CN103608459B

CN103608459B - 用于从微藻提取角鲨烯的方法

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Publication number: CN103608459B
Application number: CN201280025846.XA
Authority: CN
Inventors: 塞缪尔·帕蒂尼尔
Original assignee: Rogate Brothers
Current assignee: Rogate Brothers
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2018-10-16
Anticipated expiration: 2032-05-25
Also published as: CA2835027C; JP5990575B2; JP2014515275A; KR20140023367A; FR2975705A1; WO2012164211A1; EP2714917B1; CA2835027A1; US20140073037A1; CN103608459A; FR2975705B1; KR102032573B1; EP2714917A1

Abstract

本发明涉及用于不使用有机溶剂提取通过使属于破囊壶菌目物种家族的微藻发酵而产生的角鲨烯的方法，其特征在于它包括以下步骤：1)制备属于破囊壶菌目家族的微藻的生物质以降低间质可溶物质的浓度，并且因此获得30%至99%的纯度，表述为相比发酵介质总干重的生物质干重；2)使用选自中性或碱性蛋白酶的组的蛋白酶处理产生的生物质以破坏所述微藻的细胞壁同时阻止由所述酶处理产生的乳液形成；3)离心所产生的反应混合物以将油与水相分离；以及4)回收由此产生的富集角鲨烯的粗制油。

Description

用于从微藻提取角鲨烯的方法

本发明涉及在不存在有机溶剂下，从破囊壶菌属家族的微藻最优化提取角鲨烯的方法。

对于本发明的目的，表述“破囊壶菌目物种家族的微藻”意在是指属于裂殖壶菌属、Aurantiochytrium sp.和破囊壶菌属物种的微藻。

角鲨烯是一种三萜，包括30个碳原子和50个氢原子的类异戊二烯，化学式为：2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。

这是一类由所有高等生物，包括在人类（在皮脂中发现）中自然产生的脂类。角鲨烯事实上是在胆固醇、类固醇激素和维生素D生物合成中一种必需中间体（一种胆固醇代谢途径的酶，角鲨烯单加氧酶，通过氧化角鲨烯分子的一个末端将诱导其环化作用并产生羊毛脂甾醇，后者将转变为胆固醇或其他类固醇）。

在工业上，角鲨烯特别地应用于食品部门、化妆品领域和制药领域。

作为食品增补剂，角鲨烯通常被配制为胶囊剂或油类。

在化妆品领域，这一分子可以被用作保湿霜中的抗氧化剂、抗静电剂和软化剂，迅速渗透皮肤而不留下脂肪痕迹或感觉，并且与其他油类和维生素混合良好。

在这个领域应当注意的是，考虑到角鲨烯极不稳定性（6不饱和的），它是饱和形式角鲨烷（通过氢化作用获得），与角鲨烯相比是更好的抗氧化剂，角鲨烷在市场上可以找到，通常来讲有非常高的纯度（99%）。

毒理学研究表明，按照在化妆品中使用的浓度，角鲨烯和角鲨烷并不显示任何毒性并且对人类皮肤无刺激、不致敏。

在制药领域中，角鲨烯被用作疫苗的佐剂。

这些佐剂是刺激免疫***并增加对疫苗相应的物质。

角鲨烯的纯度水平在应用领域是必要的。

事实上，如果口服，角鲨烯被认为是完全安全的，但是注射途径是争论的主题。

事实上，在医学领域，在角鲨烯被杂质污染的情况下会增加人类受试者伤害的风险，因为根据定义，这一佐剂也可以因其自身杂质诱导一种强烈的免疫反应。

因此必须获得高质量、无杂质的角鲨烯（杂质是指痕量金属，尤其是指汞和其他毒素）。

文献中提出了几种生产和提取角鲨烯的途径。

它是通常在软骨鱼类的肝脏中发现贮藏的一种化合物，例如深海鲨鱼（角鲨烯因此得名）。

因此这就是它们被过度捕捞的原因之一，鲨鱼已经因其鳍而被捕杀。鲨鱼肝脏因此被出售以生产被誉为“有益健康”的胶囊。

然而，即使出售的角鲨烯主要从鲨鱼肝脏中提取，也不能排除健康问题。

这是因为鲨鱼可以感染病原体，这些病原体可以产生对人类有害的物质。此外，鲨鱼肝脏（生物体的消除和净化器官）可以包含对人类有害的毒素，例如carchatoxin。

这些令人担忧的环境问题（鲨鱼数量的大量减少）和令人担忧的健康问题（鱼肝也贮藏令人担忧的有关健康的毒素），促使人们从植物中提取角鲨烯。

因此将它从橄榄油、棕榈油进行提取，以及在来自谷类或源自苋属植物、种子、米糠或小麦胚芽的油中进行分离是可能的。

然而，在这种情况中一个主要缺点是提取的角鲨烯量很小，按重量计大约从0.1%至0.7%。

作为从鲨鱼肝脏中或从植物中这些提取方法的第一替代方案，通常由于需要实质上的富集和纯化方法的实施而成本昂贵，人们提出了用于从微生物（天然酵母或重组酵母，特别地是酵母属类型）中生产角鲨烯的第一方法。

因此，酿酒酵母因其生产角鲨烯的能力而被熟知，尽管量很小：大约0.041mg/g生物质（Bhattacharjee,P.et al.（巴特查尔吉,P.等人）,2001,在WorldJ.Microb.Biotechnol.（《世界微生物学和生物技术期刊》）,17,pp.811-816）中。

因此通过遗传重组，已经对其生产能力进行了最优化处理。然而，如用于医学领域（作为疫苗佐剂的纯度高于97%的角鲨烯的生产）的专利申请WO2010/023551所呈现的，在具有超高生产角鲨烯重组酵母之前（超过15%的干细胞重量），这一第一替代方案还不能工业化。

然而，这些重组细胞的获得需要使用分子生物学工具，实施大量艰辛的、漫长的和复杂的代谢工程步骤，导致角鲨烯生物合成途径的刺激和角鲨烯分解代谢途径的抑制。

作为从鲨鱼肝脏或从植物中提取方法的第二替代方案，提出了用于从破囊壶菌家族（包括破囊壶菌属、Aurantiochytrium和裂殖壶菌属）,更特别地Schizochytriummangrovei或裂殖壶菌的微藻生产角鲨烯的有希望的方法。

这些微藻在异养条件下（无光；提供葡萄糖作为碳源）生产角鲨烯，并且可以因此容易地由微生物发酵领域普通技术人员操作。

这些方法因此通过受控制的发酵条件提供纯化很容易达到以满足食品、化妆品和医学的需要的角鲨烯质量。

然而在这些破囊壶菌目家族的微藻中，角鲨烯是感兴趣的其他脂类化合物的副产物，例如二十二碳六烯酸（或DHA），ω3家族的一种多不饱和脂肪酸。

因此特别地角鲨烯被描述为商业DHA油类（连同胡萝卜素和固醇类）的不可皂化部分的组分之一。

通过比较，Schizochytrium mangrovei FB1菌株以按细胞干重6.2%的比例生产DHA，对于角鲨烯0.017%。

因此，这些自然生产角鲨烯的微生物以小量生产角鲨烯：

-对于破囊壶菌ACEM6063（比较Lewis et al.（刘易斯等人）,Mar.Biotechnol.（《海洋生物技术》）,2001,pp439-447），大约0.1mg/g生物质，

-对于Schizochytrium mangrovei FB1（比较Yue Jiang et al.（越江等人）,J.Agric.Food Chem.（《农业食品化学期刊》）,2004,52,pp1196-1200），大约0.162mg/g生物质。

为了增加产量，因此明显的需要最优化发酵条件。

然而，尽管做出了所有的努力，这些值依然低于橄榄油的参考值（大约4.24mg/g）。

最好地，这些最优化的产量导致的产量大约是：

-每g的破囊壶菌ACEM6063生物质，1mg至1.2mg的角鲨烯（比较Qian Li et al.（钱李等人）,J.Agric.Food Chem（《农业食品化学期刊》）.,2009,57,4267-4272或Lewis etal.（刘易斯等人）,in Mar.Biotechnol（《海洋生物技术》）.,2001,3,439-447）；

-每g的裂殖壶菌生物质，0.72mg的角鲨烯（比较G.Chen etal.（G.陈等人）,NewBiotechnology（《新生物技术》）,2010,27-4,pp382-389）；

-每g的Aurantiochytrium mangroveiFB3I生物质，0.53mg的角鲨烯（比较K.W.Fanet al.（K.W.范等人）,World J.Microbiol.Biotechnol.（《世界微生物与生物技术期刊》）,2010,26-3,pp1303-1309）；

-每g的Schizochytrium mangrovei生物质，1.17±0.6mg的角鲨烯（比较C-J Yueand Y.Jiang（越和Y江）,Process Biochemistry（《生物化学进展》）,2009,44,923-927）。

本申请公司自身也致力于通过以下进一步改进破囊壶菌目物种家族的微藻的角鲨烯产量：提供一种使其可能以在本领域的文献中还未达到的水平生产角鲨烯的方法，例如每100g的生物质至少8g的角鲨烯（如将在下文中举例说明）。

在实验室规模上，用于从来源于发酵介质的生物质提取角鲨烯的方法是使用有机溶剂的常规方法：

-Yue Jiang et al.（越江等人）,J.Agric.Food Chem.（《农业食品化学期刊》）,2004,52,1196-1200描述了一种方法，在该方法中这些脂类溶解在甲醇/丙酮（7:3v/v）中并且然后在氯仿/甲醇（2:1v/v）中洗涤。

-在C-J Yue（C-J越）和Y.Jiang（Y.江）,Process Biochemistry（《生物化学进展》）,2009,44,923-927中，角鲨烯和胆固醇的提取是在预先使用乙醇对冻干细胞进行皂化后使用己烷进行的；

-在G.Chen et al.（G.陈等人）,在New Biotechnology（《新生物技术》）,2010,27-4,pp382-389中，角鲨烯的提取是在使用KOH（10%w/v）-乙醇（75%v/v）对冻干细胞进行皂化后使用己烷进行的；

-在Lewis et al.（刘易斯等人）,Mar.Biotechnol（《海洋生物技术》）.,2001,439-447中，首先使用三元混合物（氯仿/甲醇/水（1:2:0.8v/v/v）从冻干细胞中提取总脂类，然后为了获得不皂化的脂类，使用在甲醇/水（4:1w/v）中5%的KOH溶液对这些总脂类的部分进行处理，随后使用己烷-氯仿（4:1v/v）对这些中性不皂化脂类进行实际提取。

在更大的规模，为了避免使用对人类及环境有害的溶剂，提出了其他的溶液。

有趣的是在专利KR2008/0017960中，提出例如将包含角鲨烯的介质放置在环糊精溶液中以获得环糊精/角鲨烯复合物，然后添加凝固剂（例如CaCl₂、CaSO₄、MgCl₂或MgSO₄）以利于它从所述介质中分离。然而，为了将其按照这样进行分离还必须将角鲨烯解复合。

然而事实上主要描述了两种技术：

-用于使用超临界CO₂提取的方法；

-用于在有机溶剂不存在下提取的方法。

因此用于使用氯仿或使用己烷提取的方法的第一替代方案是超临界CO₂。

这种技术很适合于具有分子重量低于500道尔顿的非极性化合物的提取（角鲨烯的分子重量稍微低于400Da）。

角鲨烯在压力为100和250bar之间在超临界CO₂中是可溶的。

使用这种技术进行提取的大量工作已经在葡萄藻、斜生栅藻或德尔布有孢酵母上进行。

此外超临界CO₂因此用于细胞裂解和用于角鲨烯的分离两者。

然而，建议在从那里将这些脂类提取之前将细胞冻干，这需要大量的额外工作以使该技术适合于微生物的类型。

此外，在令人注目的成本下这些条件难以适用于工业规模。

第二技术替代方案是在不存在有机溶剂下液体提取的方法。

来自Benemann（伯南曼）和Oswald（奥斯瓦德）大量文章和文件或来自例如专利EP1252324和EP1305440的传授内容，描述了这种方法，但是没有它们的任何一个特别指明针对角鲨烯提取的最优条件。

在他们1996年名为（Systems and Economic Analysis of Microalgae Pondsfor Conversion of CO2to Biomass.Report prepared for the Pittsburgh EnergyTechnology Center under Grant No.DE-FG22-93PC93204（《用于将CO₂转变为生物质的微藻池塘的***和经济分析，在授权编号DE-FG22-93PC93204下为匹茨堡能源技术中心准备的报告》）的文章中，J.Benemann（J.伯南曼）&W.Oswald（W.奥斯瓦德）传授离心分离不仅可以用于浓缩生物质同时还从油相中的藻类提取脂类。

这种分离是基于水、藻类的脂类和生物质其他组分之间在密度上相对大的差异。

特别地，Benemann（伯南曼）&Oswald（奥斯瓦德）特别在用于以下的方法的背景下描述了它：从藻类生物质提取β-胡萝卜素，这种藻类生物质已经通过热油提取方法进行了絮凝。

因此，收集和处理步骤与普通絮凝和离心分离步骤重叠。

专利EP1252324报道了以下：破裂湿润微生物生物质以释放细胞内脂类，通过用于生产“相分离的混合物”（包括重层和轻层）的方法处理细胞裂解产物，从含脂轻层重力分离重层，并且然后分解所述轻相中的水/脂类乳液以获得该脂类。

注意到乳液状态阻止了纯脂类的回收是重要的。因此必须求助于一种方法，该方法使用一种洗涤溶液（该洗涤溶液可以是水、乙醇和/或丙酮）对该乳液进行洗涤，直至这些脂类变成“本质上”非乳化的。然而不建议使用高于5%的非极性有机溶剂。

还应理解的是乳液的油/水界面由细胞碎片稳定化。这就是为什么在细胞-分解步骤之前或期间加热发酵介质，或在细胞-分解步骤期间将碱添加至该发酵介质促成了乳液形成减少的原因，由于这种加热（至少50℃）或碱处理使蛋白质变性并且使有机物质溶解。

据说这种方法允许所有类型脂类的提取：磷脂类；游离脂肪酸；脂肪酸酯，包括脂肪酸甘油三酯；固醇类；色素类（例如类胡萝卜素和氧合类胡萝卜素）和其他脂类，和脂-相关化合物例如植物甾醇、麦角硫因、硫辛酸、和包括β-胡萝卜素、生育三烯酚类和生育酚的抗氧化剂。

在这种情况中优选的脂类和脂-相关化合物是：胆固醇、植物甾醇、脱氢胆甾醇、生育三烯酚类、生育酚、泛醌、类胡萝卜素和叶黄素类例如β-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素、虾青素、玉米黄素、角黄素、和脂肪酸例如共轭亚油酸、和Ω-3和Ω-6类型的多不饱和脂肪酸，例如二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、花生四烯酸、十八碳四烯酸、双高-γ-亚麻酸和γ-亚麻酸。

并不是如此设想角鲨烯，也并不如此设想任何具体的细胞裂解方法或用于实施明确提供的离心的条件。

对于专利EP1305440，其特别地致力于由高山被孢霉产生的花生四烯酸的提取。

关于发展用于提取角鲨烯的方法（该方法比那些描述于现有技术中的方法更有效），本申请公司已经在用于从破囊壶菌属家族的微藻的发酵介质提取（不存在有机溶剂）这种化合物的最优化条件方面发展了自身研究。

因此本发明涉及在不存在有机溶剂下用于提取通过使属于破囊壶菌目物种家族的微藻发酵而产生的角鲨烯的方法，其特征在于它包括以下步骤：

1)制备属于破囊壶菌目家族的微藻的生物质以减少间质可溶物质的浓度，并且因此达到30%和99%之间的纯度，优选地高于95%，表达为相比发酵介质总干重的生物质干重，

2)将产生的生物质使用蛋白酶进行处理，该蛋白酶选自中性或碱性蛋白酶的组，例如枯草杆菌蛋白酶，以此破坏所述微藻的细胞壁同时阻止由所述酶处理产生的乳液形成，

3)将产生的反应混合物进行离心以将油与水相分离，并且

4)回收由此产生的富集角鲨烯的粗制油。

根据本发明的方法的第一步骤在于制备属于破囊壶菌目家族的微藻的生物质以减少间质可溶物质的浓度，并且因此达到30%和99%之间的纯度，优选地高于95%，表达为相比发酵介质总干重的生物质干重。

对于本发明的目的，术语“间质可溶物质”旨在表明发酵介质的所有的可溶性有机污染物，例如水-可溶化合物如盐类、残留葡萄糖、蛋白质和肽类等等。

对于属于破囊壶菌目家族的微藻，测试了以下商业可购得的菌株：

-裂殖壶菌属ATCC20888，

-Aurantiochytrium sp.ATCC PRA276。

此外，本申请公司还具有其自身生产菌株，保藏于2011年4月14日在巴斯德研究所的法国国家微生物保藏中心[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes]中保藏号为CNCM I-4469的裂殖壶菌属以及还保藏在中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION of the University of Wuhan），武汉430072,中华人民共和国，保藏号为M209118的裂殖壶菌属。

该培养在异养条件下进行。总的来讲，该培养步骤包括预培养步骤（为了使该菌株复苏），然后是培养或发酵本身的步骤。后一步骤相对应于生产感兴趣的脂类化合物的步骤。

用于培养这些微藻的条件在本领域是熟知的。例如，G.Chen（G.陈）在NewBiotechnology（《新生物技术》）,2010,27-4,pp382-389的文章中，描述了包括以下连续步骤的方法：

-从依靠琼脂营养培养基供养的菌株开始，该琼脂培养基包括葡萄糖、谷氨酸一钠、酵母提取物和多种微量元素，

-在定轨振荡器上的锥形瓶中制备预培养物，条件为pH为6温度为25℃，以获得复苏的生物质，

-使用如在预培养中所用的相同的培养基接种另一系列的生产锥形瓶，，取大约为0.5%(v/v)的前一步骤中获得的生物质，保持温度为25℃。

预培养可以优选地持续24至74小时，优选地大约48小时。对于培养，就其本身而言，可以优选地持续60至150小时。

微藻生长所需的碳源优先地是葡萄糖。

关于氮源的性质，本申请公司发现可以从下组选择氮源，该组由以下各项组成：酵母提取物、尿素、谷氨酸钠和硫酸铵，单独使用或组合使用。同样地，可以全部地或部分地将尿素置换为谷氨酸钠，或使用谷氨酸钠和硫酸铵的混合物。

可能倾向于酵母提取物（传统地在现有技术方法中使用的），补充有维生素混合物的尿素，例如由西格玛公司（Sigma）出售的BME混合物，以5ml/l的比例使用。

优选地，预培养物培养介质包括维生素B1、B6和B12。

关于培养基的pH，如将会在下文中举例说明，它将保持在5.5和6.5，优先地固定在pH值6。pH可以通过本领域普通技术人员所熟知的任何手段进行调整，例如通过添加2N硫酸，然后添加8N氢氧化钠。

最后，溶解氧量可以在值为20%和0%之间进行调整，优选地保持在5%持续24和48小时之间的一个初始时期，优选地36小时，然后在0%保持。此外，关于氧传输，将通过本领域普通技术人员熟知的任何手段进行调整以使其不超过45mmol/l/小时。

根据本发明的方法，从发酵罐提取的生物质将通过本领域普通技术人员熟知的任何手段进行处理以达到纯度高于95%，表达为相比发酵介质总干重的生物质干重。

有利的是，本申请公司建议经由连续的生物质浓缩（通过离心）/稀释将间质可溶物质进行洗涤，如将在下文中举例说明。

这种间质可溶物质纯化的生物质然后优先地调整为6%和12%之间的干物质含量，优选地调整至10%和12%之间的干物质含量，使用去矿物质水或纯水，优选地纯水。

根据本发明的方法的第二步骤在于使用选自中性或碱性蛋白酶的组的蛋白酶（例如枯草杆菌蛋白酶）对产生的生物质进行处理，以破坏所述微藻的细胞壁同时阻止由所述酶处理产生的乳液形成。

作为酶裂解细胞壁这个步骤的开始，将具有12%干物质含量的生物质放置在装配有螺旋桨搅拌器（低剪应力）和挡板（为了破坏产生的涡旋作用）的反应器中，以此限制由酶处理产生的细胞裂解产物的乳化作用，同时能够均匀的混合促进水解酶的作用。

温度调整至50℃以上，优选地大约60℃，并将pH调整至7以上，优选地大约为8。在本申请中，术语“大约”意为表示的值±10%所述值，优选地±5%所述值。当然包括精确值。例如，大约地100意为90和110之间，优选地95和105之间。

这些条件对于枯草杆菌蛋白酶（例如由诺维信公司（Novozymes）出售的一种）的活性是最优的，该蛋白酶在浓度为按干重计0.4%和1%之间，优选地按干重计1%使用。

裂解作用的持续时间在2h和8h之间，优选地4h。

裂解作用结束时，本申请公司建议以高于5%(v/v)，优选地大约10%(v/v)将乙醇添加至该反应混合物（水包油乳液形式）并且进一步搅拌15分钟。

将乙醇作为乳液-去稳定剂以较小比例添加至该***。

根据本发明的方法的第三步骤在于将产生的反应混合物进行离心以将油与水相分离。

在前述步骤结束时将获得的乙醇-去稳定乳液进行离心。

获得了三相：

-较上轻相（油），

-主要的水性中间体相（水+水-可溶物质），和

-较下相（细胞碎片沉淀物）。

这三相的分离是使用浓缩器模式的三输出分离器装置进行的，例如由阿法拉伐公司（Alfa Laval）出售的Clara20，这允许从水相和从细胞碎片提取的较上轻相（油）的回收。

对于水相，就其本身而言，经由分离器的重相输出来提取。固相经由自净作用提取。

在根据本发明的方法的步骤2结束时获得的细胞裂解产物可以加热至70℃和90℃之间的温度，特别地70℃和80℃之间并且优选地80℃，并且然后使用正排量泵进行输送（以在此进一步限制乳化作用）。优选地，它的pH可以调整至8和12之间的值，优选地值为10。

离心力高于4000g，优选地在6000g和10000g之间。

优选地非乳化轻相以单程获得。

最后，根据本发明的方法的第四步骤在于回收富集角鲨烯的较上油相。

本发明将通过以下实例更清楚地被理解，这些实例意为说明性的和非限制性的。

实例1

在实际培养/生产阶段之前在此以两个连续的预培养阶段进行微藻的发酵。

对于这个实验，将维生素添加至第一预培养基，但是将其添加至第二预培养基以及在生产中添加是可任选的。

预培养介质因此具有在下表I和II中给出的组合物：

表I

第一预培养的培养基	%
		葡萄糖	3
酵母提取物	0.4
		谷氨酸钠盐	6.42
NaCl	1.25
		MgSO₄	0.4
KCl	0.05
		CaCl₂	0.01
NaHCO₃	0.05
		KH₂PO₄	0.4
维生素混合物	0.14
		微量元素	0.8

表II

第二预培养的培养基	%
		葡萄糖	8.57
谷氨酸钠盐	6.42
		酵母提取物	0.64
NaCl	2
		KH₂PO₄	0.64
MgSO₄	2.29
		CaCl₂	0.03
NaHCO₃	0.03
		Na₂SO₄	0.03
维生素混合物	0.14
		微量元素	0.2

通常，Clerol FBA3107消泡剂以1ml/l使用。可任选地，使用了50mg/l的青霉素G钠盐以阻止污染性细菌的生长。使用KH₂PO₄并且与基质的剩余部分分开地对葡萄糖进行灭菌，因为如此可以避免沉淀（镁-铵-磷酸盐）的形成。灭菌过滤之后添加维生素混合物和微量元素。在下表III中给出了培养/生产培养基的组合物。

表III

	%
		在T0的葡萄糖添加	7.5
尿素	1
		酵母提取物	1.2
NaCl	0.25
		KH₂PO₄	0.96
MgSO₄	1.2
		CaCl₂	0.12
NaHCO₃	0.12
		KCl	0.08
维生素混合物的添加	0.4
		微量元素	0.56

在下表IV和V中给出了维生素混合物的组合物和微量元素的组合物：

表IV

维生素混合物	g/l
		B1	45
B6	45
		B12	0.25

表V

微量元素	g/l
		MnCl₂.2H₂O	8.60
CoCl2.6H₂O	0.2
		NiSO₄.6H₂O	7.50
Na₂MoO₄.2H₂O	0.15
		ZnSO₄.7H₂O	5.70
CuSO₄.5H₂O	6.50
		FeSO₄.7H₂O	32.00
ZnCl₂	1.50

发酵的实施

第一预培养在带有挡板的500ml锥形瓶中进行，向其中添加一滴由杜塞尔多夫康宁公司（Cognis GmbH Düsseldorf）出售的Clearol FBA3107消泡剂。

在培养基的组分完全溶解后将其进行过滤，可任选地以0.25mg/l比例补充青霉素G钠盐。

通过挑取在皮氏培养皿中培养的微藻菌落（以10μl接种环比例）进行接种。

在28℃的温度下，以100rpm进行震荡（在定轨振荡器上），培育持续24至36小时。

由于生物质沉淀（或黏贴至壁上)，充分震荡锥形瓶后小心取3ml至5ml的样品。

对于第二预培养，使用2l适配有管子的带有挡板的锥形瓶。

将一滴消泡剂和酵母提取物添加至100ml的水中。

将所有培养基组分溶解在300ml的去矿物质水中后，将其进行过滤。可以可任选地添加青霉素G钠盐并且在灭菌之前事先将一滴消泡剂添加至锥形瓶。

然后使用3-5ml的第一预培养物进行接种。

在28℃，培育进行另外的24至36小时，伴随震荡100rpm。

实际培养在20l的反应器中以下面的方式进行：

-对反应器中的一部分培养基进行消毒，对另外的部分分开消毒以预防沉淀的形成，

-使用在第二预培养结束时所产生的生物质进行接种，比例为培养基的0.5%v/v，

-培养保持在30℃，

-氧传输速率固定在35-40mmol/l/h，

-通气为0.2至0.3VVM，

-初始pH>5.5，

-只要浓度>20%就填充葡萄糖，以维持葡萄糖浓度在15g/l和70g/l之间。

下表VI给出了利用本申请公司的裂殖壶菌属而获得的结果。

表VI：

测试	E
		预培养温度（℃）	28
培养温度（℃）	30
		培养结束时角鲨烯的效价（g/l）	4.4
生物质（g/l）	54
		角鲨烯比干生物质g/100g	8.2

用于定量裂殖壶菌属生物质中的角鲨烯的方法。

在玻璃珠破碎生物质和用氯仿/甲醇进行冷提取后，在25℃通过质子NMR进行该分析。通过如下描述的内标进行定量。

使用Avance III400光谱仪（布鲁克仪器公司（Bruker Spectrospin））在400MHz获得光谱。

生物质破碎：精确称取大约200mg的新鲜生物质。添加大约1-1.5cm的玻璃珠和0.1ml的甲醇。密封试管并通过涡旋振荡器搅拌至少5min。

冷提取：添加大约2mg的磷酸三苯酯（TPP），0.9ml的甲醇和2ml的氯仿。密封试管并通过涡旋振荡器搅拌1min。将其放置在冰箱中。沉淀后（至少1小时），小心地回收澄清的较上相并将其转移到玻璃容器中，在环境温度下在氮气流下蒸发至干燥。将干提取物溶解在0.5ml的CDCl₃和0.1ml的CD₃OD中并将其转移至NMR试管中。

光谱记录：对仪器实施适当设置后进行采样，无溶剂抑制，无旋转，至少15s的弛豫时间。光谱窗口必须至少在1ppm和9ppm之间，光谱校准在7.25ppm的氯仿峰。傅立叶转换、相位校正和手动模式中的基线减法后进行光谱应用（不进行指数运算，LB=GB=0）。

信号应用：将TPP未分辨峰设置为100，该峰不包含在7.05和7.15ppm之间的氯仿信号（在9TPP质子处计数为）。在1.55ppm将角鲨烯信号的面积进行积分（在6质子处单峰计数）。

结果的计算和表达：结果表达为粗重量百分比。

以及

A_s：1.55ppm的角鲨烯信号的面积

PT_PP：积分的TPP未分辨峰的质子的数目：9

W_TPP：称量出来的TPP重量，以克为单位

M_TPP：TPP的摩尔质量，以克每摩尔为单位，（M_TPP=326g/mol）

M_S：角鲨烯的摩尔质量，以克每摩尔为单位，（M_S=410g/mol）

PE：新鲜生物质的重量，以克为单位

实例2：根据本发明角鲨烯的提取

在实例1结束时获得的生物质在发酵结束时的浓度为54g/l。

发酵结束时获得的角鲨烯效价是4.4g/l。

将从发酵罐中提取的生物质进行洗涤以去除间质可溶物质，这是通过离心（在5000g进行5分钟）及生物质的稀释（比例为1/3，V沉淀物/V水）经由连续的两个系列的浓缩而进行。

干细胞浓度相比总的粗制干物质含量是95%。

然后用蒸馏水将干物质含量调整至12%。

将洗涤的生物质在装配有螺旋桨搅拌器和挡板的2l发酵罐类型（例如那些由国际科学公司（Interscience）出售的）的Labo反应器中进行搅拌。

这个***使其可以限制由所产生的细胞裂解产物的乳化作用同时允许水解酶作用必不可少的良好混合。

将温度调整至60℃并使用氢氧化钠将pH调节至大约为8。

这些条件对于以干重计1%的量添加的枯草杆菌蛋白酶（诺维信公司（Novozymes））的活性是最优的。

裂解作用的持续时间设定为4h。

裂解作用结束时，将10%的乙醇(V_乙醇/V_裂解产物)添加至该反应混合物（水包油乳液）中并持续搅拌另外15min。

将温度再次增加至80℃并随后在配置在3-输出浓缩器模式的Alfa LavalClara20离心组件上进行离心。

这种离心特别适合于固体/液体/液体三相混合物类型的分离。

9600rpm的旋转使得可以达到大约10000g。

使用正排量泵以100l/h至400l/h的流速来输送细胞裂解产物。

重相和轻相之间的界面通过调整重相输出背压来移动。

自动清洗的频率调整至频率为2min至15min。

由此粗制油以高于85%的产率回收并且由此几乎包含所有产生的角鲨烯。

实例3：通过传统方法使用己烷提取角鲨烯的对比实例

正如实例2中所描述的：

-在实例1结束时获得的生物质在发酵结束时的浓度为54g/l。

-在发酵结束时获得的角鲨烯的效价是4.4g/l。

从发酵罐中提取的生物质也以120g/l通过离心进行浓缩。

将生物质在50l容器中在150rpm保持搅拌，并加热至60℃。

然后使用45%的氢氧化钾将pH调整至10。

将这些条件维持6h以达到完全碱裂解。

裂解作用的质量在光学显微镜下并通过样品离心（2min，10000g）进行监测。

裂解作用结束时，将10公升的乙醇（1乙醇体积/裂解产物体积）添加至该容器维持在45℃并搅拌10min。然后将10公升的己烷添加至该容器持续搅拌30min。

然后将混合物离心以分离轻的部分（己烷+油），将其存放在1m³的容器中。

将重（水）相再次放置在10公升的己烷中以根据前述相同的方案形成第二提取，为了增加提取产率。

将这两个有机部分进行合并以在旋转蒸发器中进行己烷的蒸发。

将提取的油的己烷残余物使用转膜蒸发器（80℃；1mbar）通过蒸发进行去除。

由此回收的粗制油产率为70%。

因此这种“传统”提取方法相比根据本发明的方法效率更低。

Claims

1.一种用于在不存在有机溶剂下提取通过使属于破囊壶菌目物种家族的微藻发酵产生的角鲨烯的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备属于破囊壶菌目家族的微藻的生物质以减少间质可溶物质的浓度，并且因此达到30％和99％之间的纯度，表达为相比发酵介质总干重的生物质干重，

2)使用选自枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶作为唯一的酶对产生的生物质进行处理，以破坏所述微藻的细胞壁同时阻止由所述酶处理产生的乳液形成，

3)将产生的反应混合物进行离心以将油与水相分离，并且

4)回收由此产生的富集角鲨烯的粗制油。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述纯度高于95％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于将在步骤1)中纯化的生物质然后调整至6％和12％之间的干物质含量。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于将在步骤1)中纯化的生物质然后调整至10％和12％之间的干物质含量。

5.如权利要求1至4中任何一项所述的方法，其特征在于在配备有螺旋桨搅拌器和挡板的装置中伴随非剪切、弱乳化搅拌地进行步骤2)的酶处理。

6.如权利要求1至4中任何一项所述的方法，其特征在于步骤2)的酶处理在高于50℃的温度，并且在高于7的pH进行。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤2)的酶处理在大约60℃的温度进行，其中术语“大约”意为表示的值±10％所述值。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤2)的酶处理在大约8的pH进行，其中术语“大约”意为表示的值±10％所述值。

9.如权利要求1至4中任何一项所述的方法，其特征在于在酶处理结束时添加多于5％(v/v)的乙醇。

10.如权利要求1至4中任何一项所述的方法，其特征在于在酶处理结束时添加大约10％(v/v)的乙醇，其中术语“大约”意为表示的值±10％所述值。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于该乙醇处理伴随搅拌地进行多于10分钟。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于该乙醇处理伴随搅拌地进行多于15分钟。

13.如权利要求1至4中任何一项所述的方法，其特征在于离心之前该反应混合物在70℃和90℃之间的温度，并且使它的pH至8和12之间的值。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于离心之前该反应混合物在80℃的温度。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于离心之前使该反应混合物的pH至10的值。

16.如权利要求1至4中任何一项所述的方法，其特征在于该离心在浓缩器模式的三输出分离器中进行，该分离器允许回收从水相及细胞碎片提取的油相。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于该离心使用大于4000g的离心力进行。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于该离心使用6000g和10000g之间的离心力进行。

19.如权利要求16所述的方法，其特征在于该离心使用大约10000g的离心力进行，其中术语“大约”意为表示的值±10％所述值。