CN103614301A - 产水解酶的黑曲霉及其在制备香菇酶解物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株产水解酶的黑曲霉(Aspergullus niger)MJ及其在制备香菇酶解物中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国,武汉,武汉大学,邮编:430072,保藏编号:CCTCC NO:M2013329,保藏日期:2013年7月11日。本发明的有益效果主要体现在:(1)黑曲霉是食品工业中常用菌种,不产有害物质,使用安全;(2)水解酶的发酵工艺简单,酶的生产成本低;(3)黑曲霉MJ发酵制备的复合水解酶,对香菇中的蛋白质、核酸和多糖的水解效率高;(4)生产工艺不使用有毒有害原料,环保无污染;(5)产品天然绿色,味道鲜美,营养丰富,保健价值高,应用领域广。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株产水解酶的黑曲霉(Aspergullis niger)MJ及其在制备香菇酶解物中的应用。
(二)背景技术
香菇,又名香蕈、香菌、冬菇、厚菇或花菇等,为担子菌纲伞菌目侧耳科香菇属的香蕈(Lentinula edodes)的子实体。香菇是世界第二大食用菌,也是我国特产之一,在民间素有“山珍”之称。香菇肉质肥厚细嫩、味道鲜美、香气沁人、营养丰富,是我国人民餐桌上传统的美味菜肴,具有低脂肪、富含维生素和矿物元素等特点,是一种可增强人体免疫力的健康食品。
香菇不仅是人们理想的美味佳肴,而且具有良好的保健功能和较高的药用价值。经常食用香菇可预防缺乏维生素D而引起的血磷、血钙代谢障碍导致的佝偻病,可预防人体各种粘膜及皮肤炎类疾病。从香菇中提取的多糖,具有健胃保肝、降血糖、降血脂、提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒和抗感染等活性,临床应用于治疗慢性病毒性肝炎和癌症的辅助治疗等,药品有香菇多糖片和胶囊、香菇多糖注射液等。
香菇作为中国传统的食用菌,味道鲜营养高,深受人们喜爱。目前各种香菇深加工产品品种已有很多,如香菇罐头、香菇片、香菇精、香菇饮料和香菇米酒等,这些产品主要针对的是香菇的风味和营养价值,但针对香菇的药用和保健功效,仍有进一步开发的余地,以更好地满足市场的需求。
已有研究表明,香菇酶解物可以提高小鼠的免疫功能,改善肠道菌群环境,对肠道功能有一定的调节作用,具有较高的药用和保健功效。已有文献和专利报道采用蛋白酶、纤维素酶和5′-磷酸二酯酶等酶复合水解香菇制备酶解物的报道,这些方法虽然具有水解度高的优点,但是水解需要3种商品酶制剂,生产的成本较高,实际应用难度大。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株水解酶产生菌——黑曲霉(Aspergullis niger)MJ,及其在制备香菇酶解物中的应用。利用该菌株发酵制备含蛋白酶、5′-磷酸二酯酶和多糖水解酶等酶的复合水解酶系,直接用于酶解香菇得到酶解物,水解率高达35%以上,酶解物中的氨基酸含量达5.36%,5′-核苷酸含量达0.86%,多糖含量达74.2%。产品味道鲜美,营养丰富,保健功效高,可进一步深加工为香菇调味品或保健食品。
本发明采用的技术方案是:
一株黑曲霉(Aspergullus niger)MJ,保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国,武汉,武汉大学,邮编:430072,保藏编号:CCTCCNO:M2013329,保藏日期:2013年7月11日。
本发明所述黑曲霉MJ由土壤中分离和筛选,并经过诱变选育得到的优良菌株。
所述黑曲霉MJ的生长特征如下:在马铃薯固体培养基上,30℃条件下,培养3天,菌丝即可长满,并产生大量孢子。菌丝初期为白色绒毛状,之后逐渐呈黑褐色,菌落背面呈浅黄色。菌丝表层有大量黑褐色分生孢子。显微镜下观察到分生孢子头呈黑褐色放射状,分生孢子梗长短不一,顶囊球形,双层小梗,分生孢子黑褐色球形。
本发明还涉及所述的黑曲霉MJ在微生物发酵制备水解酶中的应用。
具体的,所述应用为:将黑曲霉MJ菌种接种至产酶培养基中,25~32℃培养2~4天,获得含有蛋白酶、5′-磷酸二脂酶和多糖水解酶的发酵液。所得发酵液经离心或过滤除去菌体的清液为水解酶的粗酶液,可以直接应用于酶解制备香菇酶解物;也可以保藏于4℃冰箱15天内使用;也可以经过冷冻干燥,制成干酶粉保藏于4℃冰箱长期使用。
所述产酶培养基按如下组成配制:马铃薯100~300g(煮沸20min过滤留汁液),蔗糖20~60g,水补足至1000mL,pH4~6。
本发明还涉及所述的黑曲霉MJ在微生物酶解香菇制备香菇酶解物中的应用。
具体的,所述应用为:将黑曲霉MJ菌种接种至产酶培养基中,25~32℃培养2~4天,发酵液经固液分离获得水解酶的粗酶液。粗酶液经过1~2倍体积的水稀释或不经稀释,加入足量干香菇粉(过量也可),于25~35℃、100~300r/min条件下酶解8~16h,之后,过滤去除未被酶解的香菇残渣,滤液经浓缩、干燥和粉碎,即得香菇酶解物。
所述产酶培养基按如下组成配制:马铃薯100~300g(煮沸20min过滤留汁液),蔗糖20~60g,水补足至1000mL,pH4~6。
所述菌株在产酶培养前,通常需要先经斜面培养基活化培养,或再经过种子扩大培养,然后用孢子或种子液接入产酶培养基进行产酶发酵。具体的,所述活化及种子培养和产酶发酵方法如下:
(1)将黑曲霉MJ菌种孢子接种于斜面培养基,于25~32℃培养2~3天,得到活化后的黑曲霉MJ菌种;所述的斜面培养基组成为:马铃薯100~200g/L(马铃薯洗净去皮,切成小块,加5倍质量水煮沸20~30min,4层纱布过滤去除马铃薯块)、葡萄糖10~20g/L、NaCl5~10g/L、琼脂15~20g/L,溶剂为自来水,pH4~6;
(2)将步骤(1)活化培养后黑曲霉MJ孢子接种至种子培养基中,于25~32℃、150~250r/min振荡条件下培养1~2天,得种子液;所述种子培养基不含琼脂,其他成分以及配制方法同斜面培养基;
(3)将步骤(2)种子液以2%~10%的体积比的接种量,移种到产酶培养基中,或将步骤(1)的黑曲霉MJ孢子直接接入产酶培养基中,产酶培养基于25~32℃、150~250r/min振荡条件下培养2~4天,得到黑曲霉MJ的发酵液;所述产酶培养基按如下组成配制:马铃薯100~300g(煮沸20min过滤留汁液),蔗糖20~60g,NaCl5~10g,水补足至1000mL,pH4~6。
本发明将香菇去柄烘干粉碎后直接为原料,利用水解活性较高的微生物产生的粗酶液直接进行处理香菇粉,香菇中的蛋白质被部分水解成氨基酸,核酸被部分水解成核苷酸、多糖被部分水解为低聚糖,酶解产物富含氨基酸、核苷酸、香菇低聚糖和多糖,具有较高的营养价值和保健功效,可以作为食品调味剂、营养补充剂和保健食品的原料。
本发明的有益效果主要体现在:(1)黑曲霉是食品工业中常用菌种,不产有害物质,使用安全;(2)水解酶的发酵工艺简单,酶的生产成本低;(3)黑曲霉MJ发酵制备的复合水解酶,对香菇中的蛋白质、核酸和多糖的水解效率高;(4)生产工艺不使用有毒有害原料,环保无污染;(5)产品天然绿色,味道鲜美,营养丰富,保健价值高,应用领域广。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:产酶微生物的富集、分离、筛选和诱变育种
市售新鲜香菇切碎,称取25g到250mL三角瓶中,加入刚采集的菜地土壤5g,加少量水搅拌均匀,置于30℃的恒温箱培养5天,进行产酶微生物的富集。
将长满霉菌的上述富集物用无菌水稀释后涂布于平板培养基上,于30℃的生化培养箱中培养3天至大量菌落形成。挑取颜色和形态不同的霉菌菌落孢子接种于斜面培养基上,斜面培养基于30℃恒温培养3天,得长满孢子的斜面菌种。
用接种环分别挑取上述菌株斜面菌种的孢子,接入50mL产酶培养基中(250mL三角瓶装),于30℃、200r/min振荡条件下培养4天后,将发酵液用4层纱布过滤,取10mL滤液到一只50mL的三角瓶中,加入1g香菇粉。三角瓶用保鲜膜封口后于30℃、200r/min的水浴振荡箱中酶解10h。酶解结束后,酶解液用4层纱布过滤,去除未被酶解的残渣。
用甲醛法测定香菇酶解液中的氨基酸含量,过碘酸氧化法测定5′-核苷酸含量,硫酸—苯酚法测定多糖含量,比较不同菌株所产水解酶对香菇水解能力的大小。经过比较,一个霉菌M9菌株产酶水解香菇得到的酶解物中,氨基酸、5′-核苷酸和多糖的综合含量相对较高,对香菇的水解率达到18.4%。
依据M9菌株的菌落、菌丝和孢子的形态特征初步判断为曲霉菌,采用18S rDNA序列分析方法对菌株M9进行鉴定,确定其为一株黑曲霉(Aspergullis niger)。
对野生菌株黑曲霉M9进行了紫外照射诱变选育,经过筛选,获得一个菌株MJ,其产酶水解香菇制备的酶解物中,氨基酸、5′-核苷酸和多糖的综合含量较野生菌株有所提高,对香菇的水解率达到25.7%,较野生菌株提高了39.7%。将该菌株提交中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号:CCTCC No:M2013329,保藏日期:2013年7月11日。
所述的平板培养基和斜面培养基的组成相同,按如下组成和方法配制:马铃薯洗净去皮,切成小块,称取200g,加自来水1000mL煮沸30min,4层纱布过滤去除马铃薯块,滤液补足到1000mL,再加入葡萄糖20g、NaCl5g、琼脂18g,pH自然,121℃高压蒸汽灭菌20min。
所述的产酶培养基按如下组成配制:马铃薯200g,蔗糖20g,NaCl5g,水补足至1000mL,pH6,配制方法同平板培养基。
实施例2:用于制备香菇酶解物的水解酶发酵
以黑曲霉MJ为产酶菌种,经过培养基组成和发酵条件优化后,制备的粗酶液水解香菇,酶解物中氨基酸、5′-核苷酸和多糖的综合含量有一定幅度提高,对香菇的水解率达到36.8%,较未优化前提高了43.2%,优选的制备方法如下:
(1)将试管斜面保藏的黑曲霉MJ菌种接种于斜面培养基,斜面于30℃生化培养箱中培养2天。所述的斜面培养基按如下组成和方法配制:马铃薯洗净去皮,切成小块,称取200g,加自来水1000mL煮沸30min,4层纱布滤去马铃薯块,滤液补足到1000mL,再加入葡萄糖20g、NaCl5g、琼脂18g,pH6,加热至各成分溶化后分装试管,加塞后121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)用接种环挑去步骤(1)活化培养后黑曲霉MJ孢子至种子培养基中,种子培养基于30℃、200r/min振荡条件下培养2天,得种子液;所述种子培养基除不含琼脂外,其他成分和配制方法同斜面培养基。培养基分装于250mL三角瓶,每瓶50mL,八层纱布扎口,高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)步骤(2)种子液以5%的体积比接种量接至产酶培养基,30℃、200r/min振荡条件下培养3天,得到含多种水解酶的发酵液;所述产酶培养基按如下组成配制:马铃薯300g(煮沸20min过滤留汁液),蔗糖40g,NaCl8g,水补足至1000mL,pH6。培养基分装于250mL三角瓶,每瓶50mL,八层纱布扎口,高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)将步骤(3)黑曲霉MJ的发酵液,用4层纱布过滤除去菌体,所得清液即为用于制备香菇酶解物的水解酶液。
所得水解酶液可以用于制备香菇酶解物,可以立即使用;也可以保藏于4℃冰箱15天内使用;也可以经过冷冻干燥制成干酶粉,保藏于4℃冰箱长期使用。
实施例3:香菇酶解物的制备
将市售新鲜香菇去柄洗净,85℃的烘箱中烘干24h,用粉碎机将其充分粉碎。将实施例2中制备的酶液50mL于250mL三角瓶中,加入10g香菇粉,三角瓶用保鲜膜封口后,于30℃、200r/min的水浴振荡箱中生物转化12h。酶解液用4层纱布过滤去除未被酶解的残渣,滤液经减压浓缩,真空干燥后粉碎,得香菇酶解物3.68g,计算出水解得率为36.8%。
将上述方法制得的香菇酶解物用茚三酮比色法测定其氨基氮含量,过碘酸氧化法测定5′-核苷酸含量,硫酸—苯酚法测定多糖含量。结果表明:本方法制得的香菇酶解物中,氨基酸含量为5.36%,5′-核苷酸含量为0.84%,多糖含量为74.2%。
Claims (3)
1.一株黑曲霉(Aspergullus niger)MJ,保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国,武汉,武汉大学,邮编:430072,保藏编号:CCTCCNO:M2013329,保藏日期:2013年7月11日。
2.如权利要求1所述的黑曲霉MJ在微生物发酵制备水解酶中的应用。
3.如权利要求1所述的黑曲霉MJ在微生物酶解香菇制备香菇酶解物中的应用。
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