮食的改善，受过敏原袭扰的人群每年以1.5%的速度增加。美国每年约有2%~2.5%的人发生食物过敏, 儿童及婴幼儿的发病率约5%~8%。据不完全统计，我国的发病率高于发达国家。目前, 随着科技进步和经济的发展, 产生了诸多新的食品资源, 以及食品生产、流通、消费方式的改变, 传统的食物过敏的地域性打破, 并且随着转基因作物的大量出现，许多新的转基因食品大量涌现，也使得食物过敏更具备了潜在的危险性。食物过敏在相当大的程度上危害着过敏人群的健康, 保护消费者食品安全已经成为食品安全管理部门及食品生产企业所面临的重要问题。
许多人在直接或者间接接触这些过敏原之后，会因过敏而患上支气管哮喘、上呼吸道结膜炎、湿疹、皮炎等症，有时甚至产生危及生命的过敏性休克。因此迫切需要从众多食物中筛查出隐藏的过敏原，让易敏者避开含有致敏成分的食物以及治疗过敏反应，同时排除类似过敏症状慢性疾病的误诊。过敏患者由于摄入引发过敏反应的食物过敏原蛋白后，体内嗜碱粒细胞和肥大细胞脱颗粒化引起特异性的IgG沉淀抗体进入血液，使血液中这种特异性IgG抗体水平提高。该特异性IgG抗体在体外能识别其对应的抗原，即食物过敏原蛋白，并与之结合。
对于过敏原性的检测，体内实验方法可提供最为直接的证据，如双盲食物激发试验和皮肤针刺试验，但由于安全因素等方面的考虑，只有在不得已的情况下在医院进行，而且费用昂贵、风险大；与此相比体外实验方法具有方便、安全的优点，但却存在着准确性差的缺点。随着科技的发展, 未来食品过敏原检测将向准确、安全、经济、快速、高通量、高灵敏度的体外检测技术方向发展。
食物过敏原诊断试剂的种类很多，影响试剂质量的因素也很多，为保证试剂质量需要尽可能的提高技术指标。灵敏度作为一项重要的技术指标，对试剂盒的评价具有重要的意义。因为极少量的分析物可能对界定疾病状态、疾病筛查有重要意义。在食物过敏原检测中体内产生的抗体是十分微量的，而市场上现有技术大多只能达到纳克级，在检测低于此浓度时就变得比较困难，而难以达到预期目的。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒。
一种高灵敏食物过敏原检测方法，步骤如下：
1）食物过敏原蛋白偶联磁珠，所述的食物过敏原包括但不限于水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白；
2）构建标准曲线：梯度稀释抗食物过敏原的IgG抗体标准品与食物过敏原蛋白偶联磁珠进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，根据平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；
3）筛查食物过敏原，利用食物过敏原蛋白偶联磁珠与过敏患者的血清进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，然后根据得到的信号与步骤2）所得的标准曲线确定食物过敏原的种类及对应的抗体的浓度。
所述的信号放大反应为显色反应。
所述的步骤3）中确定食物过敏原的种类的cut-off值设定为抗体浓度1ng/mL的值在标准曲线对应的吸光度值。
所述的步骤1）中，具体方法如下：
1.1） 取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM  pH4.0的磷酸盐缓冲液、1mL 5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和100uL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min；
1.2） 将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；重复洗涤3次，最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；
1.3）再向其中加入5ug/mL的食物过敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白 1uL，把离心管置于摇床上，40℃条件下反应45min；
1.4）重复1.2）的洗涤步骤；
1.5）加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与10uL 1%BSA溶液，4℃条件下封闭保存待用。
所述的步骤3）中，具体方法如下：
3.1） 取若干只2mL的离心管，分别加入300uL偶联食物过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次。最后吸干；
3.2）向洗涤后的磁珠中加入120uL，含20%甘油，梯度稀释的抗体，室温条件下孵育40min；
3.3）孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体；
3.4）向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL 的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL，含20%甘油，室温条件下孵育40min；
3.5）重复步骤3.3）；
3.6）向洗涤后的磁珠中加入100uL的 TMB显色液，避光反应15min；
3.7）避光反应后，向其中加入100uL 1moL/L的盐酸溶液，终止反应，并把液体转移到酶标板上；
3.8）用酶标仪读取吸光度值；
3.9）结果计算。
所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者无基团，粒径大小在100nm~3um。
食物过敏原检测试剂盒，它包括但不限于已包被的水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白中的一种或多种的磁性纳米微球、人IgG标准液、辣根过氧化物酶标记二抗、TMB、样品稀释液、洗涤液和终止液，灵敏度范围不高于2pg/mL。
所述的试剂盒，适用于转基因食品的过敏原检测。
本发明的有益效果：将磁珠作为固相载体，来代替ELISA检测中的酶标板微孔。此固相载体相比于普通ELISA的酶标板微孔拥有更大的表面负载量，并且可以对目标物质具有更强的富集作用，通过外加磁场和洗涤的过程可以对目标物起到一个浓缩的作用，最终提高食物过敏原检测的灵敏度、准确性和线性范围。灵敏度范围不高于2pg/mL，可适用于转基因食品的过敏原检测。
附图说明
图1是实施例四中试剂线性实验的结果示意图；
图2是实施例试剂线性实验的结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
本发明的食物过敏原检测试剂盒，其组成包括已包被的水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白的磁性纳米微球，人IgG标准液、辣根过氧化物酶标记二抗，TMB，样品稀释液，洗涤液和终止液。
1、食物过敏原蛋白偶联磁珠
① 取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM  pH4.0的磷酸盐缓冲液、1mL 5%的磁珠、60uL  50mg/mL的EDAC溶液和100uL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min。
② 将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；如此重复洗涤3次，最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液。
③ 再向其中加入5ug/mL的食物过敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白 1uL，把离心管置于摇床上，40℃条件下反应45min。
④ 重复②的洗涤步骤。
⑤ 加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与10uL 1%BSA溶液，4℃条件下封闭保存。待用。
2、食物过敏原检测试剂盒的使用方法
① 取若干只2mL的离心管，分别加入300uL偶联食物过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次。最后吸干。
② 向洗涤后的磁珠中加入120uL（含20%甘油）梯度稀释的抗体，室温条件下孵育40min。
③ 孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体。
④ 向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL 的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL（含20%甘油），室温条件下孵育40min。
⑤ 重复步骤③。
⑥ 向洗涤后的磁珠中加入100uL的 TMB显色液，避光反应15min。
⑦ 避光反应后，向其中加入100uL 1moL/L的盐酸溶液，终止反应。并把液体转移到酶标板上。
⑧ 用酶标仪读取吸光度值。
⑨ 结果计算
取重复孔平行三次的吸光度平均值；以系列标准溶液的平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；计算样品重复孔的平均吸光度值大于cut-off值（1ng/mL对应的吸光度）的那个吸光度值从标准曲线中计算出食物过敏原抗体的含量，此含量反应了患者的过敏程度。
实施例一
1 对虾过敏原蛋白偶联磁珠
① 取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM  pH4.0的磷酸盐缓冲液、1mL 5%的磁珠、60uL  50mg/mL的EDAC溶液和100uL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min。
② 将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；如此重复洗涤3次，最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液。
③ 再向其中加入5ug/mL的对虾过敏原蛋白500uL（对虾过敏原是一种相对分子质量约36Kd的酸性糖蛋白，属肌肉中的原肌球蛋白。蛋白浓度1.5mg/mL，溶于PBS，效价≥1:1000-5000。），1%牛血清蛋白 1uL，把离心管置于摇床上，40℃条件下反应45min。
④ 重复②的洗涤步骤。
⑤ 加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与10uL 1%BSA溶液，4℃条件下封闭保存。待用。
2 对虾过敏原抗体的检测方法
① 取3只2mL的离心管，分别加入300uL偶联对虾过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次。最后吸干。
② 向洗涤后的磁珠中加入120uL（含20%甘油）的小鼠抗对虾过敏原蛋白单克隆抗体（溶于PBS，pH7.4中，蛋白浓度1mg/mL，含BSA等稳定剂，ELISA(1:500),IHC(1:200),IP(1:50),WB(1:300)。），室温条件下孵育40min。
③ 孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体。
④ 向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL 的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL（含20%甘油），室温条件下孵育40min。
⑤ 重复步骤③。
⑥ 向洗涤后的磁珠中加入100uL的 TMB显色液，避光反应15min。
⑦ 避光反应后，向其中加入100uL 1moL/L的盐酸溶液，终止反应。并把液体转移到酶标板上。
⑧ 用酶标仪读取吸光度值。
⑨ 结果计算
取重复孔平行三次的吸光度平均值；以系列标准溶液的平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；计算样品重复孔的平均吸光度值大于cut-off值（1ng/mL对应的吸光度）的那个吸光度值从标准曲线中计算出对虾过敏原抗体的含量。特异性达91.3%。
实施例二：食物过敏原筛查试验
对35例食物过敏患者抽取血液，将其制备血清，来筛查食物过敏原。检测吸光度值，计算抗体浓度，其中值大于cut-off值（1ng/mL对应的吸光度）的判断为阳性。其检测结果如下表1所示：
表1
检测结果表明，采用本发明的试剂盒可以简便、迅速、灵敏、准确的检测食物过敏原。
实施例三：精密度实验
按上述食物过敏原检测试剂盒的使用方法，在检测范围内取两个不同浓度的样本进行测定，每个样本测定7次，将7次检测结果计算平均值，标准差和变异系数，结果如下表2所示。
表2
实施例四：试剂线性实验
按上述食物过敏原检测试剂盒的使用方法，取5种已知浓度的样本，每个样本测定3次，取平均值，结果如下表3所示。
表3
根据图1可以看出R2=0.9872
实施例五：试剂线性实验
按上述食物过敏原检测试剂盒的使用方法，取5种已知浓度的样本，每个样本测定3次，取平均值，结果如下表4所示。
表4
 根据图2可以看出R2=0.9964
实施例六：准确度验证
按上述食物过敏原检测试剂盒的使用方法，取具有溯源性的标准品，用试剂进行检测，检测7次，计算平均值与靶值进行对照，结果如下表5所示。
表5
 实施例七：灵敏度试验
按上述食物过敏原检测试剂盒的使用方法，测定7种不同抗体浓度的样品，每个样品测7次，通过计算变异系数（CV%），定义开始大于20%的点即为该试剂盒的灵敏度，本发明的检测试剂盒的灵敏度为0.5pg/mL，结果如下表6所示。
表6
实施例八：稳定性试验
在2~8℃贮存条件下，分别在0月，4月，8月，12月和14月对同一浓度的抗体进行测定，每个样本测5次，取均值。结果表明，4月，8月，12月，14月与0月相比，测得的差异很小，说明本发明的检测试剂盒在2~8℃贮存条件下可稳定一年，结果如下表7所示。
表7
试剂开封后，在30天内，30次测定同一浓度的抗体样本的吸光度均值、最大值、最小值、标准差和吸光度变异系数，可见本试剂盒试剂在开封后，可稳定一个月以上，结果如表8所示。
表8
吸光度均值 吸光度最小值 吸光度最大值 吸光度标准差 变异系数CV(%)
0.433 0.421 0.456 4.33 5.0

Claims (4)

1.一种高灵敏食物过敏原检测方法，其特征在于，步骤如下：
1）食物过敏原蛋白偶联磁珠，所述的食物过敏原包括但不限于水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白；
2）构建标准曲线：梯度稀释抗食物过敏原的IgG抗体标准品与食物过敏原蛋白偶联磁珠进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，根据平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；
3）筛查食物过敏原，利用食物过敏原蛋白偶联磁珠与过敏患者的血清进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，然后根据得到的信号与步骤2）所得的标准曲线确定食物过敏原的种类及对应的抗体的浓度；
所述的信号放大反应为显色反应；
所述的步骤3）中确定食物过敏原的种类的cut-off值设定为抗体浓度1ng/mL的值在标准曲线对应的吸光度值；
所述的步骤1）中，具体方法如下：
1.1） 取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM  pH4.0的磷酸盐缓冲液、1mL 5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和100uL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min；
1.2） 将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；重复洗涤3次，最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；
1.3）再向其中加入5ug/mL的食物过敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白 1uL，把离心管置于摇床上，40℃条件下反应45min；
1.4）重复1.2）的洗涤步骤；
1.5）加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与10uL 1%BSA溶液，4℃条件下封闭保存待用；
所述的步骤3）中，具体方法如下：
3.1） 取若干只2mL的离心管，分别加入300uL偶联食物过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次；
最后吸干；
3.2）向洗涤后的磁珠中加入120uL，含20%甘油，梯度稀释的抗体，室温条件下孵育40min；
3.3） 孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体；
3.4）向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL 的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL，含20%甘油，室温条件下孵育40min；
3.5）重复步骤3.3）；
3.6）向洗涤后的磁珠中加入100uL的 TMB显色液，避光反应15min；
3.7）避光反应后，向其中加入100uL 1moL/L的盐酸溶液，终止反应，并把液体转移到酶标板上；
3.8）用酶标仪读取吸光度值；
3.9）结果计算。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者无基团，粒径大小在100nm~3um。
3.一种根据权利要求1所述的方法的食物过敏原检测试剂盒，其特征在于，它包括但不限于已包被的水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白中的一种或多种的磁性纳米微球、人IgG标准液、辣根过氧化物酶标记二抗、TMB、样品稀释液、洗涤液和终止液，灵敏度范围不高于2pg/mL。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，适用于转基因食品的过敏原检测。
CN201310645509.7A 2013-12-05 2013-12-05 高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒 Active CN103616520B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310645509.7A CN103616520B (zh) 2013-12-05 2013-12-05 高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310645509.7A CN103616520B (zh) 2013-12-05 2013-12-05 高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103616520A CN103616520A (zh) 2014-03-05
CN103616520B true CN103616520B (zh) 2015-09-16

Family

ID=50167226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310645509.7A Active CN103616520B (zh) 2013-12-05 2013-12-05 高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103616520B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103901215B (zh) * 2014-04-11 2016-05-11 苏州浩欧博生物医药有限公司 一种食物过敏原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法
CN105785008A (zh) * 2014-12-23 2016-07-20 北京新华联协和药业有限责任公司 一种食物不耐受检测试剂盒及其制备方法
CN104820090A (zh) * 2015-05-13 2015-08-05 杭州傲敏生物科技有限公司 食物过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒及其制备和检测方法
CN112505026A (zh) * 2020-11-23 2021-03-16 深圳大学 一种大豆过敏原可视化凝胶检测装置和方法
CN112710596A (zh) * 2020-11-30 2021-04-27 浙江正熙生物医药有限公司 使用流式细胞仪定性/定量检测目标抗体浓度的方法
CN116242805B (zh) * 2023-02-03 2024-01-23 温州泛波激光有限公司 激光检测方法、激光检测装置和计算机存储介质

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0451800A1 (en) * 1990-04-13 1991-10-16 Abbott Laboratories Binding of allergens to a solid phase
WO1993010458A1 (en) * 1991-11-15 1993-05-27 Abbott Laboratories Binding of milk allergens to a solid phase
CN101696973A (zh) * 2009-10-30 2010-04-21 深圳市博卡生物技术有限公司 一种过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒及其制备方法
CN101865924A (zh) * 2010-06-26 2010-10-20 上海交通大学 基于免疫磁珠联合酶联免疫吸附试验检测伏马毒素的方法
CN102253199A (zh) * 2011-06-14 2011-11-23 浙江大学 检测血清中过敏原特异性抗体的方法
CN102331492A (zh) * 2011-06-14 2012-01-25 浙江大学 一种检测血清中螨虫过敏原特异性抗体的方法
CN103323603A (zh) * 2013-06-07 2013-09-25 博奥生物有限公司 一种在磁珠表面共价偶联蛋白质的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0451800A1 (en) * 1990-04-13 1991-10-16 Abbott Laboratories Binding of allergens to a solid phase
WO1993010458A1 (en) * 1991-11-15 1993-05-27 Abbott Laboratories Binding of milk allergens to a solid phase
CN101696973A (zh) * 2009-10-30 2010-04-21 深圳市博卡生物技术有限公司 一种过敏原特异性IgE抗体免疫分析检测试剂盒及其制备方法
CN101865924A (zh) * 2010-06-26 2010-10-20 上海交通大学 基于免疫磁珠联合酶联免疫吸附试验检测伏马毒素的方法
CN102253199A (zh) * 2011-06-14 2011-11-23 浙江大学 检测血清中过敏原特异性抗体的方法
CN102331492A (zh) * 2011-06-14 2012-01-25 浙江大学 一种检测血清中螨虫过敏原特异性抗体的方法
CN103323603A (zh) * 2013-06-07 2013-09-25 博奥生物有限公司 一种在磁珠表面共价偶联蛋白质的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103616520A (zh) 2014-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103616520B (zh) 高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒
Zheng et al. Rapid detection of fish major allergen parvalbumin using superparamagnetic nanoparticle-based lateral flow immunoassay
Yuan et al. Procalcitonin and C-reactive protein in the diagnosis and prediction of spontaneous bacterial peritonitis associated with chronic severe hepatitis B
Wang et al. Magnetic relaxation switch immunosensor for the rapid detection of the foodborne pathogen Salmonella enterica in milk samples
CN103454412B (zh) 一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方法
CN108254562A (zh) 检测myo的时间分辨荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法
NL2030972B1 (en) Kit for quantitative detection using fluorescent microarray
CN106932589A (zh) 测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒及其制备方法
CN107389919A (zh) 一种免标记荧光适配体传感器及其制备方法和应用
KR20180049602A (ko) 효소 모방 나노자임에 기반한 면역학적 분석에 의한 IgE 검출 및 알러지 진단법
CN103076455A (zh) 快速定量检测血清淀粉样蛋白a试剂盒及其制备和应用
CN107271665A (zh) 一种检测沙丁胺醇的试纸条及其应用
CN104820099B (zh) 一种同时检测血浆中TPSⅡ、SSA、hs‑CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒及其应用
CN101358981A (zh) 检测水产品食物过敏的免疫胶体金层析方法
CN102183666B (zh) 高通量检测血清样本中十二种病原抗体的液相芯片及其制备方法和使用方法
JP3955914B2 (ja) 生体レドックス均衡度の測定による抗酸化能の評価方法
AU2021104369A4 (en) KIT FOR QUANTITATIVELY DETECTING ALLERGEN-SPECIFIC IMMUNOGLOBULIN E (IgE), IMMUNOGLOBULIN G (IgG), OR IMMUNOGLOBULIN A (IgA) USING FLUORESCENT MICROARRAY
CN213689647U (zh) 一种同时检测90项以上食物特异性IgG的试剂盒
CN109254145A (zh) 用于改善新鲜血清和第三方质控之间基质效应的稀释液
CN110117648A (zh) 昼夜节律性睡眠障碍生物标志物
CN101936999B (zh) 检测白果过敏蛋白的双抗体夹心elisa方法
US12000826B2 (en) Methods for testing for food allergies and allergens in foods
CN108646026A (zh) 基于IgG3抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒
CN104330576A (zh) 一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂及其制备方法
CN105606596A (zh) 一种化学发光免疫检测脑型脂肪酸结合蛋白用试剂盒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant