CN103601539A - 复合生物肥料及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开复合生物肥料及其生产方法，所述复合生物肥料，由黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、植物乳杆菌剂和枯草芽孢杆菌菌剂组成，复合生物肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物30-70份、解磷巨大芽抱杆菌5-10份、植物乳杆菌剂20-30份，枯草芽孢杆菌菌剂10-40份。实验表明使用本品可提高粮食产量8-30%，提高蔬菜产量10-40%，还可改善蔬菜、粮食的品质和风味。每亩土地使用本发明的肥料的量为50-100克，是目前国内外使用量较少的复合生物肥料之一。

Description

复合生物肥料及其生产方法

技术领域：

发明涉及农业技术中的肥料，涉及一种新型的复合生物肥料及其生产方法。

背景技术：

针对土壤微生物的生物制剂，从大发酵概念上看，地球可看做一个发酵罐，土壤微生物的生长，土壤有机质的合理转化，对植物生长的促进作用不可估量。我们认为利用工业微生物的代谢酶，促进并激活土壤微生物及植物的内源酶活性，促进微生物及植物生长，对土壤改善与提高作物产量具有重大意义。由于化肥的长期使用，会损害土壤合适的菌群结构及土壤的团粒结构，所以保护生态及地力已成为目前农业问题的重点。因为农业生产大量使用化肥，植物对化肥的依赖度不断加大，抑制了土壤转化能力，有机肥作用难以充分发挥，土壤结构不宜改善。

现有的生物肥料大多是单一性的生物肥料。如：固氮菌肥，主要由具有固氮作用的细菌和真菌组成；又如：磷细菌，其功能是分解土壤中的有机磷，使之变为易于被植物吸收的磷素；再如：钾细菌，其功能是分解土壤中的钾化合物，使之成为能被植物吸收利用的速效钾。这些肥料在单独使用时均能发挥各自作用，部分满足植物对氮，磷，钾三要素的需要。它们不会产生长期使用化肥所造成的土壤板结现象。但其不足在于：单独使用上述三类生物肥料只能解决植物所需营养的一个方面，且成本较高，用量大，同时，将三者配合使用，又因难于做到比例适当而造成施肥量的不足或浪费。长期使用单一的或复合的生物肥料的实践证明，它们只能替代化肥的30%以下。

发明内容：

本发明的发明目的是提供一种能针对我国土壤肥力的基本情况，开发一种复合生物肥料及其生产方法。

本发明的技术解决方案是：

一种复合生物肥料，由黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、植物乳杆菌剂和枯草芽孢杆菌菌剂组成，复合生物肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物30-70份、解磷巨大芽抱杆菌5-10份、植物乳杆菌剂20-30份，枯草芽孢杆菌菌剂10-40份；

一种生产复合生物肥料的方法，将特选的黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别进行培养、发酵，然后将发酵产物按比例组合为复合生物肥料。

解磷巨大芽抱杆菌是芽抱杆菌属（Bacillus）中的一个种。运动，形成荚膜，好氧。从葡萄糖产酸，也常从***糖和甘露醇产酸。水解淀粉，不产生卵磷脂酶，VP阴性。能分解土壤中的有机磷成为植物可利用的速效磷。

解磷巨大芽孢杆菌剂由沧州旺发生物技术研究所提供，地址：中国河北沧州市运河区解放西路颐和国际商务中心A座1区807-812。

有益效果：

实验表明，使用本品可提高粮食产量8-30%，提高蔬菜产量10-40%，还可改善蔬菜、粮食的品质和风味。每亩土地使用本发明的肥料的量为50一100克，是目前国内外使用量较少的复合生物肥料之一。

每亩使用量为100克。在本发明复合生物肥料中加入120倍的自来水和6倍的尿素，在22℃以上45℃以下的水温中活化28小时，然后连同化肥（按照上年使用量的50%）洒入土壤中。最好作基肥，每年使用1-3次。

具体实施方式：

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。1、菌剂培养制备：

枯草芽孢杆菌剂培养制备：枯草芽孢杆菌菌剂制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕离心分离获得湿菌体和发酵液；发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的40-50%，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5-0.7:1，载体组成为：CaCO₃20-40份，糊精10-20份。流化床干燥，干燥温度50℃。

植物乳杆菌剂的制备方法：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5-0.7:1，载体组成为：CaCO₃20-40份，糊精10-20份。流化床干燥，干燥温度50℃。

黑曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到固态发酵培养料中，26-35℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物；

本发明提供的产耐高温α-淀粉酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Li-2013-02。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCCNo.7926。

所述菌株特点如下：

所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。

所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Li-2013-02由一株保藏于本实验室的产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Li-2013经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，具体筛选步骤如下：

（1）菌悬液的制备

将在平板划线分离后长出的Li-2013单菌落接入种子培养基中，100r/min，40℃培养12h后，取1mL培养液离心后用生理盐水洗涤两次，并重悬与9mL生理盐水中。

（2）紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变

将菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射100s。将经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置40℃培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于40℃震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。

（3）高产菌种的初筛

将上述涂布均匀的平板，置40℃培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03

（4）摇瓶发酵复筛

将获得的三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10％(V/V)，40℃、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。

（5）酶活测定

酶活单位的定义：1mL粗酶液，于105℃、pH4.2条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。

经测定，菌株Li-2013-02,为稳定的最高产菌株，且酶活达到30000U/mL，比原始菌株酶活提高1.6倍。

所述氯化锂平板：淀粉1%，蛋白胨1%，(NH)₂SO₄0.4％，K₂HPO₄0.8％，CaCl₂0.2％，氯化锂0.9%，琼脂2%。

所述的种子培养基：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl1％。

所述的发酵培养基：玉米粉5％～15％，豆饼粉4％～10％，(NH)2SO40.4％，K2HPO40.8％，CaCl20.2％。

所述的摇瓶培养条件：该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10％(V/V)，100r/min、40℃发酵培养72h。

由菌株Li-2013-02发酵获得了一种耐高温的α-淀粉酶，其酶学性质如下：

(1)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在105-115℃之间，且在110℃以下保存的温度稳定性较好，而115℃以上保存长时间温度稳定性较差。

(2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0-7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0时酶活完全稳定。

（3）酶活性：由本发明所提供的突变株Li-2013-02,制备的耐高温α-淀粉酶酶活力为30000-35000U/ml。

1、本发明使用紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变的方法获得了一株高产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Li-2013-02，该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点。

2、有该菌株生产所得的耐高温α-淀粉酶酶活力高达30000-35000u/ml,；适用温度范围为25-115℃，最适反应温度110℃，在110℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为3.0-7.0，在pH值为3.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为4.2，比现有的耐高温α-淀粉酶酶活力高，酶作用最适pH值范围宽泛，耐温度高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。

实施例1

一种复合生物肥料，由黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、植物乳杆菌剂和枯草芽孢杆菌菌剂组成，复合生物肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物60份、解磷巨大芽抱杆菌8份、植物乳杆菌剂25份，枯草芽孢杆菌菌剂30份；

本发明产品的具体生产方法步骤如下：

菌剂培养制备：

枯草芽孢杆菌剂培养制备：枯草芽孢杆菌菌剂制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕离心分离获得湿菌体和发酵液；发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的50%，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.6:1，载体组成为：CaCO₃30份，糊精15份。流化床干燥，干燥温度50℃。

植物乳杆菌剂的制备：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.6:1，载体组成为：CaCO₃30份，糊精16份。流化床干燥，干燥温度50℃。

黑曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到固态发酵培养料中，30℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床45℃干燥，粉碎干燥物；

采用的菌种如下：

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp）CGMCC7926

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC1.124

黑曲霉（Aspergillus awamori）CGMCC3.6484

上述四种菌种的保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址：北京市中关村北一条13号中科院微生物研究所；邮编：100080。

黑曲霉菌剂的制备方法：

技术方案如下：

斜面菌种活化培养：将黑曲霉斜面菌种转接到斜面培养基上，27℃培养3天。

固体一级种子培养：挑取黑曲霉斜面菌种接入装有100克培养基的500毫升三角瓶中进行种子培养，30℃培养3天即可。

固体二级种子培养：将上述培养好的固体一级种子搅拌为碎块后加入装有1000克培养基的5000毫升三角瓶中进行种子培养，培养条件：30℃培养3天即可。

固体发酵培养：将二级摇瓶种子粉碎，加入装有灭菌培养基的发酵池或托盘中混合均匀后培养，曲料培养温度控制在26-35℃，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次，培养时间5-7天；固体曲料的培养采用常用曲料培养技术；待培养料长满菌丝即可结束培养，培养基预先经高温蒸煮灭菌处理，灭菌条件控制温度121℃，时间1小时。

干燥粉碎：发酵结束培养料在流化床或其他干燥设备上进行干燥，干燥温度控制在60℃，干燥到水分含量在10%以下，然后将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在60目以上。

培养基组成：固体原料:麸皮70%,粉碎的作物秸秆15%,豆饼粉5%,玉米淀粉10%，添加等量自来水；初始pH自然。

枯草芽孢杆菌的制备方法：

1.发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液；

（1）一级种子培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；

（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；

（4）一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量（V/V）1:0.5,罐压0.05Mpa,培养时间24小时；

（5）发酵培养：将一级种子罐菌种以10%接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐，发酵培养基装量1吨，培养条件培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量（V/V）1:0.5,罐压0.05Mpa,培养时间24小时。

培养基组成：葡萄糖6%,酵母提取物1%,蛋白胨0.2%，CaCO31%,pH6.8。

植物乳杆菌剂的制备方法：

（1）一级种子培养：将植物乳杆菌菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，培养温度30℃，培养时间24小时；

（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，培养温度30℃，培养时间24小时；

（4）一级种子罐培养：将三级种子以5%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30℃，罐压0.05Mpa,培养时间18小时；

（5）发酵罐培养：将一级种子罐菌种以5%接种量接入总容积为3吨二级种子罐，发酵培养基装量2吨，培养条件培养温度30℃，罐压0.05Mpa,培养时间22小时。

培养基组成为：酪蛋白胨1%,牛肉提取物1%,酵母提取物0.5%,葡萄糖0.5%,乙酸钠0.5%,柠檬酸二胺0.2%,Tween800.1%,K2HPO40.2%,MgSO4.7H2O0.02%,MnSO4.H2O0.005%,CaCO32%,琼脂1.5%,pH6.8。

试验地的选择与试验设计：试验于2012年4月27日—9月30日在宁夏盐池县花马池镇八堡村进行。

试验田达到田种植玉米10亩，分别在种植时使用本发明产品每亩0.1公斤，出苗1个月左右通过锄地松土方式使用发明产品0.5公斤，对照组使用常规肥料。

发明产品使用玉米地玉米产量达到650公斤，对照组达到500公斤；发明产品的使用使玉米亩产量提高了30%。该地块在第2年种植春小麦，春小麦产量达到了400公斤，比对照组单产提高了20%。且试验田土壤结构良好，无大块和板结。

Claims (3)

1.一种复合生物肥料，由黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、植物乳杆菌剂和枯草芽孢杆菌菌剂组成，复合生物肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物30-70份、解磷巨大芽抱杆菌5-10份、植物乳杆菌剂20-30份，枯草芽孢杆菌菌剂10-40份。

2.根据权利要求1所述的复合生物肥料，其特征是，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Li-2013-02保藏号为CGMCC No.7926。

3.一种生产权利1所述复合生物肥料的方法，将特选的黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别进行培养、发酵，然后将发酵产物按比例组合为复合生物肥料。