CN103597089B

CN103597089B - 用于酶介导的信号放大的方法

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Publication number: CN103597089B
Application number: CN201280029392.3A
Authority: CN
Inventors: J·洛泽; G·斯克拉蒂奇克瓦
Original assignee: Dako Denmark ApS
Current assignee: Denmark Dako Co ltd; Agilent Technologies Inc
Priority date: 2011-04-19
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2017-04-12
Anticipated expiration: 2032-04-19
Also published as: EP2699691B1; CA2832907C; CA2832907A1; EP2699691A1; US9958449B2; US9366675B2; WO2012143010A1; CN103597089A; US20140162245A1; US20160274122A1

Abstract

本发明涉及用于对靶标相关信号的酶介导放大以使样本中的生物学靶标或化学靶标可视化的方法和化合物，其中靶标被固定化，具体地，本发明涉及用于使包括细胞的样本中的靶标可视化的氧化还原酶介导的信号放大。本发明的方法对于与医疗诊断和疗法相关的生物学标记物的定性和定量评估特别有用。

Description

用于酶介导的信号放大的方法

技术领域

本发明涉及用于靶标相关信号的酶介导放大以使样本中生物靶标或化学标靶可视化的方法和化合物，其中靶标是固定化的。本发明的方法可用于对组织学样本中生物标记物的定性和定量评测，特别是可用于诊断应用中。

背景技术

免疫化学(IHC)是医疗诊断中的常见工具，并且还通常用于对治疗性生物标记物的评估。特别地，生物标记物通常需要对其存在的程度进行定量评估。当这些试剂应用至固定于固体支撑物(support)上或在溶液中的纯化蛋白时，抗体对细胞和组织的应用呈现出在所遇到的情况之外的特异性难题。存在很多能够影响免疫检测的因素，其中有组织的固定和制备、抗原修复的持续时间和类型以及抗体特异性。另一个困难是对以低水平存在的靶标的检测能力。与可溶性测定(assay)相同，增加信号而不提高非特异性背景水平成为问题。最常研究的方法是信号放大，这通过连续几轮的酶促反应来达到。

3,3’-二氨基联苯胺(DAB)是辣根过氧化物酶(HRP)的发色底物，其被广泛地用于使组织学样本中标记有过氧化物酶活性的靶标蛋白可视化。该方法利用与靶向样本中蛋白的抗体相连的HRP，将DAB从溶液沉积到靶向蛋白的位点上，由此对蛋白进行标记。该方法不是特别灵敏，因此适合于检测相对大量的靶标蛋白。与DAB沉积相关的信号不能进一步放大。所要提及的其他缺点是，该方法需要相当大量的靶标特异性抗体来充满所有靶标位点，而且相当耗费时间。此外，该方法提供均匀的染色形态，对显微镜工作者显示出均一颜色，且具有细胞结构例如膜、胞质和核的胞内分辨度，这使得不可能准确地使染色定量。

近来，已经记载了一种全新的基于HRP-DAB的IHC可视化***。该***将DAB不仅用作标记靶标的HRP的发色底物，还用作在HRP的辅助下交联水溶液中其它可检测的HRP底物并将它们沉积在固定化HRP的周围的制剂（参见WO2009036760、WO2010094283和WO2010094284）。在组织学样本中，该方法会生成与传统HRP-DAB染色相似的染色形态，但是，与传统染色相比，该染色更加靶标特异化和灵敏，并且过程更快且稳健。

新方法并不使得靶标的量直接接近于样本中染色的量，因为这两个量之间的关联不是线性的。因此，通过所有这些方法可视化的组织学样本中的靶标的量仅可以相对地进行评测，而不是精确地评测。然而，在某些情况下，这种新描述的HRP-DAB靶标标记***能够很强地放大与单个靶标相关的信号，从而使单个靶标例如单个蛋白或核酸分子可以单独地在样本中可视化为有颜色或荧光的较大点并且通过使用普通低倍的明场或荧光光学显微镜来进行检测（参见WO2011047680）。可以在之后容易地对样本中直径高达4微米的视觉上分开（distinct）的单个点进行手动或自动定量，并且靶标的量可以很精确地确定（参见PCT/DK2011/000131）。

发明内容

本发明涉及可应用于靶标固定在例如固体支撑物上或固体支撑物内的样本的强大的新型信号放大***，使得可以将大量样本中的非常宽动态浓度范围内的单独单个靶标实体例如单个生物学分子或化学分子、单个分子结构、单个分子复合物、单个颗粒等可视化为视直径约1微米至约3微米的视觉上分开的点。该***也可应用于对均质化（homogeneous）染色（即，分辨率没有达到明显的单个点）的固定化靶标进行可视化。

根据本发明的放大***包括至少一个在水溶液中孵育假定含有靶标的样本的步骤，该水溶液包含：

（i）具有氧化还原酶活性的酶的第一底物；

（ii）该酶的第二底物，以及任选地

（iii）过氧化物化合物，

其中，第一底物是α-氰基-4-羟基肉桂酸（ACHCA）或其衍生物，且第二底物是含有一种或多种能够作为有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物以及可检测标记物的结合物（conjugate）分子。

根据本发明，在上述水溶液中孵育假定包含靶标的样本，使得样本中包含靶标的位点通过结合物分子的沉积而被标记，然而，这仅仅是在靶标包含氧化还原酶活性且靶标固定在样本内或固定在固体支撑物上或固体支撑物内的情况下。固定化靶标可以固有地包含氧化还原酶活性或者其可以通过另一物质与该酶相关联，另一物质为例如包含辣根过氧化物酶（HRP）或大豆过氧化物酶（SP）的靶标特异性结合剂。样本中的靶标通过检测所沉积第二底物的可检测标记物的方式来检测。

因此，在一些实施方式中，本发明的方法可以包括以下步骤：

a）在水溶液中孵育假定含有固定化靶标的样本，该固定化的靶标包含具有氧化还原酶活性的酶，水溶液包含：

（i）该酶的第一底物；

（ii）该酶的第二底物，以及任选地

（iii）过氧化物化合物，

其中，第一底物是α-氰基-4-羟基肉桂酸（ACHCA）或其衍生物，且第二底物是含有一种或多种能够作为有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物以及可检测标记物的结合物分子；

b）检测样本中第二底物的沉积分子的标记物。

在其他实施方式中，本发明的方法可以包括以下步骤：

a）将假定包含靶标的样本与一种或多种结合剂孵育，其中样本或靶标被固定化，其中至少一种结合剂是靶标特异性结合剂且至少一种结合剂包括具有氧化还原酶活性的酶；

b）在水溶液中孵育样本（a），水溶液包含：

（i）该酶的第一底物；

（ii）该酶的第二底物，以及任选地

（iii）过氧化物化合物，

c）检测样本中第二底物的沉积分子的标记物。

术语“任选地”是指过氧化物化合物不是本发明所有实施方式的水溶液中的必要成分：当具有氧化还原酶活性的酶是过氧化物酶时，其是溶液的成分，而当酶是酚氧化酶时，其可以从溶液中去掉。

在其他实施方式中，本发明的方法可以包含一个或多个其他检测步骤，包括使用本发明的放大***或使用其他放大***例如WO2011047680、WO2009036760、WO2010094283或WO2010094284的放大***进行的附加信号放大步骤。

使用本发明放大***的靶标可视化方法适合于（i）将靶标被固定化的样本中的单个靶标实体可视化为分开的染色（或荧光或放射性）点，其中单个点具有约1～约3微米的视直径并对应于单个靶标单元，以及（ii）将靶标可视化为均质化染色（即，不是由多个分开的染色点例如直径1～3微米的点构成）。

本发明的可视化***使得可以使用靶标特异性结合剂的多种组合、多种不同可检测标记物、不同信号放大***的组合、多种酶底物等来在一个样本中检测多种多样的靶标。

本发明的一个方面涉及对根据本发明可视化的靶标进行定量。样本中的单个靶标实体和靶标总量均能够非常精确地进行定量。

本发明的另一方面涉及放大***在医学诊断中作为诊断测定（assay）的一部分的用途。通过本发明方法进行诊断靶标检测及定量的灵敏性和精确度对于分子诊断和搭配诊断以及个性化疗法是非常有价值的。

本发明可视化***的其他优点是其使用（i）无毒、（ii）无色、（iii）明确的（welldefined）、（iv）稳定的和（v）容易得到的化合物。

再一优点是本发明的所有方法均可以手动和自动执行。

具体实施方式

本发明涉及可用于使用多种测定形式（format）对多种样本中固定在例如支撑物上的靶标进行可视化和检测的强大的信号放大***，其中靶标包含氧化还原酶酶促活性。具体而言，本发明的放大***有利于检测复杂组织学样本中的靶标生物学分子。

根据本发明的靶标可视化***包括至少一个在水溶液中孵育假定含有氧化还原酶活性的靶标的步骤，其中靶标固定在支撑物上，且水溶液含有：

i）与靶标相关联的具有氧化还原酶活性的酶的第一底物；

ii）该酶的第二底物，以及任选地

iii）过氧化物化合物，

其中，第一底物是α-氰基-4-羟基肉桂酸（ACHCA）或其衍生物，且

第二底物是含有一种或多种能够作为有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物以及可检测标记物的结合物分子。

在一个实施方式中，本发明涉及用于对样本中假定包含氧化还原酶活性的靶标进行检测的方法，其中靶标和/或样本被固定化，该方法包括以下步骤：

a）在水溶液中孵育假定含有靶标的样本，水溶液包含：

（i）具有氧化还原酶活性的酶的第一底物，

（ii）该酶的第二底物，以及任选地

（iii）过氧化物化合物，

b）检测样本中第二底物的沉积分子的标记物。

在另一实施方式中，用于检测样本中靶标的方法包括以下步骤，其中靶标和/或样本被固定：

a）将假定含有靶标的样本与一种或多种结合剂孵育，其中至少一种结合剂是靶标特异性结合剂且至少一种结合剂包括具有氧化还原酶活性的酶；

b）在水溶液中孵育样本（a），该水溶液包含：

（i）该酶的第一底物；

（ii）该酶的第二底物，以及任选地

（iii）过氧化物化合物，

c）检测样本中第二底物的沉积分子的标记物。

在不同实施方式中，本发明的方法可以包括一个或多个额外步骤，例如洗涤步骤、进一步的靶标检测步骤、其他信号放大步骤例如根据本发明或其他放大***（例如在WO2011047680中记载的放大***）的信号放大步骤或滚环扩增（RCA）***的步骤、使用本领域记载的方法之一例如H&E染色、基于碱性磷酸酶（AP）的染色等对其他靶标进行可视化的步骤。本文描述的放大***可以与领域内开发的可应用的用于将固定化分子靶标可视化的几乎任何的信号放大***进行组合。

本发明的信号放大***以及靶标可视化和检测方法的不同方面和非限制性实施方式描述如下。

样本

术语“样本”是指来自更大整体或群体的代表性部分或单一项，一定量或一部分的假定含有待检测靶标的物质或对象，例如一部分或一定量的包含待分析的靶标分子、颗粒、结构的生物材料、化学材料、环境材料，例如活检样本、食品样本、土壤样本等。典型的样本显示出物质或对象的剩余部分是什么或应该是什么。在一个实施方式中，本发明的样本可以是环境样本，例如土壤样本或溢出物样本。在另一个实施方式中，样本可以是食品样本。在另一个实施方式中，样本可以是有机分子库的一部分。在另一实施方式中，样本可以是战剂（warfare）样本。

在一个实施方式中，本发明的样本是生物学样本。

生物学样本可以示例为：

1.含有悬浮细胞和/或细胞残骸的样本，例如血液样本、克隆细胞的悬浮液、身体组织匀浆等；

2.含有动物体、身体组织、涂片或体液或肿瘤样本（例如活检样本）的完整或破损细胞的样本；其可以是新鲜的组织样本或保存的组织样本，例如***固定石蜡包埋的组织样本；

3.含有活的有机体的样本，例如含有动物、植物、细菌、真菌等的介质的样本；

4.含有病毒颗粒、其残骸或病毒产物的样本，例如含有病毒核酸、蛋白、肽等的身体涂片；

5.含有细胞的细胞器的样本；

6.含有天然或重组的生物学分子的样本，例如血浆样本、条件细胞培养基等。

7.含有植物细胞或其残骸的样本。

生物学样本的上述实例以示例说明的目的给出，但是不限制本发明的实施方式。

化学样本的实例可以通过化学化合物库例如肽库的样本进行示例说明，但是并不限制于此。环境样本的实例可以通过土壤、水或空气样本和食品样本进行示例说明，但是不限制于此。

在一些实施方式中，本发明涉及含有固定化靶标的样本（例如，任何以上实例），即在本发明的可视化和检测过程中靶标不能自由移动的样本，例如靶标移动通过机械或化学方式而大大降低或消除的样本，例如在样本或靶标附着至某个支撑物或介质上或者附着在某个支撑物或介质内的情况，例如组织学样本等。因此，含有目标靶标的单个单元和/或聚集（aggregated）的单独单元的样本可以在检测步骤之前固定到固体支撑物上。本发明的含有固定靶标的样本的实例包括但不限于，新鲜的或保存的（例如，***固定和石蜡包埋的）固定至玻璃玻片或塑料玻片的表面的生物学组织样本，含有固定至膜、ELISA板的生物学分子或化学分子的样本等。在这些实施方式中，样本的靶标可以是固定在样本内，例如固定在组织样本内的蛋白，或者是固定在某些材料的表面或某些材料内，其中某些材料为例如固体材料或凝胶例如硝化纤维膜、胶原蛋白/琼脂糖/石蜡块等的一部分。

在一个实施方式中，本发明涉及不包含靶标的样本，例如对照样本。在另一实施方式中，本发明涉及假定包含靶标的样本，例如具有未知内容物的样本。

上述的术语“固体支撑物”是指，一件在本发明的过程条件下为固体的且化学惰性的任何材料。“化学惰性”在本文中是指所选的支撑物对本发明方法的靶标可视化和检测结果具有最小化影响或完全没有影响。

适合用作固定本发明中样本/靶标的支撑物的材料实例包括但不限于：合成的聚合物支撑物，例如聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯例如胺化的或羧化的聚苯乙烯；聚丙烯酰胺；聚酰胺；聚氯乙烯；玻璃；琼脂糖；硝化纤维；尼龙；聚偏二氟乙烯；表面修饰的尼龙等。可以选择任何适用于固定样本或靶标以及适用于所选的测定形式例如用于IHC、ELISA、印迹（blotting）等的此类惰性支撑物。

靶标

术语“靶标”在本文中是指假定存在于样本中并且可以以特定物理和/或功能特征为特征的目标对象。如果没有明确在文中指明，本发明的术语“靶标”是指样本中目标对象的基本相同实体的整个池（pool），而不是该对象的一个单个实体。本文中的术语“基本相同”是指，样本中全部靶标池的所有或几乎所有单个实体具备使得它们能被认作靶标的一个或多个特征，例如靶标可以是特定蛋白（包括样本中该特定蛋白的所有分子）、特定分子复合物或结构（包括样本中该特定分子复合物或分子结构的几乎所有单元），其可以是病毒或细菌，其中样本中病毒颗粒或细菌体的总群体是靶标。

与对于特定细胞类型、组织、细胞结构、生理条件等为特征性的特征相关的生物学对象，例如分子、分子复合物、结构、颗粒或有机体，通常在领域中被称为这些特定细胞类型、组织、细胞结构或生理条件的“生物学标记物”。这些可以在不同的实施方式中作为本发明靶标的生物学标记物的非限制性实例包括但不限于，核苷酸序列、蛋白或其他生物学分子，例如碳水化合物或脂质、染色体结构或膜结构、病毒、细菌、微生物等。因此，在本发明的一些实施方式中，术语“靶标”与术语“生物学标记物”可互换地使用，其是指对于特定细胞类型、组织、生理条件等为特征性的分子、分子复合物、结构或颗粒，其中，试样中任何后述生物学标记物的总群体被认为是靶标。

在一个实施方式中，靶标可以是蛋白，例如细胞膜受体或胞质蛋白，在另一实施方式中，靶标可以是核酸，例如胞质核酸。在本发明的一些实施方式中，任何后述靶标的衍生物，包括片段、前体、突变体等也可以是是靶标。

因此，在本发明的不同实施方式中，靶标可以是生物学或化学靶标分子、或颗粒、或分子复合物或细胞复合物、或分子结构或细胞结构、或病毒、或微生物，或该靶标分子、颗粒、复合物、结构、病毒或微生物的片段。在包含于化学样本或环境样本中的靶标之中，可以有不同的污染物、毒素、战剂物质、分子库成员、工业非毒性废料化合物等。

在一个实施方式中，本发明涉及如下的靶标，其中靶标是多个单独的基本相同的单元。术语“单元”是指在计算中被视为一体的单一量的靶标，其可以通过定义靶标的物理特征和/或功能特征而鉴定。术语“单独单元”是指单元可从相同种类的其他单元或环境的其他成分中（通过功能的物理特征）分离出来并且可以分开地考虑和计数。术语“单个单元”在本文中是指一个靶标单元，即与许多相反或相对的一个。术语“单独单元”在本文中与术语“单个单元”可互换地使用。例如，靶标蛋白的单个/单独单元在本文中是指靶标蛋白的单个单独分子，即相同种类的多个分子中的一个分子。术语“基本相同的单元”是指，靶标的多个单一单元具有一个或多个使得这些单元被考虑为靶标的特征。术语“独立的”是指靶标的单个单元作为分开的实体存在，且并不依赖于样本中相同种类的其他分开实体的存在。

在一个实施方式中，本发明涉及靶标的单个单元，例如单个靶标分子、单个颗粒等。

本发明在一些实施方式中涉及作为一部分生物学分子的单个靶标单元，其具有允许脱离于相同分子的其他部分考虑该部分分子的特定物理或功能特征，例如靶标蛋白的蛋白水解片段、融合蛋白的一部分、靶标蛋白的特定结构域、核酸的特定结构、表位等。

在不同的实施方式中，多个的单个靶标单元可以由单个单独的生物或化学分子、单个单独的单个颗粒、单个单独的分子复合物或细胞复合物、单个单独的分子结构或细胞结构、或单个单独病毒或单个单独微生物，或该分子、颗粒、复合物、结构、病毒或微生物的单个单独片段来表示。

在一个优选实施方式中，靶标是与癌症相关的生物学标记物，例如激素和生长因子及其受体的核酸和多肽、细胞粘附分子信号转导分子、细胞周期调节分子等，例如包括生长因子PDGF、VEGF、TGF、 HGF或EGF、它们的受体和通路相关分子的群组的基因、RNA和蛋白，与信号转导通路例如JAK/STAT通路或Akt1/PKB细胞存活通路、或5-FU通路相关的基因及其产物，***受体ER及其基因（ERS1）等。本发明的方法使得可以简单快速地对生物学标记物进行可视化和定量。

本发明的方法使得可以对以较宽动态范围存在于样本中的靶标进行可视化和定量。可以在一个样本以及相同样本中对非常高含量以及非常低含量的靶标进行可视化和定量，或者可以在单独的样本中对其进行评估。可以在一个样本或相同样本中对两种或更多种不同的靶标进行可视化，例如，蛋白靶标和核酸靶标，或者两种或更多种不同的蛋白靶标，或者两种或更多种不同的核酸靶标等。

在一个实施方式中，单个靶标单元可以基本均匀地分布在整个样本中，在其他实施方式中，单个靶标单元可以在样本的一部分更大量地出现且在其他部分更少量地出现。在所有的后述实施方式中，可以使用本发明的方法在一个样本或相同样本中对单个靶标单元进行可视化和定量。在一些实施方式中，其中一个目标靶标与另一目标靶标相关联，例如第一靶标和第二靶标以特定分子结合或结构例如受体二聚体存在于样本中，另一目标靶标可以通过对样本中第一靶标进行可视化和定量来可视化和定量，或者两种靶标可以独立进行可视化和定量。

在一些实施方式中，本发明可以涉及单个靶标单元的部分子群，例如存在于样本中的靶标的单个单独单元总数的大部分或小部分。术语“部分子群”在本文中是指等于或小于99%的单个靶标单元的总群体的一部分，例如等于或小于样本中单个靶标单元总量的90%，例如小于85%，例如75～80%的样本中靶标单元的总量，例如小于75%，例如样本中单个靶标单元总量的1%～50%，例如样本中靶标单元总量的1%～25%等。由50%～99%的总群体表示的部分子群单个靶标单元根据本发明定义为存在于样本中的单个靶标单元的大部分。由小于50%的样本中单个靶标单元的总群体表示的部分子群根据本发明被定义为存在于样本中的单个靶标单元的小部分。

在一个实施方式中，大部分的单独单个靶标单元可涉及本发明的离散单个靶标位点的形成；在另一实施方式中，小部分的单独单个靶标单元可涉及本发明的离散单个靶标位点的形成。在一个实施方式中，当靶标或单个靶标单元以非常低的量存在于样本中时，可以优选基本所有的单独单个单元均涉及本发明的单个结合位点的形成。本发明的单个结合位点是含有固定化靶标的样本或支撑物的位点，其中靶标固有地包含有氧化还原酶酶促活性或者与包含该酶促活性的物质（agent）相关联。

在一个实施方式中，靶标可以是具有固有的氧化还原酶酶促活性的分子、结构、颗粒、微生物（等），例如过氧化物酶例如HRP等。在另一实施方式中，靶标可以是不具有该酶促活性的化合物、分子、结构、颗粒、微生物（等）。在后述实施方式中，根据本发明的靶标可以被该酶促活性标记，例如借助包含氧化还原酶活性的结合剂。

结合剂

在一些实施方式中，本发明的靶标可视化方法可以包括将假定含有靶标的样本与一种或多种结合剂孵育的步骤，其中（i）至少一种结合剂能够识别并特异性地结合至靶标，（ii）至少一种结合剂包含氧化还原酶活性。

术语“结合剂”在本文中是指能够直接且特异性地结合至样本中其结合配偶体（例如结合至靶标分子、另一结合剂、半抗原等）的分子或另一种物质例如颗粒。术语“特异性地”是指结合剂对其结合配偶体具有特异亲和性。术语“直接地”是指结合剂在相互作用时与其特定的结合配偶体相互作用并形成直接的键合。相反地，术语“间接地”在本文中涉及相互间不具有特异亲和性的两种物质之间的特定相互作用，且它们的相互作用由其他试剂介导，其中至少两种该试剂是特异结合对的成员。示出本发明的间接结合的一个实例可以是含有靶标蛋白分子、与靶标蛋白结合的一抗以及与一抗结合的二抗的复合物。在该复合物中，根据本发明，二抗间接地与靶标蛋白作用。

能够直接并特异性地结合样本中靶标的结合剂在本文中被称为“第一结合剂”；能够直接并特异性结合至第一结合剂或结合至直接与靶标相关联的物质的结合剂在本文中称为“第二结合剂”。根据本发明的靶标可视化***可以包含多个可以间接结合至靶标的结合剂，例如第三、第四和其他结合剂。在一些实施方式中，第一结合剂或其他实施方式中的第二或第三结合剂可以用来接触样本识别靶标，结合至靶标并与其形成复合物。在一些实施方式中，第一或第二结合剂可包含本发明的酶促活性并且可以通过该酶促活性标记靶标。第三和其他结合剂也可以包含酶促活性并且可用在本发明方法的其他步骤中，例如检测靶标位点处的可检测结合物分子的沉积等。在一些实施方式中，第二、第三和其他结合剂用来放大、改变或降低与靶标相关的信号。

在优选实施方式中，本发明结合剂是不同的特异性结合对的成员。

本领域中已知众多不同的特异性结合对，它们是能够特异性相互结合的成对的两种不同分子。适用于实践本发明的特异性结合对的成员可以是免疫型或非免疫型的。

非免疫特异性结合对包括其中两种组分相互共有天然亲合力但不是抗体的体系。示例的非免疫结合对是生物素-抗生物素蛋白或生物素-链酶亲和素、叶酸-叶酸结合蛋白、互补核酸、受体-配体等。本发明也包括相互形成共价键的非免疫结合对。示例的共价结合对包括巯基反应基团（如马来酰亚胺）和卤乙酰基衍生物和胺反应基团如异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤，以及如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙（MBTH）和3-(二甲基-氨基)苯甲酸（DMAB）的偶合染料等。

免疫特异性结合对可以示例为抗体-抗体体系或半抗原-抗半抗原体系。在一个实施方式中，本发明的免疫特异性结合对可以是含有两种或更多种相互有亲和性的抗体分子的抗体-抗体结合对，例如一抗和二抗对，其中一抗代表第一结合剂且二抗代表第二结合剂；含有3种或4种或更多种抗体成员的抗体体系可以用在另一实施方式中。在本发明的其它实施方式中，免疫结合对可以由半抗原-抗半抗原体系代表。在这些实施方式中，第一结合剂可以由含有对靶和半抗原具有亲合力的分子的结合物（例如与半抗原连接的一抗或核酸序列）代表，并且第二结合剂可以由抗半抗原抗体代表。

术语“半抗原”意指一种小分子，其中可以将所述小分子视作对其可产生抗体的孤立表位，尽管如果注入动物中，半抗原单独不会引起免疫反应，它必须与载体（通常是蛋白质）结合。由于半抗原是小分子，故多个拷贝的半抗原可以连接至大分子，例如聚合物分子，如蛋白质、核苷酸序列、葡聚糖等。在信号放大是必需或有利的情况下，半抗原可以充当测定模式的便利标记物分子。因此，结合的多拷贝半抗原提供了增强的灵敏度，例如增加的信号强度。合适半抗原的非限定实例包括荧光素（FITC）、2,4-二硝基酚（DNP）、myc地高辛（DIG）、酪氨酸、硝基酪氨酸生物素和染料，例如四甲基罗丹明、德克萨斯红（Texas Red），丹磺酰（dansyl）、Alexa Fluor488、BODIPY FL、萤光黄和Alexa Fluor405/Cascade Blue荧光团，记载在US20080305497中的半抗原也可以用于本发明的目的。

如本文中所用的术语“抗体”意指免疫球蛋白或其部分，并且包括含有抗原结合位点的任何多肽，无论其来源、产生方法和其它特征是什么。该术语包括，例如多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体和CDR-移植抗体。抗体部分可以包括仍能结合抗原的任何片段，例如Fab、F(ab’)₂、Fv、scFv。抗体的起源由基因组序列限定，无论产生方法是什么。

在本发明的上下文中，一抗是指与靶标特异性结合，更具体地是与样品的单个靶标单元特异性结合，例如与单个靶标分子特异性结合的抗体结合剂，例如整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如含有抗体的结合物或聚合抗体。在一些实施方式中，一抗可以是能够与不同靶标的两个（或更多）单个单独单元结合的二价抗体，例如能够与受体二聚物例如Her2/Her3二聚物结合的抗体。在这个实施方式中，本发明的单个靶标单元可以是单个Her2/Her3二聚物，并且该靶标可以是样品中的Her2/her3二聚物群，其包括该样品中的全部所述二聚物。一抗可以源自任何温血物种，例如哺乳动物、鸟类。

在本发明的上下文中，二抗是指具有下述抗原结合结构域的抗体结合剂，例如整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如含有抗体的结合物或聚合抗体，其中所述抗原结合结构域与一抗、或在靶标部位处沉积的半抗原、或与一抗或另一结合剂直接或间接连接的半抗原特异性结合。

在本发明的上下文中，三抗是指包括下述抗原结合结构域的抗体结合剂，例如整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如含有抗体的结合物或聚合抗体，其中所述抗原结合结构域与二抗或连接至二抗的半抗原或连接至聚合物（其与二抗结合）的半抗原或在靶标部位处沉积的结合物分子的半抗原特异性结合。

有时，抗体可以同时充当二抗和三抗。

在本发明中使用的抗体，包括一抗、二抗和三抗，可以得自于任何哺乳类物种，例如大鼠、小鼠、山羊、豚鼠、驴、兔、马、美洲驼、骆驼或任何鸟类物种例如鸡、鸭。如本文中所用的，源自任何哺乳物种或鸟类物种，意指编码特定抗体的核酸序列的至少一部分源自特定哺乳动物（例如大鼠、小鼠、山羊或兔）或特定鸟（例如鸡、鸭）的基因组序列。抗体可以是任意同种型（isotype），例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或任何亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

在某些实施方式中，一抗包含能够特异性结合由生物学样本的细胞表达的生物学标记物特别是该生物学标记物的单个单独单元的抗原结合区域。标记物可以表达在细胞表面上或表达在细胞膜内，即在细胞的内部，例如在胞质内、在内质网内等。在一些实施方式中，生物学标记物可以从细胞提取，因此其存在于无细胞的介质中，例如在水溶液中，或者其是存在于细胞培养介质、血浆、脑脊液等中的可溶分子。对应样本的实例如上所述。

在某些实施方式中，二抗包含特异性结合一抗例如结合至一抗的恒定区域的抗原结合区域。在某些实施方式中，二抗可以与聚合物结合。在一些实施方式中，2～20个二抗，例如5～15个二抗可以与聚合物结合。在其他实施方式中，聚合物可以与1～10个二抗结合，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个二抗。

在某些实施方式中，三抗可以包含特异性结合二抗例如结合至二抗的恒定区、或结合至与二抗连接的半抗原、或结合至与二抗结合的聚合物的抗原结合区域。在某些实施方式中，三抗结合至聚合物。在一些实施方式中，1～20个三抗可以结合至聚合物。在其他实施方式中，1～5个三抗，例如1、2、3、4或5个三抗可以与聚合物结合。

在一些实施方式中，可以优选包含结合剂的单个结合单元的聚合物，例如与一个分子的一抗、二抗或三抗结合的聚合物。

可用于本发明目的的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，工程抗体包括嵌合抗体、CDR接枝抗体和使用噬菌体展示或可选技术制造的人工选择抗体。

可以通过本领域熟知的多种方法中的任何一种来制造本发明的抗体结合剂，例如根据Harlow and Lane,Antibodies:a Laboratory Manual,(1998)(Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY)。用于制备重组抗体分子的技术在上述文献和多个其它文献例如EP0623679、EP0368684和EP0436597中有过描述。可以从cDNA库中分离编码抗体的核酸。可以从噬菌体库中分离编码抗体的核酸（参见例如McCafferty等人1990,Nature348:552,Kang等人1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4363;EP0589877B1）。可以通过已知序列的基因改组而获得编码抗体的核酸（Mark等人1992,Bio/Technol.10:779）。可以通过体内重组而分离编码抗体的核酸（Waterhouse等人1993,Nucl.Acid Res.21:2265）。用于本发明方法中的抗体包括人化的免疫球蛋白（参见U.S.5,585,089，Jones等人1986,Nature332:323）。可以以任何可能的方式改变本发明的抗体，假定它们保持它们的结合亲和性，例如它们可以与效应蛋白、毒素、标记物等融合。抗体与不同试剂结合的方法也在领域内熟知并在本发明以下的示例性实施方式中描述。

在本发明的一个实施方式中，抗体结合剂由Fab区域表示。

在一个实施方式中，抗体结合剂可以是包括两种或更多种不同抗体结合剂的组合物，例如包括第一抗体结合剂和第二抗体结合剂的组合物，其中该两种或更多种不同抗体剂具有不同的免疫结合对。在一个实施方式中，在组合物中，两种或更多种不同抗体结合剂中的至少一种是能够与靶标特异结合的抗体，且至少一种其它结合剂是包括酶的抗体。

在另一实施方式中，本发明涉及作为非免疫特异结合对的成员的结合剂，例如互补的核苷酸序列或核酸类似分子。

含有核酸或核酸类似分子例如DNA分子、RNA分子、PNA分子的结合剂可以用于对核酸靶标的单个单独单元进行可视化和定量。

用作本发明目的的结合剂的核酸序列可以化学合成或在重组细胞中产生。两种产生模式在领域内均公知（参见，例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Press）。在一些实施方式中，核酸结合剂可以包括肽核酸（PNA）。肽核酸是如下的核酸分子，其中通常存在于DNA和RNA中的脱氧核酸或核糖骨架（backbone）被肽骨架替换。制作PNA的方法在领域内已知（参见，例如Nielson,2001,Current Opinion in Biotechnology12:16）（并入本文以供参考）。在其它实施方式中，结合剂可以包括锁核酸（LNA）（Sorenson等人2003,Chem.Commun.7(17):2130）。

在一些实施方式中，核酸结合剂可以包括至少一个寡核苷酸序列或至少一个聚核苷酸序列，其在特定的严格条件下与生物样品中靶标序列的单个单元（例如，单个mRNA序列）特异杂交。本文中使用术语“在严格条件下的杂交”来描述杂交的条件，在该条件下，显著地相互互补例如至少70%、至少80%、至少85～90%互补的核苷酸序列保持相互结合。如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402（并入本文以供参考）中所述的确定互补百分比。

指定的严格条件在领域内已知，并可以在Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.(Ausubel等人1995eds.),第2、4和6节（并入本文以供参考）中找到。此外，在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nded.Cold Spring Harbor Press,第7、9和11章（并入本文以供参考）中描述了指定的严格条件。在一些实施方式中，杂交条件为高度严格的条件。高度严格的杂交条件的实例是在65～70℃下在4×氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中的杂交或是在42～50℃下在4×SSC加50%甲酰胺中的杂交，之后在65～70℃下在1×SSC中洗涤一次或多次。应理解的是，其它的试剂可以添加到杂交和/或洗涤缓冲液中，例如，封闭剂（BSA或鲑鱼***DNA）、洗涤剂（SDS）、螯合剂（EDTA）、聚蔗糖、PVP等。

在一些实施方式中，结合剂可以在中等严格的条件下与样品中的靶标序列杂交。本文中使用的中等严格包括能够由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度而容易确定的条件。例示的条件在Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ded.Vol.1,pp.1.101-104,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)（并入本文以供参考）中记载，包括使用5×SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA（pH8.0）的预洗液，42℃下50%甲酰胺、6×SSC的杂交条件（或其它类似的杂交液，例如Stark溶液，在50%甲酰胺中，42℃），以及60℃、0.5×SSC、0.1%SDS 的洗涤条件。

在一些实施方式中，结合剂在低等严格的条件下与样品中的靶标序列杂交。本文中使用的低等严格条件可以包括能够由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度而容易确定的条件。例如，低等严格可以包括在含有35%甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl（pH7.5）、5mMEDTA、0.1%PVP、0.1%聚蔗糖、1%BSA和500μg/ml变性的鲑鱼***DNA的溶液中于40℃对DNA预处理6小时。在具有以下改变的相同溶液中进行杂交：使用0.02%PVP、0.02%聚蔗糖、0.2%BSA、100μg/ml鲑鱼***DNA、10%（wt/vol）硫酸葡聚糖和5～20×10⁶CPM结合剂。于40℃在杂交混合物中孵育样品18～20小时，之后在含有2×SSC、25mM Tris-HCl（pH7.4）、5mM EDTA和0.1%SDS的溶液中于55℃洗涤样品1.5h。使用新鲜溶液替换洗涤液并将其于60℃再孵育1.5h。

在其它实施方式中，本发明可以涉及结合剂，其为源自非抗体蛋白的肽序列或包括该肽序列，例如源自不同蛋白的核酸结合域、不同细胞和核受体的配体及其衍生物的肽序列。这些结合剂的一些非限制性实例可以是能够与抗体恒定区结合的补体级联的经典通路的c1q蛋白，MHC分子例如I类MHC和II类MHC和非常规MHC，具有特异结合配偶体的分子例如涉及细胞信号通路的分子例如具有亮氨酸拉链结构域的分子，例如fos/jun、myc、GCN4，具有SH1或SH2结构域的分子，例如Src或Grb-2；免疫球蛋白受体，例如Fc受体；嵌合蛋白，即工程制备为将两种或更多种特异结合配偶体的特征结合的蛋白，例如亮氨酸拉链可以被工程化为抗体的Fc区，SH2结构域可以被工程化为在抗体的Fc区中表达。在其它实施方式中，融合蛋白可以被工程化为包括具有取代的可变结构域的抗体Fc部分。

结合剂也可以是能够与生物大分子的某些结构单元特异结合的小分子。

在一些实施方式中，结合剂可以包括可检测的标记物，例如，荧光物质、半抗原、酶等。在一个实施方式中，本发明涉及标记的结合剂，即标记的第三结合剂或其他结合剂，其能够特异性地结合所沉积的可检测分子并用于本发明的靶标位点的可视化。在一个实施方式中，本发明涉及含有酶标记物的结合剂。合适的酶标记物的非限制性实例可以是辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶（GAL）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶、葡糖氧化酶（GO）。在一个实施方式中，结合剂可以包含HRP作为标记物。在另一实施方式中，结合剂可以包含AP作为标记物。

在一些其他实施方式中，可以优选与本发明的酶结合的相对小分子的结合剂，例如，与酶例如HRP的一个或两个或更多个部分结合的抗体的分离Fab片段。这些结合剂是较紧凑的分子，且其可以有利于检测被周围的其它分子“隐藏”或掩盖在靶标或样本中的单独靶标单元；可能隐藏在靶标分子内的单个目标靶标结构；可能在复杂的生物学样本包括细胞中难以接触到的单个病毒颗粒。使用这些结合剂以降低结合剂对样本中靶标不相关对象的非特异性结合也是有利的。在一个实施方式中，使用小的结合剂构建体作为第一结合剂（其中Fab片段得自多克隆抗体）或第二结合剂（Fab片段得自多克隆二抗），具体例如(Fab)₁-(HRP)₁，对于检测以非常低的含量（即，通过采用酶介导的染料沉积的任何其他领域内已知的可视化方法检测不出的含量）存在于样本中的靶标可能是有利的。使用这些Fab结合剂使得可以将结合剂多重特异性地结合至样本中它们的结合配偶体，同时，可以用多个酶标记物大量标记它们的结合配偶体。这样可以显著增强在含有多个酶标记物的样本部位处的报告物沉积。

在其他实施方式中，使用较大的结合剂构建体可能是有利的，例如含有与多个特异性结合剂（例如，抗体）化学连接以及任选地与一种或多种标记物化学连接的核聚合物的结合物分子。两种构建体均可以提高特异性靶标染色的水平并降低非特异性染色。此外，含有结合剂以及数十至数百个酶部分的较大结合物，在例如关注于非常快速的靶标检测或需要获得每单独靶标位点的较大沉积的情况下可能是有利的。当靶标以非常低的量存在于样本中时，也可推荐使用这些构建体。

形成本发明靶标位点所必需的结合剂的量可以根据不同因素而变化，例如样本种类、靶标种类、结合剂种类、结合剂的结合亲和性等。使用常规普遍的知识，本领域技术人员可以选择合适的结合剂并确定各个特定实施方式所需的量。在一些实施方式中，可优选调节形成靶标位点的结合剂的量，从而使并非所有存在于样本中的单个靶标单元而是其部分子群参与形成本发明的靶标位点，例如在样本包含大量靶标或以宽泛的动态浓度范围存在的靶标的实施方式中。在其他实施方式中，可以优选所有或基本所有的单个靶标单元参与形成本发明的靶标位点，例如在样本具有非常低的靶标表达或单个靶标单元的表达的情况下。在后述的实施方式中，可以优选所使用的结合剂的量将保证由样本的基本大部分单独单个单元形成结合位点，即基本大部分所存在的单个靶标单元将参与靶标位点的形成。

酶

根据本发明，样本中的靶标通过在含有固定化靶标的样本位点上沉积具备氧化还原酶活性的酶的可检测底物而进行可视化，其中该位点含有该酶。

根据本发明的酶是具有氧化还原酶活性的酶（在本文中可互换地称为“氧化还原酶”或“本发明的酶”）。

术语“具有氧化还原酶活性的酶”是指在酶的EC编号分类中被分类为EC1的酶，其催化电子从一个分子（还原剂，也称为氢或电子供体）转移至另一分子（氧化剂，也称为氧或电子受体）。在优选实施方式中，本发明涉及被分类为E1.10.（酚氧化酶）和E1.11.（过氧化物酶）的氧化还原酶。

在一个优选实施方式中，本发明涉及酚氧化酶，特别是含铜氧化酶家族，漆酶（E1.10.3.2）。漆酶作用于酚和类似分子，进行单电子氧化。漆酶通过促进木质醇（天然出现的酚的家族）的氧化耦合而在木质素形成中发挥作用。适用于本发明目的的漆酶可以是例如由Phillips LE和Leonard TJ（Benzidine as a Substrate for MeasuringPhenoloxidase Activity in Crude Cell-Free Extracts of Schizophyllumcommune.Mycologia1976,68:277-285）、或Kunamneni A,Plou FJ,Ballesteros A,AlcaldeM.（Laccases and their applications:a patent review.Recent PatBiotechnol.2008,2(1):10-24）、或Rodriguez Couto S,Toca Herrera JL （Industrialand biotechnological applications of laccases:a review.Biotechnol Adv.2006,24(5):500-13）描述的酶。

在本文中使用术语“漆酶”来指代一种本发明的具有酚氧化酶活性的酶，然而应该理解的是，漆酶是适用于本发明目的的酚氧化酶的很多实施方式中的一个。

漆酶属于氧化酶家族，其需要氧作为酶作用的第二底物。当酶是漆酶时，在一个实施方式中，用于本发明沉积反应的氧源可以是存在沉积介质中的过氧化物化合物，在另一个实施方式中，其可以是存在空气中的氧。

在另一优选实施方式中，本发明涉及催化以下形式的反应的过氧化物酶酶促活性：

ROOR’+电子供体（2e-）+2H⁺→ROH+R’OH。

在本发明的一个优选实施方式中，具有过氧化物酶活性的酶是辣根过氧化物酶（HRP）。在本发明的另一个实施方式中，具有过氧化物酶活性的酶是大豆过氧化物酶（SP）。

在氧化还原酶是过氧化物酶的实施方式中，根据本发明的沉积介质包含过氧化物化合物。

对于一些过氧化物酶，最佳底物是过氧化氢，一些其他的过氧化物酶对有机的氢过氧化物例如有机过氧化物更有活性。电子供体的特性在很大程度上依赖于酶的结构，例如辣根过氧化物酶（HRP）可以利用多种有机化合物，同时作为电子供体和电子受体。HRP具有可接近的活性位点，很多化合物可以触及反应位点。

酶促活性，即氧化还原酶活性，例如酚氧化酶或过氧化物酶活性可以由与结合剂分子直接或间接连接的全长酶分子、或混有酶促活性的酶片段（例如51%～99.9%的全长酶分子，或少于51%，例如40%、30%以下）表示。

根据本发明，结合剂可以与一个或更多个酶部分直接或间接结合（本文中的术语“部分（moiety）”意指能具有氧化还原酶活性的部分酶分子，它包括整个或基本上整个的酶分子以及任意大小的所述分子的仍可具有氧化还原酶酶促活性的部分）。全部结合剂或者第一结合剂和/或第二结合剂、第三结合剂等的分子可以与氧化还原酶的一个或数个功能活性部分结合。在一个实施方式中，第一结合剂的至少一个分子可以与可具有氧化还原酶活性的一个或多个酶促部分结合；在另一实施方式中，第二结合剂的至少一个分子可以与一个或多个这些部分结合。术语“直接结合”是指酶部分通过化学键连接至结合剂分子。术语“间接结合”是指酶的部分通过连接分子与结合剂分子相关联，连接分子与结合剂具有化学键且与酶具有化学键。结合生物学分子和连接分子的方法为领域内熟知并在以下示例。

在一个实施方式中，氧化还原酶的部分是HRP的部分，例如能具有HRP酶促活性的HRP全分子或其片段，其也可以是含有HRP的具备酶促活性的部分的重组蛋白等。在另一个实施方式中，氧化还原酶的部分可以是大豆氧化还原酶（SP）的部分。在另一个实施方式中，氧化还原酶的部分可以是漆酶的部分。

包括具备氧化还原酶活性的酶的结合剂的非限制性实例可以是抗体分子或其衍生物，例如与一个或多个HRP部分结合的Fab片段，以及与HRP结合的核酸结合剂等。这些结合剂可以直接或间接地结合至单个靶标单元，例如单个靶标分子，并由此形成复合物，其中单个复合物包含靶标的单个单独单元以及一种或多种结合剂，其中一种或多种结合剂包括具有氧化还原酶活性的酶。

在一个实施方式中，结合剂可以是含有过氧化物酶或本发明的另一种酶的一个、或两个或更多个部分的结合物，其中该部分与结合剂（例如与HRP的一个或更多个部分结合的抗体分子）连接。在另一个实施方式中，结合剂可以是含有间接地与结合剂连接的两个或更多个具有过氧化物酶活性的酶（例如HRP的两个或更多个部分）的结合物，例如一个或更多个抗体分子和一个或更多个HRP部分独立地与骨架聚合物连接的结合物。

每分子结合剂的HRP数量可以为每结合剂1个酶部分至每结合剂20～50个酶部分或更多。在一些实施方式中，可以优选使用这样的结合剂，其中每结合剂的HRP部分数目是至少2个，优选每结合剂2个至25个酶部分，例如在3个和20个之间，如4、5、6、7、8、9、10个等。可以优选使用每结合剂的酶部分数量是2或更多的结合剂，其中期望将样本中的靶标可视化为分开的点（例如具有颜色、荧光或放射性的点）。在一些实施方式中，可以优选使用含有每结合剂多于4个（优选为5～20，例如5～15）酶部分的结合剂。具有多于4个酶部分的结合剂有利于形成可以可视化为基本上相同大小的视觉上分开的点的靶标位点。在一些实施方式中，可优选基本上所有与酶相关联的结合剂分子相对于每分子包含大约相同数量的酶部分，例如每结合剂分子4～6、5～7、6～8、7～9、8～10等，例如每抗体分子4～6或6～8个HRP部分。根据本发明的结合剂也可以包含不同氧化还原酶的部分的组合。

固有地含有氧化还原酶活性的单个靶标单元、或（直接或间接）结合至含有具备氧化还原酶活性（例如过氧化物酶活性）的酶的结合剂的单个靶标单元，构成本发明的单个靶标位点。在一个实施方式中，本发明的单个靶标位点可以包括单个靶标单元、至少一种第一结合剂和至少一种第二结合剂，其中该至少一种第二结合剂与具有过氧化物酶活性的一个或更多个酶例如HRP结合。在另一个实施方式中，单个靶标位点可以包括单个靶标单元、至少一种与半抗原结合的第一结合剂和半抗原抗体，其中半抗原抗体与具有过氧化物酶活性的一个、两个或更多个酶例如HRP结合。在另一个实施方式中，靶标位点可以包含单个靶标单元和含有氧化还原酶活性的第一结合剂例如HRP的一个或更多个部分。本发明的靶标位点可以包括（任意上述的）单个靶标单元与任何上述结合剂的任何组合，其中该组合包含氧化还原酶活性，例如过氧化物酶活性，例如HRP。

在一个实施方式中，本发明的单个靶标位点可以是包含具备本发明酶促活性的单个靶标单元的固体支撑物的单个位点（任意上述）。如上所讨论的，在一些实施方式中，氧化还原酶可以自身是靶标，因此，固定在固体支撑物上或固体支撑物内的氧化还原酶例如HRP、SP、漆酶等可以是本发明的靶标位点。

酶底物

为了使固有地含有氧化还原酶活性或与氧化还原酶活性相关联的靶标可视化，在含有与本发明靶标位点相关联的酶的第一底物、以及酶的第二底物的水溶液中孵育含有这些靶标的样本。

根据本发明的与靶标位点相关的酶的第一底物是α-氰基-4-羟基肉桂酸（ACHCA）（I）

（I），或其衍生物。

本发明利用ACHCA形成稳定自由基的能力，稳定的自由基可以在具备氧化还原酶活性的酶的存在下（例如在靶标位点处辣根过氧化物酶（HRP）的存在以及沉积介质中过氧化物化合物的存在下）交联第二底物的分子（如下记载），并在单个靶标位点（即，在与酶相关的靶标的周围）沉积第二底物的交联分子。

本发明也涉及ACHCA的衍生物，其中术语“衍生物”是指通过将ACHCA的一个以上原子替换为其他原子而得自于或可得自于ACHCA并且具备作为第一底物所必需的ACHCA的基本上所有特征的化合物，具体地，化合物在本发明的条件下（1）是水溶性富电子有机化合物，（2）能够在和与靶标相关联的酶进行反应时生成自由基，以及（3）能够交联该酶的第二底物的水溶性分子，从而产生该第二底物的水不溶性聚合产物。

为在本发明的条件下产生第二底物的沉积，水溶液中ACHCA的含量可以为约0.15mM至约30mM以上，例如约0.5mM～约1mM，约1.5或约1.75mM，约2mM，约2.5mM，约3mM，3mM～4mM，4mM～5mM，5mM～6mM，6mM～7mM，7～8mM，8mM～9mM，9～10mM，10mM～11mM，11mM～12mM，12mM～13mM，13mM～14mM，14mM～15mM，15mM～20mM，20mM～30mM，30mM～50mM（包括所有上述区间的两端点以及任何其中的值）。在一个优选实施方式中，ACHCA的含量可以在约0.75mM～约5.75mM的范围内。术语“约”在当前上下文中是指+/-0.05～0.5mM。这些含量提供第二底物的较慢的沉积，并使得可以在单个靶标位点形成较大沉积，沉积可以在样本中可视化为直径为约1～约3微米的点。术语“约”在当前上下文中指+/-0.05～0.5微米。在另一个实施方式中，ACHCA的含量可以在约5.85mM～约30mM以上的范围内，例如在30mM和50mM之间。这些含量的ACHCA促进沉积反应（即第二底物的沉积形成）加速，并且在单个靶标位点不能形成第二底物的非常大的沉积。在这种情况下，第二底物的沉积被可视化为与通过使用领域内熟知的基于HRP或AP的可视化***而得到的常规组织学染色相似的均质化染色（homogeneous stain），然而具有显著增加的染色明晰度。

当结合物包含显色、荧光或发光（luminescent）标记物时，第二底物的沉积可以通过视觉手段例如显微光学而可直接检测。在其他实施方式中，例如当结合物包含特异结合对的成员或放射性化合物作为可检测标记物时，可以在沉积之后的步骤中检测所沉淀的第二底物。在两种情况下，第二底物的沉积将向观测者“报告”沉积位点处靶标的存在。所以，本发明的第二底物分子在本文中可互换地称为“报告物”。

本发明的酶的第二底物是含有一个或更多个能够充作该酶的底物的化合物以及可检测标记物的结合物分子，其中可检测标记物选自：荧光化合物、发光化合物、放射性化合物或显色化合物或特异结合对的成员。

作为本发明第二底物的结合物分子具有以下特征：

1.其为水溶性；

2.在环境中不存在具备氧化还原酶活性的酶（过氧化物酶）的情况下，不从含有ACHCA（和含有过氧化物化合物）的水溶液中沉淀；

3.在具有氧化还原酶活性的酶（过氧化物酶）的存在下，不从不包含ACHCA（但是包含过氧化物化合物）的水溶液中沉淀出；

4.在环境中存在氧化还原酶活性（过氧化物酶）的情况下，从含有ACHCA（和过氧化物化合物）的水溶液中沉淀出。

因此，本发明涉及这样的第二底物，其是能够由下式（II）：

(Y)n-L-(Z)m

表示的水溶液结合物分子，

其中

Y是能够作为具备氧化还原酶活性的酶的底物的部分；

Z是可检测标记物；

L是连接化合物或键；

其中，

n是1～150的整数，且

m是1～150的整数。

在一些实施方式中，本发明的水溶性结合物分子可以额外地包含可以增强其特性的部分，例如改善其作为标记物或酶底物的能力，或增加/降低其水溶性。

在一个优选实施方式中，Y选自下式（II）的化合物：

其中，

R1是-H、-O-X、N(X)₂或-S-X；

R2是-H、-O-X、-N(X)₂或-S-X；

R3是-H、-OH、-NH₂或-SH；

R4是-H、-O-X、-N(X)₂或-S-X；

R5是-H、-O-X、N(X)₂或-S-X；

R6是-CON(X)₂或CO-X，

其中，

H是氢；

O是氧；

S是硫；

N是氮；且

X是H、烷基或芳基。

一个优选实施方式是，结合物包含至少两个式（ii）的化合物Y。

在一个实施方式中，至少两个化合物Y是相同的式（ii）化合物。在一个实施方式中，至少两个化合物Y是不同的式（ii）化合物。

优选地，由式（ii）定义的残基Y通过基团R6与连接物L连接。

在一个实施方式中，至少一个化合物Y是阿魏酸的残基或其衍生物。适合作为本发明Y化合物的其他化合物的非限制性实例在实施例中记载。

在一个优选实施方式中，结合物包含2至4个化合物Y。在一个优选实施方式中，结合物可以包含2～4个阿魏酸的残基或其衍生物的残基，例如2、3或4个残基。在一个实施方式中，结合物的所有化合物Y均是阿魏酸的残基。

在一些实施方式中，Y化合物的数量可以高于4，例如5～10、10～15、15～20、20～50、50～100或100～150个化合物。

根据本发明，Y化合物位于结合物分子中作为一个组，优选归组为每组2至4个Y化合物（即，含有多于4个Y化合物的结合物可以包括多个的2至4个Y化合物的组，其中在结合物分子中通过一组原子例如以与5～30个或更多个互相连接的原子对应的分子距离隔开所述组）。优选地，这些组中的2至4个Y化合物通过间隔化合物（spacer compound）而连接在一起，该间隔化合物在两个相邻的Y残基之间提供不长于5～15个互连原子的距离，例如5～10、6～12、7～13、8～14、9～15等。例如，2～4个Y化合物可以与构成含有2至4个氨基酸残基（例如赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸残基等）的肽链的氨基酸连接，其中Y化合物与肽的氨基酸残基的反应性基团连接，例如与赖氨酸残基的ε-氨基连接。2至4个化合物Y还可以通过含有多个分支点的其它短聚合物彼此连接，其中这些分支点之间的分子距离对应于不超过3～7个原子（优选3～5个原子）的链，其中Y化合物可以与所述分支点直接或间接连接。2至4个化合物Y还可以归组在一起与非聚合物分子结合，其中该非聚合物分子具有允许连接任何2至4个Y化合物的2至4个反应基团。Y化合物的这种归组定位在下文中称为结合物分子的“Y-头（Y-head）”。

结合物分子中多个（至少2个）Y化合物的较近间隔具有的作用是，结合物在环境不存在具备氧化还原酶活性的酶的情况下在含有过氧化物化合物和ACHCA的水溶液中保持可溶性，并在溶液与酶接触时从这些溶液中非常快速地沉淀。这与包含单个Y化合物或包含数个在结合物分子中未浓集形成Y头的Y化合物的结合物相反。这些化合物沉淀更慢，并且可能不足以在靶标位点提供大量和较明晰的沉积（可视化为较明晰的均质化染色或直径约为2～3微米的（颜色、荧光或放射性）清楚的点）。

在一个优选实施方式中，Y头包含2至4个通过短聚合物（例如短的PNA分子或短肽）连接在一起的Y残基，其中肽优选包含赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸和/或半胱氨酸残基。然而，包括15个或更少原子且可以与至少两个Y残基和连接物L结合的任何其它聚合或非聚合的水溶性分子可以是合适的。

结合物分子的可检测标记物可以是可视觉检测的任何物质，例如荧光性或发光的物质，或是可通过使用一些检测手段检测的任何物质，例如，放射性标记物、特异性结合对的成员，例如核酸序列、半抗原等。

任何荧光性、发光性、生物发光性或放射性分子可以用作标记物。它们中的许多是商业可得的，例如荧光染色剂Alexa Fluors（Molecular Probes）和DyLight Fluors（Thermo Fisher Scientific）。荧光标记物的其它非限定实例可以是以下分子：5(6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5(6)-甲酰氨基己酸、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、Cy2、Cy3、Cy5、AMCA、PerCP，R-藻红蛋白（RPE）、别藻蓝蛋白（allophycoerythrin，APC）、德克萨斯红、普林斯顿红（Princeton Red）、绿荧光蛋白（GFP）包覆的CdSe纳米微晶、钌衍生物、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、1,2-二氧杂环丁烷（1,2-dioxetane）和吡啶并哒嗪（pyridopyridazine），氢、碳、硫、碘、钴、硒、氚或磷的放射性同位素。染色标记物的一些非限制性实例记载在实施例中。

在一些实施方式中，可检测标记物可以是酶。适合的酶标记物的非限定实例可以是碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶（GAL）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫萤光素酶、葡萄糖氧化酶（GO）。

在其它实施方式中，可检测标记物可以是特异性结合对的成员，例如半抗原。作为适合的半抗原的非限定实例，可以提到2,4-二硝基酚（DNP）、地高辛（digoxiginin）、荧光素、德克萨斯红、四甲基罗丹明、硝基酪氨酸、乙酰氨基芴（acetylaminoflurene）、三硝基苯酚汞（mercury trintrophonol）、***、溴脱氧尿苷（bromodeoxy uridine）、二甲氨基萘磺酸酯（丹磺酰）、氨基酸酪氨酸、丝氨酸等。作为适合的特异性结合对的实例，也可以提到生物素、链酶亲和素、互补性天然和非天然寡核苷酸序列，锌指结合结构域对等。其它实例在以上叙述。

在一个优选实施方式中，标记物可以是特异结合对的成员，例如半抗原。在另一个优选实施方式中，标记物可以是荧光物质。在另一个优选实施方式中，标记物可以是色原体。在其他实施方式中，可以优选其他标记物。

如上所述，相对于每个结合物分子（任意上述）的可检测标记物的数量可以变化。在一些实施方式中，标记物的数量可以是，相对于每个结合物分子为1～3，例如1、2或3个标记物。在一些其他实施方式中，结合物可以相对于每个结合物分子包含更多的4～150个标记物。在一些优选实施方式中，结合物分子可以包含一个可检测标记物。

在一些实施方式中，当结合物包含多于1个的标记物时，可以优选将标记物分组，从而在标记物之间有一定的分子距离，例如10～15个原子或更多的链，例如高达30、60或90个原子（标记物在结合物分子中的这种排布在本文中称为Z尾）。优选分隔标记物的连接物化合物是亲水的。

在一个实施方式中，本发明结合物分子的多个标记物可以是相同的可检测物质，在另一实施方式中，标记物可以是不同的可检测物质。

在一个优选实施方式中，结合物分子可以包含一个Y头（任意上述）和一个标记物，然而，在其他实施方式中，可以优选具有Y和Z化合物的不同组合的结合物分子。

在结合物分子中，可检测物质（单个标记物或其多个）可以与Y化合物隔开一些分子距离。该分子距离对应于在结合物中连接Y化合物和Z标记物的化合物。

连接物化合物可以是小分子，例如单个氨基酸，或者其可以是相对较大的分子，例如含有高达150个原子或更多的链。在任何情况下，结合物的连接物化合物是含有至少两个在分子中相互隔开至少2个互连原子的分支点的水溶性分子。术语“分支点”是指分子中的一个点，在此可以连接其他分子。分支点可以是原子、原子组或官能团，化合物Y和Z可以通过分支点连接至分子。令人惊讶地发现，含有4～150 个原子将标记物Z和酶底物Y隔开的连接物在本发明的条件下提供最有效率的结合物沉积。要提及的Y和Z化合物的这种排布的其他优点是：（1）含有多个疏水标记物的结合物在水溶液中保持良好的溶解性，以及（2）当结合剂用于检测所沉积的结合物时，标记物对结合剂而更容易接近。

在一个实施方式中，L可以是键，例如标记物Z的原子与化合物Y的原子之间的共价键。本发明还涉及作为键的L，此时Y化合物或Y头与标记物Z或Z尾之间没有连接化合物，即含有2至4个化合物Y的Y或Y头直接或间接地例如通过赖氨酸残基经由键（L）连接至标记物Z或Z尾。当需要将靶标可视化为较小的点时（即，直径小于3微米的点，例如约1～1.5微米），这些报告物可能是有利的。

在一个优选实施方式中，含有2至4个化合物Y的一个Y头可以直接地或间接地例如通过赖氨酸残基（Lys）连接至连接物化合物（L），连接物化合物（L）是含有2至5个下式重复的聚合物

（III），

其中R₁和R₂选自NH和O，且R₃选自甲基、乙基、丙基、CH₂OCH₂和(CH₂OCH₂)₂，且其中不多于3个的连续重复的乙氧基。基于式（III）的重复数（2～5），该式的L分子被称为L30（2个重复）、L60（4个重复）等。它们的合成具体记载在WO2007/015168中。所得的结合物，即(Y)_2～4-(Lys)-L-可以进一步（直接地或间接地例如通过赖氨酸残基）与一个（或更多个）可检测标记物结合，得到式(Y)_2～4-(Lys)-L-(Lys)-(Z)_{1（或更多个）}的分子，或者其可以与另一水溶性分子结合，例如葡聚糖聚合物（Dex），其含有一个或多个允许连接一个或多个这些结合物的反应基团，得到例如式((Y)_2～4-(Lys)-(L))_n-Dex-(Lys)-(Z)₁-((Lys)-L-Z)_m的分子，其中m和n是1～150或更大的整数。这些结合物的合成记载在实施例中。

在其他优选实施方式中，Y化合物可以通过小分子的连接物化合物（例如氨基酸，例如赖氨酸、β-丙氨酸、甘氨酸或其他具有两个分支点的水溶性小分子）连接至Z标记物。术语“分支点”是指分子中的一个点，在此可以连接其他分子。分支点可以是原子、原子组或官能团，化合物Y和Z可以通过分支点连接至分子。

存在很多种可以用作连接物L的分子。适合作为本发明连接物的聚合物分子的实例包括但不限于：多糖，例如葡聚糖、羧甲基葡聚糖、葡聚糖聚醛、羧甲基葡聚糖内酯和环糊精；普鲁兰多糖（pullulan）、裂裥菌素（schizophyllan）、硬葡聚糖（scleroglucan）、黄原胶、胶凝糖、邻乙氨基半乳甘露聚糖、壳多糖和壳聚糖例如6-邻羧甲基壳多糖和N-羧甲基壳聚糖；衍生的纤维素例如羧甲基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、6-氨基-6-脱氧纤维素和邻乙胺纤维素；羟基化淀粉、羟丙基淀粉、羟乙基淀粉、角叉菜胶、海藻酸盐（酯）、和琼脂糖；合成多糖例如聚蔗糖和羧甲基化聚蔗糖；乙烯基聚合物包括聚(丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸-2-羟乙基酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(马来酸)、聚(马来酸酐)、聚(丙烯酰胺)、乙基-醋酸乙烯共聚物、聚(甲基丙烯酸)、聚(乙烯醇)、乙烯醇-氯乙酸乙烯酯共聚物、胺化的聚(乙烯醇)、和其嵌段共聚物；含有聚合物骨架的聚乙二醇（PEG）、或聚丙二醇或氧化乙烯-氧化丙烯共聚物，包括线性、梳状、或超支化的聚合物和树枝状大分子，包括分支的PAMAM-树枝状大分子；聚氨基酸，包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚氨酯、聚(乙烯亚胺)、pluriol；蛋白，包括白蛋白、免疫球蛋白、和病毒样蛋白（VLP）；和聚核苷酸、DNA、PNA、LNA、寡核苷酸和寡核苷酸树枝状聚合物构建体；混合的聚合物，即，包括一个或多个上述聚合物、嵌段共聚物和无规共聚物的实例的聚合物。

可以对所选聚合物的特性改性以使性能最佳化，例如，可以使长度或分支最佳化。此外，可以对聚合物化学改性以携带多种取代基。还可以进一步化学保护和/或活化取代基，使聚合物进一步衍生化。

在一个优选的实施方式中，氧化还原酶底物与标记物之间的连接物化合物是葡聚糖聚合物或包括葡聚糖聚合物的结合物分子。

使聚合物与不同化学物质（例如标记物）结合的方法在领域内熟知，且可以用来制备本发明的结合物。例如，可以用乙烯砜活化聚合物并与使其与可检测标记物和式（II）的分子混合以形成聚合物结合物。在其它实施方式中，可以使用醛来活化聚合物，例如葡聚糖，之后将其与可检测标记物和式（II）的分子混合。制备聚合结合物的又一种方法是使用所谓的化学选择结合方案将组分结合到一起，例如在与硫醇改性的聚合骨架共价结合之前可以使用硫醇反应性马来酰亚胺基团来将分子衍生化。在一些其它实施方式中，式（I）的分子和可检测标记物可以经由连接化合物连接到聚合物。该方法的实例包括使用同型双官能连接物化合物例如戊二醛、二异氰酸己酯、二甲基己二亚酰胺化物（dimethylapimidate）、1,5-二氟-2,4-二硝基苯、异型双官能交联剂等例如N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯、以及零长度交联剂例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。

包括式（III）（在下文中称为“L30”）的一个或多个重复的聚合物的衍生法在WO2007/015168中详细描述。在实施例中描述包括连接物的示例性的结合物，该连接物是包括多个式（III）的重复的聚合物，例如包括两个L30重复的聚合物（称为L60），例如包括三个L30重复的聚合物（称为L90），例如包括五个L30重复的聚合物（称为L150）。

小的L化合物的非限制性实例可以是不同的单个氨基酸残基、短的肽序列等。

含有一个或多个化合物Y（具体地，其中Y化合物由上式（ii）限定）、一个或多个标记物Z（任意上述）和连接物L的结合物分子，特别是其中连接物L是键（例如共价键）或小化合物的结合物分子，是本发明的独立方面。总体而言，本发明涉及含有一个或多个式（ii）的化合物Y的结合物。在一个实施方式中，本发明可以涉及含有单个上式Y的结合物，其中所有四个R1、R2、R4和R5不同时是-H且R3不是-OH，但是在另一实施方式中，可以涉及含有至少两个这样的Y化合物的结合物。

第二底物在水溶液中的含量可以根据可检测标记物的物理特性不同而在约10^-10M至约10^-4M的范围内变化，例如在结合物（任意上述）含有放射性标记物的情况中，水溶液中所述结合物的含量可以在约10^-10M～约10^-6M的范围中，在结合物含有荧光标记物或作为特异结合对成员的标记物的情况下，则在约10^-9M～约10^-4M的范围中。

结合物分子的非限制性实例记载在实施例中。

孵育介质

根据本发明，为将本发明的含有酶促活性（特别是过氧化物酶活性）的靶标可视化，在含有上述可视化***的化合物（即，第一底物和第二底物，任选地过氧化物）的水溶液中孵育假定含有靶标的样本。在一些实施方式中，样本可以在其他水溶液中多次孵育，例如在含有一种或多种结合剂的水溶液等中孵育。这些水溶液在本文中统称为“孵育介质”，其中术语“孵育介质”是指样本在此中保持一定的时间段（在本文中称为“孵育时间”）以完成期望的反应的水溶液。

将样本保持/孵育在孵育介质中的时间，即孵育时间，可以根据在孵育过程中想要达到的技术效果不同而变化。在不同的实施方式中，孵育可以持续约3秒～约3min，例如约10秒、20秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟或更长，例如一至二小时、过夜。在一个实施方式中，在方法的所有步骤中的孵育时间可以具有相同的持续时间，即各个孵育可以持续5～10分钟等。在一个实施方式中，样本在含有结合剂的水溶液中（在下文中称为“结合剂溶液”）可以保持1～3分钟或更短/更长，在含有本发明放大体系的成分的水溶液中（在下文中称为“沉积介质”）中的孵育可以持续约30秒～约10分钟。

孵育可以在不同的温度下进行，根据靶标、结合剂的类型等而不同。根据本发明的过程基本不依赖于温度并且可以在约+4℃～约+40℃的温度下进行，然而，如果需要的话，可调节温度以使孵育过程中发生的反应加速或变慢，例如，可以建议使用较低的温度来延长孵育时间，或者反过来，更高的温度可以用来缩短孵育的时间。

结合剂介质

在本发明的一个实施方式中，含有靶标的样本可以与一种或多种结合剂（任意上述）一起孵育。因此，在一个实施方式中，本发明涉及含有结合剂（例如靶标特异性结合剂或含有具备氧化还原酶活性的酶的结合剂）的水溶液。

包含并不具有固有的氧化还原酶活性的靶标的样本在这些介质中的孵育使得可以形成本发明的靶标位点。因此，结合剂介质是水性介质，其中所选择的结合剂是水溶性的并且对样本中它们的结合配偶体具有特异结合亲和性。基本上，结合剂介质是一种或多种结合剂的缓冲水溶液，pH为4～9。

在一些实施方式中，结合剂介质可以包含有机盐或无机盐。无机盐可以选自例如氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸钠或硫酸铵。有机盐可以选自例如乙酸钠、乙酸铵或咪唑盐例如咪唑盐酸盐等。

结合剂介质中的盐含量可以为约10^-3M～饱和，例如约20mM至约200mM，或约50mM至约500mM。在一个优选实施方式中，介质可以包括含量为约10mM至500mM的盐。在另一个优选实施方式中，介质可以不含盐。

如所提及的，通常结合剂介质的pH值可以为约4～约9，例如pH3.5～pH9.5，例如pH5～pH7，pH5.5～pH6.5，或pH6.5～pH7.5，或pH7～pH8，或pH7.5～pH8.5，或pH8和pH9。可以使用任何具有合适的缓冲容量的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水（PBS）和咪唑缓冲液。其他合适的缓冲液推荐可以在Good,NE等人（1966）Hydrogen ion buffers for biologicalresearch.Biochem.5(2),467-477中找到。介质的pH值对于结合剂对靶标的结合可能是基本的；其可以根据结合剂和靶标的特性而优化。

在一些实施方式中，结合剂介质可以包含有机改性剂（术语“有机改性剂”是指任何非水溶剂），例如N-甲基吡咯烷酮（NMP）、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇和二甘醇、环丁砜、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、聚乙二醇（PEG）、丙二醇等。有机改性剂的量可以在约1%至约20%（v/v或w/v）的范围内变化，或者在一些实施方式中可高于20%。

在一些实施方式中，结合剂介质可以包括洗涤剂，例如聚乙二醇对异辛基苯基醚（NP-40）或表面活性剂（例如，选自基于聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（吐温）的表面活性剂、或基于嵌段聚合物（pluronic等）的表面活性剂等）。洗涤剂的量可以在约0.001%至约5%（v/v或w/v）的范围内变化。

在一些实施方式中，结合剂介质可以包括结合剂稳定剂，例如牛血清白蛋白或葡聚糖。稳定剂的量可以从0.01%至20%（w/v）变化。

在一些实施方式中，结合剂介质可以包括离子螯合剂（例如乙二胺四乙酸（EDTA）或乙二胺羟基苯乙酸型螯合剂（EDHPA）等）。螯合剂的量可以在约10^-9M至约10^-6M的范围内变化。

在一些实施方式中，结合剂介质可以包括一种或多种封闭剂以使非特异结合位点即固体支撑物的不包括靶标的位点饱和。适用于不同实施方式的封闭剂的一些非限制性实例可以是Denhard溶液、牛血清白蛋白、脱脂奶等。

如上所讨论的，本发明构思许多种类的靶标、结合剂和测定形式，因此，结合剂介质的组成可以变化并且可使用本领域常识来针对每个特定实施方式作出调整。结合剂介质的一些非限制性实例记载在实施例中。

特异性结合剂在介质中的含量可以变化。这些含量依据结合剂的特性和质量、靶标、样本、试剂、测定形式等，单独地针对各个实施方式进行调整。通常可建议使用使得样本中结合剂的非特异性结合最小化的孵育条件和/或孵育介质中结合剂的量。然而，与领域中现存的很多***相比，信号放大的能力和信号检测的灵活性使得本文记载的信号放大***更少依赖于结合剂介质组成和孵育条件的优化。通常而言，结合剂介质中第一结合剂和/或第二结合剂的含量可以建议为较低，例如约其Kd值或低于Kd值，例如1～500pM的范围，然而，也可以使用更高的量，即高于结合剂Kd值。少量对其结合配偶体具有较高亲和性的结合剂与较短的孵育时间例如0.5～10分钟相组合，使得可以特异性地检测靶标并降低非特异性结合。根据本发明的信号放大很强，足以使以较宽动态范围（例如从少许单靶标分子至大量）存在于样本中的靶标可视化。

在一些实施方式中，样本可以包含大量表达或以较宽动态浓度范围表达的靶标，并且可能需要对单个靶标单元进行可视化。这些样本可以在结合剂仅能与单个靶标单元群的部分子群形成分开的单个靶标位点的条件下在结合剂介质中孵育。这些条件可以包括降低孵育介质中一种或多种结合剂的量，或改变结合剂介质的组成例如pH、盐含量等，或者可以调节孵育条件例如温度等以便其影响参与形成单个靶标位点的一种或多种结合剂的结合能力，由此结合剂将仅与存在于样本中的单个靶标单元的部分子群形成靶标位点。术语“部分子群”在当前上下文中被定义为等于或小于99%的总群体的一部分，例如等于或小于样本中单个靶标单元的总量的90%，例如小于85%，例如样本中靶标单元总量的75～80%，例如小于75%，例如样本中单个靶标单元的总量的1%～50%，例如样本中靶标单元的总量的1%～25%等。在一个实施方式中，孵育条件可以调节为，结合剂将与少于样本中存在的单个靶标单元的总量的1%（例如约0.1%至约1%）的单个靶标单元的部分子群形成分开的单个靶标位点。

在一个实施方式中，结合剂介质可以包括含量低于其离解常数值（Kd）（或者，在抗体-抗体结合情况下的缔合常数（Ka））的结合剂，这与其对样本中亲和配偶体的结合相关。在一个实施方式中，可以以低于其Kd的含量使用第一结合剂，这与该第一结合剂对样本中其靶标的结合相关。在另一实施方式中，第二结合剂可以以低于其Kd的含量存在，这与其对样本中相应配偶体的结合相关。使用非常少量的在样本中具有亲和配偶体的结合剂，对于降低结合剂对于样本中靶标不相关的对象的非特异性结合是有利的，其中所述亲和配偶体与本发明的靶标位点相关。

沉积介质

为对靶标进行可视化，在包含具备氧化还原酶活性的酶的第一底物、具备氧化还原酶活性的酶的第二底物、以及任选地过氧化物化合物的水溶液中（该介质在本文中称为“沉积介质”）孵育假定含有本发明的靶标位点的样本。

沉积介质可以是具有合适的缓冲容量的水性缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水（PBS）和咪唑缓冲液。其他合适的缓冲液可以在Good,NE等人（1966）Hydrogen ion buffersfor biological research.Biochem.5(2),467-477中找到。可以调节溶液的pH值以达到孵育的技术效果，即在本发明的离散的单个靶标位点形成具备氧化还原酶活性的酶的第二底物的离散沉积，例如调节为约4至约9的pH。然而，水溶液（i）和（ii）的pH对于孵育的技术效果的重要性较小。

介质还可包含有机盐或无机盐。

无机盐可以选自例如氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸钠或硫酸铵等。

有机盐可以选自例如乙酸钠、乙酸铵或咪唑盐例如咪唑盐酸盐等。

介质中的盐含量可以为约10^-3M至饱和，例如从约20mM至约 200mM，或从约50mM至约500mM。在一个优选实施方式中，介质可以包含含量为约10mM至500mM的盐。在另一个优选实施方式中，介质可以不含盐。

在不同的实施方式中，介质还可以包含：

（i）有机改性剂和/或

（ii）酶增强剂，和/或

（iii）铁螯合剂，和/或

（iv）洗涤剂，和/或

（v）抗菌剂。

有机改性剂可以以约1%～约20%（v/v或w/v）的含量存在于介质中，然而，在一些实施方式中，可能需要更高浓度的有机改性剂。有机改性剂可以例如是聚乙二醇（PEG）。其他实例包括但不限于，选自C1～C4即低级醇、N-甲基吡咯烷酮（NMP）、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇和二甘醇、环丁砜、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的有机改性剂。在一些实施方式中，可以有利地使用聚乙二醇（PEG），例如PEG2000或聚丙二醇。在这些情况中，介质中聚乙二醇的含量可以从约0.1%（v/v）至约20%（v/v）变动，例如约1%（v/v）至约15%，例如5～10%（v/v）。

术语“酶增强剂”是指增强过氧化物酶的催化活性的任何化合物。这些酶增强剂可以选自苯基硼酸衍生物和二价金属离子例如镍或钙。酶增强剂的量可以在约10^-7至约10^-3M的范围内变化。

铁螯合剂可以是乙二胺四乙酸（EDTA）或乙二胺羟基苯乙酸型螯合剂（EDHPA）。铁螯合剂的浓度可以在约10^-9至约10^-6M的范围内变化。

洗涤剂可以选自聚乙二醇对异辛基苯基醚（NP-40），选自基于聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（吐温）的表面活性剂、或基于嵌段共聚物（pluronic等）的表面活性剂的表面活性剂。洗涤剂的浓度可以在约0.001%至约5%的范围内变化。

第一底物和第二底物的实施方式在以上详细讨论。

介质中第一底物即ACHCA的量可以变化。在一些实施方式中，可以建议使用高于5.75mM的ACHCA，例如约6mM～约15mM，或更高。这些量提供明晰的传统靶标染色（即，作为均质化染色）。在其他实施方式中，可以建议使用约0.15mM至约5.75mM的ACHCA，例如约1mM至约5.5mM。这些量的ACHCA提供作为分开的（颜色或荧光等的）点的靶标染色（还参见以上讨论）。

沉积介质可以包含不同量的第二底物，例如约10^-10M至约10^-4M，取决于结合物的结构和组成特别是其含有的标记物而不同。例如，在结合物包含放射性标记物的实施方式中，可应用的量可以在约10^-10M至约10^-6M的范围内。在其他实施方式中，例如当结合物包含荧光标记物或作为特异结合对的成员的标记物时，含量可以在约10^-9M至约10^-4M的范围内。一些非限制性实施方式记载在实施例中。

在一个实施方式中，介质可以包含相同分子的第二底物群。在另一实施方式中，介质可以包含不同分子的第二底物群。

在一些实施方式中，特别是当氧化还原酶是过氧化物酶例如HRP或SP时，沉积介质优选包含一定量的过氧化物化合物。本发明的优选过氧化物化合物是过氧化氢，然而在不同的实施方式中也可以使用其他过氧化物化合物，例如在一些实施方式中，可以优选有机过氧化物例如叔丁基过氧化物、二叔丁基过氧化物、过乙酸等，或者在一些实施方式中，可以是过氧化氢的加成物，例如过氧化氢尿素加成物。

沉积介质中过氧化物化合物的量优选为少于5mM，优选在0.15mM～3.5mM的范围内，例如在约0.25mM至约2.5mM的范围内，约0.35mM～约1.5mM，约0.5mM～约1mM。术语“约”在当前上下文中表示+/-0.05～0.25mM。

根据本发明，含有酶的第一底物和第二底物的沉积介质是稳定溶液，即不发生酶底物的沉淀，且化合物与酶反应的能力在相当长的时间段内不受影响，例如室温下长达5个月的储存。当储存在低于+20℃的温度时，例如在+4～+10℃，并且任选地加入抗菌化合物，这些介质的保存期限可以进一步延长。抗菌化合物可以是任何通常用于这些目的的抗菌化合物，例如叠氮化钠、Proclin^TM或当考虑自动化的靶标可视化过程时，这样的溶液稳定性具有特别的优势。

因此，本发明的一个方面涉及含有ACHCA和本发明结合物分子（任意上述）的水溶液。溶液可以配制为浓缩的沉积介质（例如浓缩2×、 3×、4×、5×至10×、10×至20×或更高倍数浓缩），并在与过氧化物化合物混合之前用水稀释。

含有ACHCA和一种或多种本发明结合物分子的水溶液可以是用于对样本中固有地含有氧化还原酶酶促活性或与氧化还原酶酶促活性相关的靶标进行体外可视化的组件试剂盒（kit-of-parts）的一部分。该组件试剂盒还可以包含通常用于靶标检测的多种不同化合物，例如结合剂、与其他可视化***相关的化合物等。因此，在一个实施方式中，本发明涉及用于对样本中的靶标进行氧化还原酶介导的可视化的组件试剂盒。

检测介质

在一个实施方式中，本发明涉及靶标可视化方法，其包括在报告物沉积步骤之后进行的一个或多个步骤，在这些步骤中检测所沉积的报告物。这些步骤包括检测与在靶标位点处沉积的结合物分子相关联的标记物。因此，可以在含有能够特异性结合所沉积结合物分子的可检测标记物的结合剂的孵育介质中孵育含有报告物沉积的样本。结合物分子的标记物和结合剂的非限制性实施方式在以上记载并在实施例中示例。

含有能够特异性结合所沉积结合物分子的可检测标记物的结合剂的孵育介质通常具有与上述结合剂介质相似或相同的组成。

在一个实施方式中，与所沉积报告物的可检测标记物结合的结合剂可以包含酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。这些结合剂可以使用采用酶的显色物质的标准可视化***来检测，例如酶底物溶液或显色溶液。这种介质可以是本领域已知的任何合适介质，根据可得的可视化手段并遵循领域内关于沉积物的可检测标记物的特性的公知常识来选择介质。如此检测的非限制性实例记载在实施例中。

或者，在结合剂包含HRP的情形下，可以在沉积介质中进行额外的孵育包含第二底物的沉积物的样本的步骤。在一些实施方式中，当与所沉积的第二底物相关的信号可能较弱或者初始沉积的尺寸相对较小，或者希望改变与沉积相关的信号例如从绿色到红色时，这些额外步骤可以是有利的。

根据本发明，额外的沉积步骤使得可以通过在额外几轮的沉积中增加靶标位点处所沉积第二底物的量而进一步放大与沉积相关的信号。额外的沉积步骤也使得可以改变可检测信号的特征，例如改变信号的光谱特性，例如通过使用包含用于该额外沉积的绿色标记物的报告物代替包含用于初始沉积中的红色标记物的报告物，可检测为红色信号的初始标记物可以被取代为可检测为绿色信号的标记物。本发明的靶标可视化***的灵活度并不会使靶标检测的过程增加复杂度或增加其额外步骤中所用的试剂，因为所有与靶标初始检测的孵育或沉积步骤（上述）有关的实施方式均可使用而无需在这些额外步骤中有实质改变。

在一个实施方式中，本发明涉及洗涤介质，即在完成孵育后用来从样本中除去孵育介质中的剩余化合物的介质。本发明的方法可以包括一个或多个洗涤步骤，通常在将样本孵育在任何上述介质中的步骤之后。通常而言，洗涤介质可以是缓冲盐水溶液、水或没有反应化合物即没有结合剂、酶底物等的孵育介质。

在一个实施方式中，本发明涉及用于猝灭内源氧化还原酶活性的介质。这种介质可以是本领域常规用于该目的的任何该种介质，例如过氧化氢溶液。

本发明的方法

以下是本发明方法的非限制性实施方式。

在一个实施方式中，本发明提供将样本中如组织学样本中的靶标可视化（为单个靶标单元或块）的方法，其中靶标被固定，其中该方法包括以下步骤：

a）将假定含有一个或多个靶标单元的样本与一种或多种结合剂孵育，其中至少一种结合剂能够直接结合至所述靶标单元，且其中至少一种结合剂包含具备氧化还原酶活性的酶，从而形成一个或多个靶标位点，其中靶标位点包含靶标单元和一种或多种结合剂，其中至少一种结合剂包括具备过氧化物酶活性的酶；

b）在水溶液中孵育样本（a），该水溶液包含

i）该酶的第一底物；

ii）该酶的第二底物，以及任选地

iii）过氧化物化合物，

其中，第一底物是α-氰基-4-羟基肉桂酸（ACHCA）或其衍生物，且第二底物是含有一种或多种能够作为具有过氧化物酶活性的酶的底物的化合物以及至少一种可检测标记物的结合物分子；

c）检测靶标位点处所沉积的离散沉积物的标记物。

可以使用上述的孵育条件将靶标位点可视化为直径约2～3微米的（有颜色、荧光、发光或放射性的）离散点，或可视化为均质化的染色而未达到得到离散点的分辨率。

取决于标记物的性质，步骤（c）可以包括一个或多个另外的检测步骤，包括与标记物特异性结合剂和可视化试剂的不同孵育。其某些非限制性实施方式在以上讨论并在实施例中示例。

结合剂、结合物分子、孵育介质、可视化手段等的实施方式在以上讨论。

在一个优选实施方式中，具备氧化还原酶活性的酶是过氧化物酶，例如HRP或SP，且沉积溶液包含过氧化物化合物例如H₂O₂。

在一个实施方式中，以上方法可以包括任何上述的额外步骤。在一个实施方式中，方法可以在步骤a、b或c中任意步骤之后包括一个或多个步骤。在另一实施方式中，方法可以在步骤a、b或c的任意步骤之前包括一个或多个步骤。方法可以包括至少一个自动化步骤，或另外包含至少一个自动化步骤。

在一些实施方式中，例如当样本中的靶标大量表达或以较宽泛动态浓度范围表达时，可以优选在结合剂能够与单个靶标分子的部分子群形成靶标位点的条件下使样本与一种或多种参与形成单个靶标位点的结合剂孵育。这些条件的实施方式讨论如上。

在一个实施方式中，其中靶标不包含固有的氧化还原酶活性并且是低表达的靶标，靶标可视化方法可以如下进行：

a）将样本与一种或多种结合剂孵育，其中

i）至少一种结合剂能够特异性地结合靶标；

ii）至少一种结合剂包含具备氧化还原酶活性的酶；且

iii）结合剂（i）或（ii）的量低于与其结合样本中的结合配偶体相关的离解常数（Kd）的值，

从而形成一个或多个靶标位点，其中靶标位点包含靶标单元和一种或多种结合剂，其中至少一种结合剂包含具备过氧化物酶活性的酶；

b）在水溶液中孵育样本（a），水溶液包含

i）该酶的第一底物；

ii）该酶的第二底物，以及任选地

iii）过氧化物化合物，

其中，第一底物是α-氰基-4-羟基肉桂酸（ACHCA）或其衍生物，且第二底物是含有至少一种能够作为具有过氧化物酶活性的酶的底物的化合物以及至少一种可检测标记物的结合物分子；

c）检测在靶标位点处所沉积的第二底物的标记物。

如上所讨论的，本发明的信号放大***的能力使得可以使用低于其Kd值的量的结合剂（第一结合剂或第二结合剂），Kd值与结合剂对样本中其特异结合配偶体的对应相互作用相关。

可通过两态过程来描述结合剂-靶标复合物（C）的形成：

对应的离解常数定义为：

其中[P]、[L]和[C]分别表示靶标（例如蛋白）、结合剂（例如配体）和复合物的摩尔浓度。

离解常数具有摩尔单元（M），其对应于靶标（例如特定蛋白）上的结合位点的一半被占据时的结合剂浓度[L]，即结合剂浓度，此时与结合剂结合的靶标的浓度[C]等于无结合剂结合的靶标的浓度[P]。离解常数越小，结合剂结合越紧密，或者结合剂与靶标之间的亲和性越高。例如，具有纳摩尔（nM）离解常数的结合剂比具有微摩尔（μM）离解常数的结合剂更加紧密地结合至特定靶标。

在抗体（Ab）结合抗原（Ag）的具体情况下，通常使用亲和常数。其为离解常数的倒数。

本发明提供将与靶标位点相关的信号放大至极限的手段。使用本文中记载的试剂和可视化条件，即使低表达靶标的单个分子也可以使用标准低分辨率显微镜（例如4×、10×或20×倍率明视场或荧光显微镜）而进行可视化、检测和计数。

在一些用于检测低丰度靶标的过程中，使用上述的特定结合剂可能是有利的。具体而言，在一个实施方式中，可以优选使用含有具备氧化还原酶活性的酶的多个部分（例如，高达20个HRP）的多克隆一抗的单个Fab片段。在另一个实施方式中，可以优选第二结合剂是含有多个（高达20个）HRP的二抗的Fab片段。在另一实施方式中，可以优选使用第二结合剂，其为含有核心聚合物例如葡聚糖、1～2个特定结合剂和多个HRP的结合物分子。这些试剂有利于将结合剂在样本中的非特异性结合最小化，并同时有利于使用酶对含有其特异性结合配偶体的样本的位点进行大量标记，由此增强样本的靶标位点处第二底物的特异性沉积。这些实施方式的一些实例记载在实施例中。

使用上述实施方式，可以对本发明样本中任意含量的本领域已知作为疾病的生物学标记物的任何蛋白或另一生物学分子、结构或分子复合物进行检测，因此其包括在本发明的范围中。具体而言，本发明涉及癌症的生物学标记物。

因此，在一个方面，本发明涉及诊断测定，包括根据本发明在体外对样本中的诊断靶标进行可视化和检测的步骤。

如上所述，使用本发明的方法，可以同时或相继对相同样本中的多个靶标进行可视化和检测。通过使用不同的结合物分子（含有不同标记物）、单个靶标分子或成块的靶标或其组合，***的灵活性使得可以对样本中以较宽泛动态范围表达的不同种类的靶标或相同靶标进行可视化。在WO2009036760、WO2010094283、WO2010094284、WO2011047680和PCT/DK2011/000148中记载的可视化方法的所有实施方式可以直接使用或容易地改造成用于本发明的目的。

在一个方面，本发明涉及对样本中根据本文所述方法可视化的靶标进行定量的方法。可以确定样本中特别是组织学样本中的相对量和绝对量的靶标。通常而言，根据本发明的定量评估样本中固定化靶标的方法包括：

a）根据本发明的方法之一，对样本中的靶标进行可视化和检测，

b）对样本中的靶标进行定量。

在靶标被可视化为均质化染色的实施方式中，靶标的定量可以通过使用基于传统染色密度计量学的评估而完成，或者，可以通过对所处理样本中颜色、荧光、发光或放射性的清楚的点进行计数或定量而完成，或使用常规的光学显微镜手动进行，或使用图像分析***考虑点的不同特征自动进行。对组织学样本中被可视化为点的靶标进行定量的方法具体记载在PCT/US2011/62424和PCT/DK2011/000131中，并完全适用于对根据本发明被可视化的靶标进行定量。

在一个实施方式中，可以评估样本中的靶标量而不考虑任何参照，例如将其评估为样本中靶标块的量或单个靶标单元的数量。在另一实施方式中，可以根据参照评估靶标量，例如相对于样本中另一对象的表达，例如生物学分子或细胞结构，相对于样本的体积或面积等。

本文记载的方法对于定量评估复杂组织学样本中的靶标特别有利。因此，在一个优选实施方式中，本发明涉及对组织学样本中的靶标进行定量评估。

生物学标记物（即其表达具有诊断、预后或治疗价值的标记物）的表达评估经常被用于做出或证实医疗诊断或用于预计治疗性处理的结果，或用于监测疾病的发展。当这些评估是基于对复杂样本例如组织学样本的分析时，其具有相对的价值，因为分析的结果强烈依赖于样本的质量、检测方法的灵敏度、表达水平的变化等，因此，对同一患者的相同组织的一系列组织学样本中的生物学标记物表达进行评估可能给出非常不同的结果，造成错误的假定和诊断，结果导致无效的治疗。根据本文所述的方法，基于患者样本中单个标记物分子的含量估算而做出的诊断和治疗标记物的表达评估可以提供可靠的样本检查，引导无误的医疗诊断和有效的个性化靶标定向治疗。

因此，在一个实施方式中，本发明的方法可以用于诊断患者的疾病，其中诊断包括根据本发明的任意方法对得自患者的生物学样本进行评估的步骤。

在另一实施方式中，本发明的方法可以用于估计治疗处理在患者中的效力，其中估计包括根据本发明的任意方法对已经处理的患者样本进行分析。

在另一实施方式中，本发明的方法可以用于提供医疗预后，例如对患者中疾病发展风险的预后，或对从疾病恢复或失败的可能性的预后，其中预后的方法包括根据本发明的任意方法对得自患者的生物学样本进行加工和分析的步骤。

在另一实施方式中，本发明的方法可以用于针对治疗方案对患者进行分类（stratification），其中分类包括根据本发明的任意方法对已经处理的患者样本进行分析。

方法也可以用于监测疾病，例如疾病进展或改善，或者也可以在新药筛选方法中使用，例如用来在体外测定中评估新药的治疗潜力等。

本发明的可视化方法可以为通常用于后述应用的多种测定形式所采用，例如流式细胞术（FC）、ELISA、组织化学（IHC和ISH）、印迹等。例如，在一个实施方式中，生物学样本可以是细胞悬浮液。悬浮液中靶标生物学分子或细胞的靶标结构可以使用FC、ELISA、IHC或ISH来检测。当ELISA、IHC或ISH用于检测时，悬浮液中的细胞附着至固体支撑物，例如板（ELISA）或玻片（IHC）。在另一实施方式中，生物学样本可以是体组织的样本，例如固定的石蜡包埋的肿瘤样本的切片。这些样本靶标分子或细胞结构将通常使用IHC或ISH来检测。

IHC和ISH测定形式通常在靶标分子的可视化之前需要一系列处理步骤，这些步骤可以是对装载于适当固体支撑物上的组织切片进行而用于显微镜检，或者是生成显微照片，例如玻璃玻片或其他平面支撑物，以通过对疾病状态的某些形态学指示物的选择性染色或检测生物学标记物来使其突出（highlight）。因此，例如在IHC中，首先从个体中取得样本，之后固定，然后将其暴露于特异性结合目标生物学标记物的抗体。样本处理步骤也可以在本发明的可视化步骤之前包括其他步骤，例如，其可以包括以下步骤：切割和修整组织、固定、脱水、石蜡浸渍、切成薄切片、装载到玻璃玻片上、烘烤、脱蜡处理、再水化、抗原修复、封闭步骤等。洗涤步骤可以用合适的缓冲液或溶剂进行，例如磷酸缓冲盐水（PBS）、tris缓冲盐水（TBS）、蒸馏水。洗涤缓冲液可以任选地包含洗涤剂，例如吐温20。所有这些过程都是熟知的实验室常规程序。

可以使用本发明的方法来处理以下两个种类的组织学样本：（1）包含新鲜组织和/或细胞的制品，其通常不用醛类固定剂固定，以及（2）固定且包埋的组织标本的制品，通常是保存（archived）的材料。

固定和包埋组织标本的很多方法是已知的，例如醇固定和***固定以及之后的石蜡包埋（FFPE）。

需要固定剂来以可再生和栩栩如生的方式保存细胞和组织，并固定样本中的靶标。为达到该目的，将组织块、切片或涂片浸在固定液中，或在涂片的情况下，进行干燥。固定剂使细胞和组织稳定化从而保护它们不受加工和染色技术的严苛性影响，并将靶标固定在样本中保护靶标不在进一步步骤中损失。

可以使用任何合适的固定剂，例如乙醇、乙酸、苦味酸、2-丙醇、四盐酸盐二水物、乙偶姻（单体和二聚体的混合物）、丙烯醛、巴豆醛（顺式+反式）、甲醛、戊二醛、乙二醛、重铬酸钾、高锰酸钾、四氧化锇、多聚甲醛、氯化汞、甲苯-2,4-二异氰酸酯、三氯乙酸、钨酸。其他实例包括***（甲醛水溶液）和中性缓冲***（NBF）、戊二醛、丙烯醛、碳二亚胺、亚胺酸酯（imidates）、苯醌、锇酸和四氧化锇。

新鲜的活检标本、细胞学制品（包括印片和血液涂片）、冷冻切片和用于免疫组织化学分析的组织通常固定在有机溶剂中，包括乙醇、乙酸、甲醇和/或丙酮。

为便于固定组织中的特异性识别，通常必须修复或露出靶标即目标生物学标记物，通过对标本的预处理来增加大部分靶标的反应性。该步骤称为“抗原修复”、“靶标修复”或“表位修复”、“靶标露出”或“抗原露出”。关于抗原修复（抗原露出）的大量综述可以在Shi等人，1997，J Histochem Cytochem,45(3):327中找到。

抗原修复包括很多方法，通过这些方法，使得与特定检测试剂相互作用的靶标的可得性最大化。最常见的技术是在合适的缓冲液中使用蛋白水解酶（例如蛋白酶、链霉蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或神经氨酸苷酶）进行酶促消化，或者使用微波辐射，在水浴、蒸气机（steamer）、常规烘箱、高压釜或加压蒸煮器中于合适的pH稳定缓冲液（通常包含EDTA、EGTA、Tris-HCl、柠檬酸盐、尿素、甘氨酸-HCl或硼酸）中加热而进行的热诱导的表位修复（HIER）。洗涤剂可以加至HIER缓冲液中以增加表位修复，或加至稀释介质中和/或漂洗缓冲液中以降低非特异性结合。

抗原修复缓冲液大多数是水性的，但也可以包含其他溶剂，包括沸点高于水的溶剂。这使得可以在常压下在高于100℃的温度下处理组织。

此外，如果需要的话，可以通过不同的物理方法增加信噪比，包括应用真空和超声、或在试剂孵育之前或之中冷冻和解冻切片。

可以除去内源生物素结合位点或内源酶活性（例如磷酸酶、过氧化氢酶或过氧化物酶），作为检测过程中的预检测步骤，例如可以通过用链霉亲和素预处理样本来封闭内源生物素，可以通过用过氧化物处理来去除过氧化物酶活性。可以通过用左旋咪唑处理来去除内源磷酸酶活性。可以通过加热来破坏内源磷酸酶和酯酶。也可以使用领域内已知的预处理的其他方法。

当使用本发明的方法时，封闭非特异性结合位点不是必要的，然而，如果需要的话，可以使用领域内标准方法来进行封闭，例如用惰性蛋白例如马血清白蛋白（HSA）、酪蛋白、牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白、胎牛血清或其他血清，或可以使用洗涤剂例如吐温20、TritonX-100、皂角苷、Brij或Pluronics。也可以使用特定试剂的未标记且靶标非特异性的版本来封闭组织或细胞中的非特异性结合位点。

也可以使用漂片技术（free floating technique）来制备样本并检测靶标分子。在该方法中，组织切片在悬浮液中与不同试剂和洗涤缓冲剂接触，或者自由地浮动在合适的容器例如微型离心管中。

可以在染色过程中使用例如“吊钩类”（fishing hook like）器件（刮勺或玻璃环）将组织切片从管转移到具有不同试剂和缓冲剂的管中。也可以通过温和的倾注或真空抽吸来改变不同的试剂和缓冲剂。或者，具有组织切片的容器可以清空至特殊的染色网例如Corning“Netwells”（Corning）且在转移回管之前洗涤组织切片，以用于下一染色步骤。

所有的步骤，包括例如固定、抗原修复、洗涤、用封闭剂孵育、免疫特异性试剂和氧化还原酶介导的沉积在组织切片自由漂浮或留在网上时完成。在报告物沉积之后，将组织切片装载到玻片上，检测报告物并在例如通过光学或荧光显微镜分析之前用盖玻片覆盖玻片。

在一些实施方式中，可以按照方法步骤在与免疫特异性试剂进行关键孵育之后将组织切片装载到玻片上。然后对装载有组织切片的玻片进行检测方法的剩余部分。

采用本发明方法的任何测定可以包含一个或多个自动化步骤。在一个实施方式中，测定可以包括手动检测，在另一实施方式中，测定可以完全自动化，在另一实施方式中，可以调整测定用于半自动检测。

实施例

以下是所公开发明的非限制性工作实施例。

缩写

MBHA 4-甲基二苯甲胺

NMP N-甲基吡咯烷酮

HATU 2-(1h-7-氮杂苯并***-1-基)-1,1,3,3四甲基脲六氟磷酸酯；亚甲铵（methenamminium）

DIPEA 二异丙基乙胺

DCM 二氯甲烷

TFA 三氟乙酸

TFMSA 三氟甲基磺酸

Flu 荧光素

Dex 葡聚糖

HPLC 高效液相色谱

equi. 当量

L30 1,10,16,25-四氮杂-4,7,13,19,22,28-六氧杂-11,15,26,30-四氧-三十烷

L60、L90、L120、L150

L30的不同聚合物，包括2、3、4或5个L30重复

CIZ 2-氯Z=2氯苄氧羰基

FITC 异硫氰酸荧光素

HRP 辣根过氧化物酶

GaM 山羊抗小鼠抗体

DNP 2,4二硝基-氟代苯（二硝基苯基）

LPR 液体永固红（Dako K0540）

ACin 4-氨基肉桂酸

Sin 芥子酸（4-羟基-3,5-二甲氧基肉桂酸）

Caf 咖啡酸（3,4-二羟基肉桂酸）

Fer 阿魏酸（3-甲氧基-4-羟基肉桂酸）

PNA-X 肽核酸寡聚体（N-(2-氨乙基)-甘氨酸），包含与中心氮结合的不同取代基

A 腺嘌呤-9-乙酸

C 胞嘧啶-1-乙酸

D 2,6-二氨基嘌呤-9-乙酸

G 鸟嘌呤-9-乙酸

Gs 6-硫代鸟嘌呤-9-乙酸

P 2-嘧啶酮-1乙酸

T 胸腺嘧啶-1-乙酸

Us 2-硫脲嘧啶-1-乙酸

Dpr 2,3二氨基-丙酸

Phe 苯丙氨酸

Tyr 酪氨酸

Trp 色氨酸

Lys 赖氨酸

Cys 半胱氨酸

betaala β丙氨酸、N,N二乙酸

FFPE 甲醛固定石蜡包埋

SMD 单个分子检测

交联剂具有氧化还原酶活性的酶的第一底物

报道物具有过氧化物酶活性的酶的第二底物

ACHCA α-氰基-4-羟基肉桂酸

结合物分子

表1：结合物分子、其合成的中间产物和对照构建物

根据合成方法，不同的结合物和它们的中间化合物在表格的第3栏粗略地以复杂度升序进行分类：

1.仅固相化学法；

2.固相，然后一个溶液相步骤；

3.固相，然后两个溶液相步骤；

4.固相，然后两个溶液相步骤；

5.固相，然后四个溶液相步骤；

6.氨基和betaala酸酐中间产物之间结合的溶液相；

7.葡聚糖结合物，具有一个取代基；

8.葡聚糖结合物，具有两个取代基。

1.这组包括从三-荧光素标记的PNA五聚物制备而来的8种结合物（D18007～D18014），4种天然，另4种非天然。存在4种具有5～6个酪氨酸和3个荧光素的酪氨酸结合物，D18044、D18049、D18137和具有三个DNP代替荧光素标记物的D18138。D18128和D18132各具有5个酪氨酸和3个荧光素，如此它们是潜在的结合物，尽管它们还包含用于进一步葡聚糖结合的N端胱氨酸残基，使它们进到“中间产物”的组。中间产物还包括重要的半胱氨酸（D17127）和β丙氨酸（D17126）三-荧光素连接物，以及具有7个酪氨酸（D18084）或三个荧光素（D18085）的二氨基-丙酸结合物。最后，用作对照的小的二-荧光素连接物（D17161）也通过单独的固相合成而制备。所有这些化合物的合成策略很简单：Boc保护的单体市售可得或者内部制备，结合物和中间产物通过线性固相合成而制备，之后通过6:2:1:1TFMSA：TFA：间甲酚：硫代苯甲醚的混合物（cocktail）从树脂切割。为得到最好的结果，使用所得所有单体的双结合。在对固相进行Fmoc去保护后，将荧光素引入到赖氨酸侧链（和N端，D17161）。HATU活化的羧基-荧光素（混合的异构体）用于荧光素标记（0.2M于NMP中，3×20min）。用2,4-二硝基-氟苯（0.5M于具有DIPEA的NMP中，2×10min）实现DNP标记。

2.这组包括大量的如下结合物，在携带有游离的N端氨基基团和游离的赖氨酸侧链氨基基团的中间产物的固相合成后，在溶液相中用肉桂酸结合物进行标记。在从树脂切割之后，α-N-Boc-(ε-N-2-Cl-Z)-赖氨酸用于引入赖氨酸残基，得到游离的ε-N-氨基基团。溶液相标记基本上是固相技术的延伸，利用的原理是相对高分子量的中间产物可以以几乎定量的方式与***从TFA或NMP溶液中沉淀。

3.从合成观点来看，这组中间产物有更高的复杂度。进行1和2中的固相合成和溶液相标记，之后是溶液相Fmoc去保护的另一步骤。通过结合Boc-L30连接物与Boc-2ClZ和Boc-Fmoc-赖氨酸，具有保护的（Fmoc）赖氨酸侧链和游离N端和其他赖氨酸侧链游离氨基基团（来自树脂切割过程中的N端Boc和2-CIZ赖氨酸残基）的组合的中间产物。这些中间产物可以在2中在溶液中用阿魏酸标记。然而，在使用乙二胺的擦洗步骤之前，使用利用5%乙醇胺进行额外的5min步骤。该额外的擦洗步骤在用乙二胺进行Fmoc去保护之前使氨基反应种类失活。没有该额外步骤，乙二胺进行Fmoc基团去保护会比乙二胺使HATU活化的阿魏酸失活要更快，并且Fmoc“保护的”氨基基团变成阿魏酸标记。具有游离氨基基团的这个组包括D17120（六个阿魏酸）、D17093（五个阿魏酸连接至PNA骨架）、D17138（阿魏酸之间有L90连接物）、D17139（六个阿魏酸于三个紧密对中）、D17104（阿魏酸之间有甘氨酸间隔物）、D17192（具有六个7-羟基香豆素代替阿魏酸）、D18019（在最接近的阿魏酸与游离氨基基团之间有延长的L270连接物）、D18080（具有L90间隔的三个游离氨基基团）。

4.从具有六个阿魏酸和三个游离氨基基团的中间产物D18080，通过另外的溶液相标记制备出两个结合物，具有三个德克萨斯红X的D18081和具有三个7-羟基香豆素的D18096。这表明结合物怎样才能在溶液中标记上两个不同的取代基。优点在于，中间产物D18080可以在最终标记之前纯化，这是当使用标记物或昂贵标记物例如德克萨斯红时的优点。

5.D17152的合成表明固相合成化学法可以应用于溶液中的连接物的程度，之后通过***反复沉淀以除去低分子量的反应物和溶剂：在固相，制备出NH2-Lys(NH2)-(L30-Lys(NH2))4-L30-Lys(Fmoc)，并从树脂切割。之后，在溶液中使Boc-L30连接物结合至六个游离氨基基团。沉淀中间产物并溶解于5%间甲酚的TFA两次。之后，阿魏酸标记如2中在L30延长的氨基基团上进行，之后如3中进行乙醇胺和乙二胺擦洗，最后如1中3次TFA沉淀。

6.片段结合在氨基取代的中间产物与“β-丙氨酸酸酐”活化的中间产物之间进行。具有三个荧光素的D17126还携带有N端β-丙氨酸-N,N-二乙酸。通过活化（NMP：二异丙基碳二亚胺：吡啶；88:10:2）10min，形成环状“β-丙氨酸酸酐”，其可以用于结合氨基基团。这样，从D17120得到D17134（具有L30间隔的六个阿魏酸），从D17139得到D17148（具有L30间隔的成三对的六个阿魏酸），从D17152得到D17156（六个L30延伸的阿魏酸），从D17192到D18003（具有六个 7-羟基香豆素）。这样片段结合的优点在于，中间产物可以在结合前经HPLC纯化，提供较大、复杂且非常纯的结合物。另一个优点是单一中间产物D17126可以用来制备一系列相关的但是不同的结合物。

7.具有单一取代基的葡聚糖结合物包括对照的仅含荧光素的结合物D17132、D18130和D18088（经由半胱氨酸结合来自D17127的所有Dex70结合物）、D17162（来自D17127的dex270结合物）和D18086（来自D18085，经由二氨基丙酸的结合效率较低）。这些用作对照物来表明仅含荧光素的结合物不可用。结合物也以此方式制备，通过将多个中间产物结合物结合至葡聚糖。这些包括D18133（dex70与具有L30间隔的酪氨酸-荧光素结合物D18132）和D18130（dex70与具有酪氨酸-荧光素结合物D18128）。单个结合物与HRP底物以及标记物二者结合的优点是，保证两个取代基之间的固定比。

8.具有两个不同取代基的葡聚糖结合物包括D17130、D18077、D18079、D18090、D18122和D21008，其都是具有六个阿魏酸连接物D18074和三-荧光素连接物D17127的dex70（或连接物的再现）。具有约100个阿魏酸和70个荧光素的D17130、D18077、D18079和D21008之间具有良好的再现性，而D18122与进一步过量的荧光素连接物结合，得到各个具有各约100个阿魏酸和荧光素的结合物。D17128类似于D17130，但是所使用的阿魏酸连接物（D17093）具有附着至PNA骨架而非赖氨酸侧链的阿魏酸。结合物D18031也类似于D17127，但是具有L270延长的阿魏酸连接物D18019。该结合物是使阿魏酸更容易接近HRP酶的尝试。

表格中所选化合物的合成过程的实施例

D19185：在固相制备Boc-(Lys(2-Cl-Z))3-L150-Lys(Fmoc)。除去Fmoc基团，之后如上所述进行荧光素标记。中间产物NH2-((Lys(NH2))3-L150-Lys(Flu)得自树脂的切割。用***将其沉淀，溶解在TFA中，沉淀然后溶解在NMP中并用DIPEA使成碱性。溶液与等体积的经HATU和DIPEA活化的0.2M阿魏酸的NMP混合。在10min后，标记完成，通过将乙二胺添加至10%的浓度来进一步“擦洗”粗产物5min。在用***沉淀之后，将产物进一步溶解在TFA中，并用***沉淀三次以除去低分子量的残渣。在用乙二胺“擦洗”之前，质谱示出两种加成物（及其组合）：+(176)n，表明额外的阿魏酸（在其他阿魏酸和荧光素上的酚酯）和+98（N,N’-四甲基脲加成物，同样在未保护的酚基团上）。这些通过乙二胺处理而完全除去，活性酯和阿魏酸寡聚物同样被分解。

根据该方案制备以下荧光素-阿魏酸结合物：D17157、D17158、D19112、D19185、D18015、D20086、D20118、D20120、D19037和D18157（在以下描述一些结合物的具体合成）。具有其他标记物的阿魏酸结合物包括：D19048（丽丝胺标记）；D19059、D18141和D19040（DNP标记）。具有芥子酸（sinnapinic acid）代替阿魏酸的结合物通过相同的方法来制备，并且包括0328-018和具有荧光素标记物的D21028和DNP标记的D21048。D21020具有三个咖啡酸和荧光素，D18146具有六个4-氨基-肉桂酸和三个荧光素，且均通过相同策略来制备。

D17158对MBHA树脂装载Fmoc-Lys(ivDDE)到150μmol/g的负载量。将200mg树脂用20%哌啶的NMP进行去Fmoc，并与Boc-L30-OH（1.5mL0.26M在NMP中，用0.9当量的HATU、2当量DIPEA预活化2min）结合20min。用5%肼的NMP去除ivDDE基团，之后用羧基荧光素（Flu）（1.5mL0.2M于NMP，用0.9当量HATU、2当量DIPEA预活化2min）标记赖氨酸侧链2×20min。树脂用20%哌啶的NMP、NMP、DCM处理，然后用DCM处理。用TFA：TFMSA：间甲酚（7:2:1，1.5ml，1h）将中间产物H-L30-Lys(Flu)-NH₂从树脂上切割，用***沉淀，再悬浮于TFA中，用***沉淀，再悬浮于NMP中，再次用***沉淀。用100μL的DIPEA调节成碱性，并直接溶解在0.5mL的0.3M阿魏酸（用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化）中。在25min后，用***沉淀粗产物，溶解在450μLNMP和50μL乙二胺中。在5min后，用***沉淀产物，溶解在15%乙腈的水溶液中（8mL）中，用100μLTFA酸化并进行RP-HPLC纯化。

D17157MBHA树脂与Boc-Lys(Fmoc)装载至100μmol/g的装载量。将100mg树脂进行5个循环的与Boc-L30-OH的结合（a.如1中与Boc-L30-OH结合；b.用NMP：吡啶=1:1中的2%乙酸酐加盖（capping）2min；c.用TFA中的5%间甲酚去Bc，2×5min）。将赖氨酸侧链去Fmoc化，并标记羧基荧光素，如1中所述。从树脂切割中间产物H-L150-Lys(Flu)-NH₂，并用阿魏酸标记N端，并如1.1进行纯化。

D16127使用标准固相化学法（如1.1和1.2）在0.5g MBHA树脂上制备Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)。用含20%哌啶的NMP从赖氨酸侧链去除Fmoc基团，并将化合物进行反复的羧基荧光素标记（3×30 min）。在用TFA去除Boc基团之后，在固相上用β丙氨酸-N,N-二乙酸（betaala）叔丁基酯标记N-端。从树脂切割和HPLC纯化后，分离betaala-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2。

D17127使用1.3中记载的步骤，制备出Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)树脂，并用荧光素标记。在除去Boc基团后，用N-Boc-S(4-甲氧基苄基)-Cys-OH标记N端。从柱上切割化合物，并通过HPLC纯化。

D18074/D17128向MBHA树脂按序结合Boc-Lys(Fmoc)（2个循环）、Boc-L30-OH（5个循环）和Boc-Lys(2CIZ)-OH。在10%甲基苯基硫醚清除剂的存在下从树脂切割出中间产物，以除去2ClZ-基团。如1.1所述，用阿魏酸标记N端和5个去保护赖氨酸侧链（2×30Min）。在纯化之前，C端赖氨酸残基的N上的Fmoc基团之后用NMP中的10%乙二胺去除。

D17134将betaala-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2（D16126）（参见以上1.4）500nmol溶解在88μL NMP和2μL吡啶中，并通过与10μL二异丙基碳二亚胺反应10min而转化成环状酸酐。酸酐用***沉淀，将球状物溶解在含有250nmol Fer-(Fer-L30)₅-Lys(NH₂)-NH₂的100μL NMP中。20 min之后，加入5μL乙二胺，在5min后，产物用***沉淀，酸化并经HPLC纯化。

D18044在MBHA树脂上制备Ac-(Tyr(2BrZ)-L30)₆-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc)。在固相上去除Fmoc基团，将赖氨酸侧链标记羧基荧光素。在从树脂上切割后，产物经HPLC纯化。

D17140在MBHA树脂上制备Boc-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L30-Lys(Fmoc)。在从树脂上切割之后，中间产物H-Lys(NH₂)-L60-Lys(NH₂)-Lys(NH₂)-L60-Lys(NH₂)-Lys(NH₂)-L30-Lys(F moc)通过沉淀来分离，并如1.1所述用阿魏酸标记。最终产物通过HPLC来分离。

D18090葡聚糖MW70kDa，用二乙烯砜活化，10nmol，与500nmol Fer-(Fer-L30)₅-Lys(NH₂)-NH₂（D18074）反应（参见以上1.4），总体积为300μL，0.16M NaHCO₃pH9.5，于40℃30min。在观察到轻微的沉淀之后，再加入100μL水，并使反应进行另一30min。再加入200μL0.15M NaHCO₃连同500nmol H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2（D17127）（参见以上1.5）。在40℃1h后，反应混合物通过添加50μL0.165M半胱氨酸30min来终止，将溶液过滤，通过FPLC在superdex200上使用20%EtOH于含有10mM CHES pH9.0和0.1MNaCl的水溶液中纯化产物。稀释的产物是含有约56个荧光素和113个阿魏酸残基的葡聚糖结合物。

D19112使用标准固相Boc化学法在固相MBHA树脂上制备Boc-Lys(2CIz)-Lys(2CIZ)-L150-Lys(Fmoc)。使用NMP中的20%哌啶去除Fmoc基团（2×5min），并且游离氨基基团用羧基荧光素（用NMP中的0.9当量HATU和1当量DIPEA活化0.2M羧基荧光素，3次20分钟）标记。然后用NMP中的20%哌啶处理树脂2×5min。在TFA：TFMSA：间甲酚：甲基苯基硫醚（6:2:1:1）混合物中进行一小时的从树脂切割，得到中间产物H2N-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L150-Lys(Flu)。将此产物溶解在TFA中，用***沉淀，然后溶解在NMP中，再次用***沉淀。然后将沉淀溶解在经0.9当量HATU和2当量二异丙基乙胺活化的0.3M阿魏酸中。在10min反应之后，产物用***沉淀，并溶解在10%乙二胺的NMP中2min。终产物之后用***沉淀，溶解在30%乙腈的水中，在C18柱中进行HPLC纯化。

D19185、D20068和D20171以与D19112相同的方式进行制备，引入额外的Lys(Fer)基团。

D21020：Caf-Lys(Caf)-Lys(Caf)-L150-Lys(Flu)如同D19185进行制备。在固相合成之后，在溶液中进行咖啡酸标记。

0328-018：Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-L150-Lys(Flu)如同D19185进行制备。在固相合成之后，在溶液中进行芥子酸标记。

D20118：使用L60连接物，以与D19112相同的方式制备。

D20086：使用L30连接物，以与D19112相同的方式制备。

D20120：使用L30连接物另外还有谷氨酸残基，以与D19112相同的方式制备。Boc-Glu(O-苄基)用于固相合成以建立在谷氨酸残基中。

D19048：在0.5g MBHA树脂上，制备Boc-L₁₅₀-Lys(Fmoc)。去除Fmoc基团，并用含100mg丽丝胺（Molecular Probes产品nr.L20，若丹明B磺酰氯）的2mL NMP（添加有80μLDIPEA）标记赖氨酸侧链氨基基团，3次，10min。之后，Boc基团用TFA去掉，并将Boc-Lys(2CIZ)结合至N端。中间产物H₂N-Lys(NH₂)-L150-Lys(丽丝胺)使用TFA：TFMSA：间甲酚：甲基苯基硫醚（6:2:1:1）从树脂上切割，并如D19112中所述用阿魏酸标记，以得到Fer-Lys(Fer)-L150-Lys(丽丝胺)。产物通过RP-HPLC纯化，分成两个分开的峰，表示丽丝胺的不同的异构体。第一种异构体在碱性水溶液中几乎变得无色，将其丢弃。第二种异构体在碱性水溶液中保持颜色和荧光，将其收集。

D19059：以与D19112相同的方式制备，但使用在添加有50μLDIPEA的1.5mLNMP中的100mg2,4-二硝基氟苯，在固相上在C端赖氨酸侧链氨基基团上标记二硝基苯基，2次，20分钟。

D18126：Fer-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)=Fer-(Lys(Fer)-L30)5-(L90-Lys(Flu))3。该延伸的结合物通过与D19112相同的途径进行制备：在固相上制备Boc-(Lys(2CIZ)-L30)5-(L90-Lys(Fmoc))3。用哌啶的NMP去除三个Fmoc基团，如D19112所述的那样引入三个羧基荧光素。从树脂上切割中间产物NH2-(Lys(NH2)-L30)5-(L90-Lys(Flu))3，并在N端和5个游离赖氨酸侧链用阿魏酸标记，用10%乙二胺的NMP洗涤，从TFA沉淀并用HPLC纯化。

D18146：在与D18126相同的赖氨酸连接物骨架上制备ACim-(Lys(ACim)L30)5-(L90-Lys(Flu))3。在从固相上切割之后，中间产物，荧光素标记的连接物被溶解在NMP中，并用DIPEA调节成碱性。0.1M于NMP中的4-氨基-肉桂酸用0.9当量HATU和3当量DIPEA活化30秒，并加至连接物。反应在2min后通过添加乙二胺至10%的终浓度而终止。在沉淀之后，产物通过RP-HPLC纯化。

D18074：Fer(Lys(Fer)-L30)5-Lys(NH2)，具有6个阿魏酸和游离赖氨酸侧链氨基基团的中间产物连接物通过固相化学法而制备，使用C端Boc-Lys(Fmoc)，之后交替结合Boc-L30连接物以及Boc-Lys(2CIZ)。在从树脂切割之后，中间产物NH2(Lys(NH2)-L30)5-Lys(Fmoc)在溶液中用阿魏酸标记，如关于D19112所述的。在使用10%乙二胺的最终处理中，Fmoc基团也被去除。该同型（homo）阿魏酸寡聚物用在葡聚糖结合物D21008的制备中。

D18118：NH2-Cys-(L90Lys(Flu))，该中间产物三荧光素连接物直接在固相上制备，使用Boc-Lys(Fmoc)来引入赖氨酸，在去除Fmoc之后，用羧基荧光素标记。使用Boc(S-对甲氧基苄基)半胱氨酸来引入N端半胱氨酸。

D18044：在固相上，如D18126般制备Fer-(Tyr-L30)5-(L90-Lys(Flu))3。N-Boc-O-2BrZ酪氨酸用来引入酪氨酸。在从树脂上切割之后，产物用HPLC纯化。

D21008：Dex70与D18074以及D18118结合。将10nmol乙烯基砜活化的70kDa葡聚糖于140μL水中与另一200μL水以及60μL0.8M碳酸氢钠pH9.5混合。该混合物用来溶解500nmol冻干的D18074。反应混合物在40℃保持60min，之后将另一溶解在250μL水中的500nmmolD18118以及另一50μL0.8M碳酸氢钠pH9.5加到反应混合物中。在于40℃反应另一60min之后，通过添加70μL0.165mM半胱氨酸于0.8M碳酸氢钠pH9.5而停止反应。结合物在superdex200上纯化，使用10mM CHES pH9.0、100mM NaCl于20%乙醇的水溶液作为洗脱剂。得到含有结合物的第一峰，之后是未结合的连接物。基于荧光素和阿魏酸的81%的总回收率，假设对于葡聚糖结合物也是同样回收率（81%），计算出相对于每个葡聚糖有111个阿魏酸和83个荧光素的比率，对应于(D18074)_18.0-Dex70-(D18118)_27.7。

D19059：在0.1g的MBHA树脂上，用标准固相化学法来制备Boc-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L₁₅₀-Lys(Fmoc)。Fmoc保护的赖氨酸侧链用NMP中的20%哌啶去保护（2×5min），并用溶于1.5ml NMP和50μLDIPEA中的150mg2-4-二硝基-氟苯标记2×20min。树脂用NMP中的20%哌啶、NMP和DCM处理。

用TFA：TFMSA：甲基苯基硫醚：间甲酚（6:2:1:1，1.5mL，1h）从树脂上切割中间产物，用***沉淀，再悬浮于TFA中，用***沉淀，再悬浮于NMP，再次用***沉淀。用100μLDIPEA调节成碱性，直接溶于0.5mL0.3M阿魏酸中（用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化）。在10min后，粗产物用***沉淀，再溶解于900μL NMP和100μL乙二胺中。在2min后，产物用***沉淀。再悬浮于TFA，用***沉淀，溶解在水（8.2mL）中的22%乙腈中，并进行RP-HPLC纯化。

得到8μmol，MS测为3582（M+Na），Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L₁₅₀-Lys(DNP)计算为3558,784。

D19112：在1g的MBHA树脂上，用标准固相化学法来制备Boc-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L₁₅₀-Lys(Fmoc)。Fmoc保护的赖氨酸侧链用NMP中的20%哌啶去保护（2×5min），并进行反复的羧基荧光素标记（3mL0.2M于NMP，用0.9当量HATU、1当量DIPEA预活化2min）3×20min。树脂用NMP中的20%哌啶处理，然后用NMP、DCM和TFA洗涤。中间产物用TFA：TFMSA：甲基苯基硫醚：间甲酚（6:2:1:1，3mL，1h）从树脂上切割，用***沉淀，再悬浮于TFA中，用***沉淀，再悬浮于NMP，再次用***沉淀。用200μL DIPEA调节成碱性，直接溶于2mL0.3M阿魏酸中（用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化）。在10min后，粗产物用***沉淀，再溶解于1350μLNMP中，并添加150μL乙二胺。在2min后，产物用***沉淀。再悬浮于TFA，用***沉淀，溶解在水（24mL）中的25%乙腈中，并进行RP-HPLC纯化。

得到19μmol，MS测为3749，Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L₁₅₀-Lys(Flu)计算为3750,998。

D19185：D19185类似于D19112制备，通过固相合成，之后在溶液中用阿魏酸标记。MS测为4054。

D19037：D19037类似于D19112制备，通过固相合成，之后在溶液中用阿魏酸标记。MS测为3447。

D18126：在MBHA树脂上，用标准固相化学法来制备Boc-(Lys(2CIZ)-L₃₀)₅L₉₀-Lys(Fmoc)-L₉₀Lys(Fmoc)-L₉₀Lys(Fmoc))。Fmoc保护的赖氨酸侧链用NMP中的20%哌啶去保护（2×5min），并进行反复的羧基荧光素标记（3mL0.2M于NMP，用0.9当量HATU、1当量DIPEA预活化2min）3×20min。树脂用NMP中的20%哌啶处理，然后用NMP、DCM和TFA洗涤。中间产物用TFA：TFMSA：甲基苯基硫醚：间甲酚（6:2:1:1，3mL，1h）从树脂上切割，用***沉淀，再悬浮于TFA中，用***沉淀，再悬浮于NMP，再次用***沉淀。用200μL DIPEA调节成碱性，直接溶于2mL0.3M阿魏酸中（用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化）。在10min后，粗产物用***沉淀，再溶解于1350μL NMP中，并添加150μL乙二胺。在2min后，产物用***沉淀。再悬浮于TFA，用***沉淀，溶解在水（24mL）中的25%乙腈中，并进行RP-HPLC纯化。

得到2μmol，MS测为10666。

通式：Y-(Lys(Y))3-L150-Lys(Z)的其他报告物的合成

前体的合成：

NH2-(Lys(NH2))3-L150-Lys(Fmoc)，（Pre4）

通过Boc-固相化学法，在MBHA树脂上制备Boc-(Lys(2CIZ))3-L150-Lys(Fmoc)-树脂，如前面所公开的。用6:2:1:1的TFA：TFMSA：间甲酚：甲基苯基硫醚从树脂上切割1小时，之后***沉淀，得到粗的NH2-(Lys(NH2))3-L150-Lys(Fmoc)。产物通过三次溶解于TFA之后用***沉淀以及从NMP中最终沉淀进行纯化。

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(NH2)，（Pre5）

将如上所述在1克MBHA树脂上制备的NH2-(Lys(NH2))3-L150-Lys(Fmoc)溶解在750μL MMP中，通过添加100μL DIPEA而变碱性。向溶液中添加1mL的0.25M HATU活化的阿魏酸。在10min反应后，添加200μL乙二胺，在5min反应后，通过经由***的沉淀而分离出粗产物，两次迅速溶解在TFA中并用***沉淀，最后溶解在水中的25%乙腈中，并进行RP-HPLC纯化。分离出18μmol，60mg，并分装成两个μmol部分，冻干。

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(7-羟基-4-甲基-香豆素-3-乙酸)（报告物6）

将Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(NH2)，2μmol，溶解在100μL NMP和5μL DIPEA中。50μL NMP中的2.3mg的7-羟基-4-甲基-香豆素-3-乙酸用3.5mg HATU以及3.5μL DIPEA活化1分钟，并添加至 Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(NH2)的溶液中。在10分钟反应之后，反应混合物通过添加20 μL乙二胺2分钟而终止，产物通过添加***来沉淀。将其溶解在200 μL TFA中，并用***沉淀，之后进行RP-HPLC纯化。得到4 mg。

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(7-氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸)（报告物7）

将Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(NH2)，2μmol，溶解在100μL NMP和5μL DIPEA中。50μL NMP中的2.3mg的7-氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸用3.5mg HATU以及3.5μLDIPEA活化1分钟，并添加至Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(NH2)的溶液中。在10分钟反应之后，反应混合物通过添加20μL乙二胺2分钟而终止，产物通过添加***来沉淀。将其溶解在200μL TFA中，并用***沉淀，之后进行RP-HPLC纯化。得到4mg。

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(7-二乙氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸)（报告物8）

将Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(NH2)，2μmol，溶解在100μL NMP和5μL DIPEA中。50μL NMP中的2.9mg 7-二乙氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸用3.5mg HATU以及3.5μLDIPEA活化1分钟，并添加至Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(NH2)的溶液中。在10分钟反应之后，反应混合物通过添加20μL乙二胺2分钟而终止，产物通过添加***来沉淀。将其溶解在200μL TFA中，并用***沉淀，之后进行RP-HPLC纯化。得到3mg。

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(萘并荧光素)（报告物9）

将Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(NH2)，2μmol，溶解在100μL NMP和5μL DIPEA中。50μL NMP中的6mg羧基-萘并荧光素用3.5mg HATU以及3.5μL DIPEA活化1分钟，并添加至Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(NH2)的溶液中。在10分钟反应之后，反应混合物通过添加20μL乙二胺2分钟而终止，产物通过添加***来沉淀。将其溶解在200μL TFA中，并用***沉淀，之后进行RP-HPLC纯化。得到5mg。

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(若丹明6G)（报告物10）

将Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(NH2)，2μmol，溶解在100μL NMP和5μL DIPEA中。加入5mg若丹明6G-NHS酯。在10分钟反应之后，反应混合物通过添加20μL乙二胺2分钟而终止，产物通过添加***来沉淀。将其溶解在200μL TFA中，并用***沉淀，之后进行RP-HPLC纯化。得到2mg。

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(德克萨斯红X)（报告物11）

将Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(NH2)，2μmol，溶解在100μL NMP和5μL DIPEA中。加入5mg德克萨斯红X NHS酯。在10分钟反应之后，反应混合物通过添加20μL乙二胺2分钟而终止，产物通过添加***来沉淀。将其溶解在200μL TFA中，并用***沉淀，之后进行RP-HPLC纯化。得到3mg。

含有上述荧光或显色标记物的所有报告物可以用于根据本发明在靶标位点形成第二底物的沉积以及作为使沉积可视化的染料。所选报告物在这两种应用中的用途的非限制性实例在以下实施例1～5中记载。

结合剂

山羊抗小鼠Dex70-HRP（D18033/D18175）

经13.7nmol二乙烯基砜活化的70kDA MW葡聚糖与602nmol HRP在600μL缓冲液（100mM NaCl、25mM NaHCO₃、pH9.5）中反应，30℃，3h。之后添加105μL水中的41.1nmol山羊抗小鼠F(ab)₂抗体，反应继续16h。反应混合物通过添加70μL0.165M半胱氨酸30min来终止，产物在superdex200上在100mM NaCl、10mM HEPES中（pH7.2）纯化。洗脱的产物是含有山羊抗小鼠（GaM）和HRP（相对于每个结合物为8个HRP和1.3个抗体，dex/GaM/HRP比率=1/1.1/7.5）的葡聚糖结合物。

抗-FITC-Dex70-HRP（D18058/D18144）

将10nmol二乙烯基砜活化的70kDA MW葡聚糖与440nmol HRP在400μL缓冲液（100mM NaCl、25mM NaHCO₃，pH9.5）中于30℃反应3h。之后，加入80μL水中的30nmol抗小鼠F(ab)₂抗体，反应在40℃再持续90min。反应混合物通过添加50μL0.165M半胱氨酸30min来终止，产物在superdex200上在100mM NaCl、10mM HEPES中（pH7.2）纯化。洗脱的产物是具有抗FITC抗体和HRP（相对于每个结合物为9个HRP和1.5个抗体；Dex/抗FITC抗体/HRP比率=1/2/9）的葡聚糖结合物。

兔-抗-FITC F(ab’) ₁ -HRP结合物（D19142/D19154）

兔抗FITC IgG多克隆抗体用胃蛋白酶在37℃消化4h，并在superdex200上进行纯化，以除去胃蛋白酶和Fc片段。

F(ab’)₂片段还用0.2M磷酸钠（pH6.0）中的5mM EDTA进行透析。溶液用AmiconUltra离心柱浓缩至25g/L的蛋白浓度。向6.0mL的溶液（150mg F(ab’)₂）的溶液中加入487μL的50mg/mL DTT和423μL的56mM2-巯基乙醇，二者均在水中。在室温下温和搅拌反应混合物40min，并立即在PD-10柱上用0.2M磷酸钠（pH6.0）的5mM EDTA中纯化。在8.0mL缓冲液中回收118mg F(ab’)₁。

将250mg HRP（Servac）溶解在2.5mL0.15m NaCl、0.05M磷酸钾（pH8）中并在相同缓冲液中透析。在透析之后，将酶溶液浓缩并调节成40mg/mL的浓度。向3.21mL的128.6mg HRP溶液中加入860μL15mg/mL SMCC，反应在室温下于暗室进行30min。SMCC活化的HRP酶在PD-10柱上用0.15m NaCl、0.05M磷酸钾（pH8）纯化。在7.9mL中回收126.9mg。

向8.0mL的F(ab’)₁加入6.25mL的SMCC活化的HRP溶液，用0.15m NaCl、0.05M磷酸钾（pH8）将总体积调整成43.8mL。抗体片段与酶之间的反应在室温下于暗室进行210min。之后，通过在室温下添加水中的343μL25mg/mL半胱胺15min来终止反应，反应混合物在较冷环境下存储过夜，等待纯化。将样本浓缩至8mL，以4部分应用至superdex200柱，并用150mMNaCl、50mM Tris（pH7.6）洗脱。产物在第一个峰洗脱，之后是未反应抗体和酶的峰。在多个级分中分离出100mg结合物。在280nm/403nm的UV测量显示出0.8～1.2的抗体酶配比。

山羊抗小鼠F(ab’) ₁ -HRP（D19150/D19147）

如同兔抗FITC F(ab’)₁-HRP般制备山羊抗小鼠F(ab’)₁-HRP，用DTT和巯基乙醇还原F(ab’)₂，并结合至SMCC活化的HRP。如同兔抗FITC F(ab’)₁-HRP，12当量的SMCC用于HRP活化，并使用1:1的F(ab’)₁与HRP的摩尔配比。

山羊抗兔F(ab’) ₁ -HRP（AMM279.168）

山羊抗兔F(ab’)₁-HRP如同兔抗FITC F(ab’)₁-HRP般制备，用DTT 和巯基乙醇还原F(ab’)₂，并结合至SMCC活化的HRP。如同兔抗FITC F(ab’)₁-HRP，12当量的SMCC用于HRP活化，并使用1:1的F(ab’)₁与HRP的摩尔配比。

结合剂山羊抗小鼠F(ab’) ₁ -HRP结合物（D19150）

通过与D19142相同的步骤来制备（GaM替代FITC）。

结合剂兔抗DNP F(ab’) ₁ -HRP结合剂（D19053）

该结合剂通过与D19142相同的步骤使用兔抗DNP多克隆抗体来进行制备。

结合剂兔抗FITC F(ab’) ₁ -碱性磷酸酶结合物（D20036）

兔抗FITC用胃蛋白酶消化，并还原成F(ab)₁，如同D19142所述。将4.23mL缓冲液中的44.9mg片段化抗体用于结合。在2.8mL缓冲液（25mM硼酸盐、200mM NaCl、5mM MgCl₂、0.2mM ZnCl₂，pH8.2）中的56mg碱性磷酸酶（Boehringer,MW140.000）与溶于107μL DMSO的1.6mg SMCC（相对于酶为12当量）在室温下暗室中反应25min。将活化的酶的溶液进行凝胶过滤，使用0.1M TRIS、0.2M NaCl、5mM MgCl₂、0.2mM ZnCl₂，pH8.2的缓冲液，以7mL的体积分离出55.3mg酶。将片段化抗体和活化的酶立即混合在一起，并还添加2.47mL的缓冲液0.1MTRIS、0.2M NaCl、5mM MgCl₂、0.2mM ZnCl₂，pH8.2。混合物在室温下反应150min，之后通过添加11.2mg半胱胺15min来终止反应。产物在Superdex200柱使用0.1M TRISI、5mM MgCl₂、0.2mM ZnCl₂（pH7.2）来纯化，洗脱为单个较宽的峰。对各个级分在IHC测定中测定AP活性和FITC结合，使用D19150来沉积报告物D19185，之后是不同的级分，最后是作为色原体的液体永固红。所有含主要产物的级分同等较好地进行并汇集。

与结合有HRP的Dex70结合的结合剂山羊抗小鼠抗体（D20052）

使11nmol70kDA MW葡聚糖与484nmol HRP在316微升的缓冲液A（100mM NaCl、25mMNaHCO₃，pH9.5）中于30℃反应3h。之后，向葡聚糖-HRP结合物中添加在169μL水中的66nmol山羊抗小鼠F(ab)₂，并使之反应1h。反应混合物通过添加70μL0.165M半胱氨酸30min而终止，产物在Sephacryl300（GE Medical）中用缓冲液B（100mM NaCl、10mM HEPES，pH7.2）纯化。洗脱的产物是含有山羊抗小鼠（GaM）和HRP的葡聚糖结合物。使用相对较短的结合时间，结合高分子量优化纯化，使得可以基于结合物大小将最终的结合物产物分成15个级分。对于各个产物级分、以及含有非结合抗体和HRP的级分的测量，显示出81%的结合物回收率，对应于8.91nmol的葡聚糖。总共的结合物级分（洗脱物的7～22级分）包含72.3nmol HRP和7.9nmol抗体，对应于平均8.1HRP/葡聚糖和0.88抗体/葡聚糖。级分7～8产生初始峰，之后是减弱（级分18～22）的较宽峰（级分9～17）。与结合有HRP的Dex70结合的山羊抗小鼠抗体（D20168）

与D20052完全相同的方式制备结合物。为得到具有相同数量的HRP的产物，仅收集级分9和10并集中在一起。

与结合有HRP的Dex-150结合的山羊抗小鼠抗体（D20060）

该结合剂如同D20052般制备，尽管使用更大分子量（150kDa）的葡聚糖。在纯化过程中，大部分的结合物在前4个级分中以单一峰洗脱。计算显示相对于每个葡聚糖分子平均为16.5个HRP和1.8个抗体。

与结合有HRP的Dex150结合的山羊抗小鼠抗体（L348.121）

使5.13nmol的150kDa MW葡聚糖与484nmol HRP在300微升的缓冲液（100mM NaCl、25mM NaHCO₃，pH9.5）中于40℃反应3h。之后，向葡聚糖-HRP结合物中添加169μL水中的66nmol山羊抗小鼠F(ab)₂，并使其在40℃再反应1h。反应混合物通过添加70μL0.165M半胱氨酸30min来终止，产物在Sephacryl300（GE Medical）在缓冲液B（100mM NaCl、10mMHEPES，pH7.2）中纯化。洗脱的产物是含有山羊抗小鼠F(ab)2和HRP的葡聚糖结合物。产物基于结合物大小分成3个级分：含有最大结合物的第一个级分（8～11），具有较小结合物的拖尾级分，以及未结合的蛋白。对于各个产物级分、以及含有未结合抗体和HRP的级分的测量显示出87%的总结合物回收率。假设引入的HRP与葡聚糖之间成正比，显示出级分8～11相对于每个葡聚糖包含20.6个HRP和2.32个抗体。级分10～11相对于每个葡聚糖包含10.9个HRP和0.96个抗体。仅有级分8～11用于实验。

结合物示例出如何使用较大葡聚糖结合物使得引入更多HRP。

与结合有HRP的Dex70结合的山羊抗兔抗体（L348.111，级分10～11）

使11nmol的70kDA MW葡聚糖与484nmol HRP在316微升缓冲液A（100mM NaCl、25mMNaHCO₃，pH9.5）中于40℃反应3h。之后，将44nmol山羊抗兔196μL水加到葡聚糖-HRP结合物中并在40℃再反应1h。反应混合物通过添加70μL0.165M半胱氨酸30min而终止反应，产物在Sephacryl300（GE Medical）以缓冲液B（100mM NaCl、10mM HEPES，pH7.2）纯化。洗脱的产物是含有山羊抗兔（GaR）和HRP的葡聚糖结合物。产物基于结合物大小分成4个级分：作为第一峰洗脱的含有产物的前两个级分（级分8～9），假定含有一些交联的结合物，之后是分为级分10～11（均匀的较大结合物）和级分12～21（较小的变化的结合物）的较宽肩部，最后是在级分22～42中的未结合酶和抗体。对于各个产物级分、以及含有未结合抗体和HRP的级分的测量显示出87%的结合物总回收率。假设引入的HRP与葡聚糖之间成正比，显示出级分10～11相对于每个葡聚糖包含10.9个HRP和0.96个抗体。仅这两个级分用于实验。

与结合有HRP的Dex70结合的抗HER2抗体（D21100，级分9～10）

使4.6nmol的70kDA MW葡聚糖与202nmol HRP在125微升缓冲液A（100mM NaCl、25mM NaHCO₃，pH9.5）中于30℃反应3h。之后，将489μL水中的18nmol抗Her2抗体加到葡聚糖-HRP结合物中，混合物在30℃再反应21h。反应混合物通过添加70μL0.165M半胱氨酸30min而终止反应，产物在Sephacryl300（GE Medical）以缓冲液B（100mM NaCl、10mMHEPES，pH7.2）纯化。洗脱的产物是含有抗Her2抗体和HRP的葡聚糖结合物。产物基于结合物大小分成4个级分：作为第一峰洗脱的含有产物的前两个级分（级分7～8），假定含有一些交联的结合物，之后是分为级分9～10（均匀的较大结合物）和级分11～19（较小的变化的结合物）的较宽肩部，最后是在级分20～41中的未结合酶和抗体。对于各个产物级分、以及含有未结合抗体和HRP的级分的测量显示出68%的结合物总回收率。假设引入的HRP与葡聚糖之间成正比，显示出级分9～10相对于每个葡聚糖包含9.1个HRP和0.6个抗体。仅这两个级分用于实验。

与结合有HRP的Dex70结合的抗FITC抗体（AMM353-022，级分8～11）

使11nmol的70kDA MW葡聚糖与484nmol HRP在316微升缓冲液A（100mM NaCl、25mM NaHCO₃，pH9.5）中于40℃反应3h。之后，将196μL水中的66nmol抗FITC抗体加到葡聚糖-HRP结合物中，混合物在40℃再反应1h。反应混合物通过添加70μL0.165M半胱氨酸30min而终止反应，产物在Sephacryl300（GE Medical）以缓冲液B（100mM NaCl、10mM HEPES，pH7.2）纯化。洗脱的产物是含有抗FITC抗体和和HRP的葡聚糖结合物。产物基于结合物大小分成3个级分：作为第一峰洗脱的含有产物的前面级分（8～11）、之后是较宽的肩部（较小的变化的结合物，级分12～27），最后是在级分28～45中的未结合酶和抗体。对于各个产物级分、以及含有未结合抗体和HRP的级分的测量显示出90%的结合物总回收率。假设引入的HRP与葡聚糖之间成正比，显示出级分10～11相对于每个葡聚糖包含11.7个HRP和0.80个抗体。仅这两个级分用于实验。

抗HER2-葡聚糖70-HRP（MAM371-047）

使11nmol二乙烯基砜活化的葡聚糖70（70kDa）与484nmol HRP在300μL160mM NaCl和40mM碳酸钠（pH9.5）中于30℃反应3h。提取210μL对应于7.7nmol葡聚糖的混合物，与930μL100mM NaCl中的30.8nmol兔抗HER2单克隆抗体于30℃反应21小时。反应通过添加114μL0.165M半胱氨酸而终止，产物在Sepharyl300上以100mM NaCl、10mM HEPES（pH7.4）作为洗脱液进行纯化。收集1.5mL的级分，对于各个级分估算抗HER2抗体和HRP的浓度。

当在单分子检测测定中对HER2阳性细胞系进行测试时，观察到在稀释至相同的抗HER2抗体浓度时，结合物的最大分子量第一级分（级分7～9）给出比级分10～12显著更少和略微较大的点。当结合物级分用HER2肽封闭并测试时，级分7～9给出比级分10～12更多的来自非特异性结合的点。

我们将级分10～12的更高特异性和选择性归于第一级分中大分子量葡聚糖-聚集体，其中多个葡聚糖经由多个抗HER2抗体而交联。这与所述的Sepharyl300的分离特征是一致的。对于本文记载的高度灵敏的测定，选择级分11。这是结合物的中间级分，在该级分之前和之后均有大约等量的结合物。结合相对于葡聚糖为1.48个抗体和8.95个HER抗体的总结合收率，我们总结级分11含有具有所述抗体和HRP 比率的明确的70kDa葡聚糖结合物。

所有上述结合剂可以用在本发明的可视化过程的不同步骤中。在本发明的过程中使用所选报告物的一些非限制性实例在以下实施例1～5中记载。

其他试剂

DAB显色液（Dako K3465）

LPR显色液（Dako K0640）

苏木精复染（Dako S3301）

洗涤缓冲液（Dako S3306）

靶标修复液（Dako S1699）

实施例1：使用DAB、阿魏酸和ACHCA作为第一底物的靶标可视化

作为恒定试验材料，使用***固定石蜡包埋细胞系的球状物的系列切片。所使用的细胞系是包埋在单个石蜡块中的Dako HercepTest^TM的0+、1+和3+对照细胞系。

具有含有细胞系的块的FFPE切片的16个玻片（之后称为“玻片”）通过浸在二甲苯（2×5min），接着在96%乙醇（2×2min）和70%乙醇（2×2min）中进行脱石蜡。玻片用去离子水洗涤，并转移到低pH靶标修复液（Dako S1700）中。之后，玻片在微波炉中加热至沸腾（约5min），之后温和煮沸10min。在转移至洗涤缓冲液Dako S2343中之前，使玻片冷却20min。

然后使用以下操作指南，将玻片在自动染色仪中染色：

-过氧化物酶封闭，Dako S2023，5min

-洗涤

-一抗：1微克/ml的抗Her2抗体，克隆DAK-HcT-2-DG44，在孵育介质1中10min

-洗涤

-二抗：山羊抗兔-葡聚糖70-HRP结合物，L357.161，如之前公开的进行制备，平均而言，相对于每个葡聚糖结合物为1.0个抗体和11个HRP。10pM浓度的结合物在孵育介质1中10min。一抗和二抗的浓度选择为，当使用优化的交联剂DAB时，在0+细胞系中给出每细胞一个或一些3～4微米的点，在1+细胞系中给出每细胞数个分开或合并的点，在3+细胞系中给出完全合并的强烈的膜染色；

-洗涤

-报告物沉积：在所有情况中，在沉积介质（50mM咪唑HCl pH7.5、0.1%NonidetP40、0.1%苯扎氯铵、0.005%（1.5mM）过氧化氢）中使用5μM D21067，Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-L150-Lys(Flu)和0.005%过氧化氢（1.5mM）五或十分钟。使用DAB作为交联剂，优化条件。所测试的交联剂是：

无，玻片1（10min）和玻片2（5min）

1mg/ml（5.2mM）阿魏酸，玻片3（10min）和玻片4（5min）

0.3mg/ml（1.5mM）阿魏酸，玻片5（10min）和玻片6（5min）

0.1mg/ml（0.52mM）阿魏酸，玻片7（10min）和玻片8（5min）

3mg/ml（16mM）α-氰基-4-羟基肉桂酸，玻片9（10min）和玻片10（5min）

1mg/ml（5.3mM）α-氰基-4-羟基肉桂酸，玻片11（10min）和玻片12（5min）

0.3mg/ml（1.6mM）α-氰基-4-羟基肉桂酸，玻片13（10min）和玻片14（5min）

0.12mg/ml（0.56mM）DAB，玻片15（10min）和玻片16（5min）

-三次洗涤

-抗FITC-AP：10min，20nM D20036于孵育介质1中

-三次洗涤

-LRP10min，与Dako K0640

-洗涤

-苏木精（Dako S3301），一份稀释到三份水中，5min

-用水洗涤

-洗涤

-玻片在水中脱盐5min，在99.9%乙醇中脱水2min，然后在Sakura的Tissue-Tek膜上进行膜封片

-玻片通过显微镜检查。

上述使用不同第一底物的沉积反应的条件已经优化，以获得较大点（尽可能大）的靶标染色（参见以下讨论），然而，它们是示例性的，并且反应可以在上述的其他条件下进行（参见说明书）。

结果：

明显地，在孵育于不含第一底物的沉积介质中的玻片1和2中没有观察到一点红色。即使3+细胞系在10min后也是完全空白的。相反，在最佳条件下，所有三种第一底物（在下文中称为“交联物”）在0+细胞系中产生每细胞一个或一些点。这表明本发明可视化***的信号放大能力与常规CSA***的强烈差异。

用DAB作为交联剂，3+细胞系示出完全宽泛的膜染色。在报告物沉积5min与10min之间的染色差异很小，很不显著。预期得到在0+和1+细胞系中观察到的点的数量。

作为交联剂的阿魏酸的最佳浓度为1.5mM。使用这种交联剂，关联于沉积时间的持续时间从5～10分钟增加，信号强度大大增加。与DAB介导的沉积相比，在阿魏酸介导的沉积5min之后，在0+细胞系中几乎看不到任何信号，而在10min后，看到与相应的DAB染色玻片一样多的点，甚至观察到更大的点。然而，这些点更加弥散，甚至在0+细胞系中也有很强的合并（coalescence）趋势。

作为交联剂的α-氰基-4-羟基肉桂酸的最佳浓度是约5.3mM。点大小与沉积时间相关，特别是与10min孵育相比，5min孵育之后观察到更小的点。与DAB和阿魏酸介导的染色相比，+3细胞系的膜染色的点是更小尺寸的非常分开可辨的点。在大多种情况中，点合并至明晰的几乎完全的膜染色。在0+和1+细胞系中，同样可观察到点非常分开可辨，很少合并或没有合并的趋势，可能是因为它们更小的尺寸和更加明晰的外观。有时候，需要对玻片更近进行检查以观察所有的点，此时更高的放大率和焦平面的调整是必要的。

染色结果的总结在以下表格中给出：

	DAB	阿魏酸	ACHCA
				最佳量	0.14mM	1.5mM	5mM
最佳H₂O₂量	1.5mM	0.9mM	0.6mM
				最佳沉积时间	5～10min	10～15min	10～15min
最佳第二底物	包含Fer或Sin	包含Sin	包含Fer
				点直径	3～4微米	3～4微米	2～3微米

反应条件的相对大的差异是相当惊人的，特别地，使用5mM DAB时，生成小的点或不生成点，且噪音染色显著；使用对于DAB为最佳的0.14mM的ACHCA时，根本不生成点。同样，对第二底物的偏好不同：报告物含有芥子酸时，ACHCA作为交联剂仅生成小的点（约1微米），相反，报告物含有芥子酸时，阿魏酸作为交联剂表现稍好。对于DAB，如果孵育时间从5min增加到10min，点尺寸的增加不显著，对于ACHCA也很小，而用阿魏酸作为交联剂孵育5分钟后，几乎不产生任何点。

所有交联剂即DAB、ACHCA和阿魏酸，都可以用于采用本文描述的放大***（或WO2011/0476680中描述的，或对于阿魏酸和DAB，WO2010/094283和WO2010/094284中记载的）来产生点状染色和常规均质化染色。ACHCA提供非常明晰的染色（点状和常规），DAB也是，然而，ACHCA相对于DAB具有很大的优势，即相比于DAB，含有化合物的溶液清澈和无色，甚至当ACHCA以高浓度用于常规染色时也是如此。这样使得所产生的染色具有由所用报告物的可检测标记物唯一定义的颜色，因此，有利于对染色样本的分析（通过图像分析，以及在显微镜下观察），提供预期的结果。此外，与DAB相比，ACHCA无毒，且其作为第一底物的表现更少依赖于沉积溶液中的过氧化物量，如果不是完全不依赖的话。相比于阿魏酸作为第一底物，迄今为止，用ACHCA获得的所有类型的染色均更明晰。

实施例2：用于组织学样本中靶标染色的新颜色

具有含有细胞系的块的FFPE切片的玻片（之后称为“玻片”）通过浸在二甲苯（2×5min），接着在96%乙醇（2×2min）和70%乙醇（2×2min）中进行脱石蜡。玻片用去离子水洗涤，并转移到低pH靶标修复液（Dako S1700）中。之后，玻片在微波炉中加热至沸腾（约5min），之后温和煮沸10min。在转移至洗涤缓冲液Dako S2343中之前，使玻片冷却20min。

然后使用以下用于荧光染色的操作指南，将玻片在自动染色仪中染色：

-过氧化物酶封闭，Dako S2023，5min

-洗涤

-一抗：抗Her2抗体，克隆DAK-HcT-2-DG44，1μg/mL，在孵育介质1中20min

-洗涤

-二抗：山羊抗兔-葡聚糖70-HRP，5皮摩尔，在孵育介质1中20min；

-三次洗涤

-第一沉积混合物：50mM咪唑：HCl pH6.8、0.58mM过氧化氢、5mM ACHCA和10μM报告物，10min。使用以下报告物：

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(7-羟基-4-甲基-香豆素-3-乙酸)

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(7-氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸)

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(羧基-荧光素)

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(德克萨斯红X)

Fer-Lys(Fer)-L150-Lys(丽丝胺)

-三次洗涤

-玻片在去离子水中脱盐，在99.9%乙醇中脱水，并用抗褪色荧光封片介质（Sakura）封片，并通过荧光显微镜观察。

结果：

报告物Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(7-羟基-4-甲基-香豆素-3-乙酸)和Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(7-氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸)生成小的（约2微米）但是分开的蓝色荧光点（当通过DAPI滤片观察时）；在+1细胞系中观察到比+0细胞系更多的点；在+3细胞系中，点合并至完全膜染色中。

当通过FITC滤片观察时，Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(羧基-荧光素)生成大的绿色荧光点（直径约3微米）。在+1细胞系中观察到比+0细胞系更多的点，在+3细胞系中，点合并到完全膜染色中。

当通过德克萨斯红滤片观察时，Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(德克萨斯红X)和Fer-Lys(Fer)3-L150-Lys(丽丝胺)生成大的（约3微米）红色荧光点。在+1细胞系中观察到比+0细胞系更多的点；在+3细胞系中，点合并到完全膜染色中。

对于显色染色，使用以下操作指南：

-过氧化物酶封闭，Dako S2023，5min

-洗涤

-二抗：山羊抗兔-葡聚糖70-HRP，5皮摩尔，在孵育介质1中20min

-三次洗涤

-第一沉积混合物：50mM咪唑：HCl pH6.8、0.58mM过氧化氢、5mMα-氰基-4-羟基肉桂酸和10μM Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(羧基-荧光素)，10min

-三次洗涤

-三抗：40nM抗FITC-HRP，在沉积介质1中10min

-三次洗涤

-第二沉积混合物：50mM咪唑：HCl pH6.8、0.58mM过氧化氢、5mMα-氰基-4-羟基肉桂酸和50μM报告物。使用以下报告物：

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(羧基-荧光素)

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(羧基-萘并荧光素)

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(若丹明6G)

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(7-二乙氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸)

Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(德克萨斯红X)

Fer-Lys(Fer)-L150-Lys(丽丝胺)

-三次洗涤

-苏木精5min

-用水洗涤

-玻片在水中脱盐5min，在99.9%乙醇中脱水2min，之后在Sakura的Tissue-Tek膜上进行膜封片，并通过明场显微镜进行观察。

所有报告物均产生有颜色的点，+1细胞系比+0细胞系更多。在+3细胞系中，点合并到完全膜染色中。点的颜色反映出报告物的颜色。 Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(7-二乙氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸)生成淡黄色的点，Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(羧基-荧光素)生成棕橙色的点，Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(若丹明6G)生成干净的红点，Fer-Lys(Fer)-L150-Lys(丽丝胺)生成品红色的点，Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(德克萨斯红X)生成紫色的点，且Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(羧基-萘并荧光素)生成青绿色的点。

这些实施例示例了ACHCA作为第一底物连同多样的荧光和有色报告物的巨大功用和多样性。单独α-氰基-4-羟基肉桂酸而没有报告物的对照试验并不生成任何荧光或可见的点，其可以是DAB被用作报告物分子的交联剂时的情况。其中一个原因是，ACHCA具有良好的可溶性并且在水溶液中无色，并且可以在靶标位点处获得清晰且明确的特定染料的颜色（作为点和同质性染色），其由报告物的颜色唯一指定，并且完全没有背景染色。这给出所述***的额外优点，特别是当复用和图像分析用于染色和染色结果分析时。

实施例3：组织学样本中低水平靶标的检测

使用MAM371-0477，抗HER2-葡聚糖70-HRP，级分11来检测低水平的HER2。

作为试验材料，使用具有细胞系MDA468的FFPE切片的玻片。该细胞系通常被称为“真正的零”，因为使用其他技术已经认为其没有HER2表达。玻片通过浸在二甲苯（2×5min），接着在96%乙醇（2×2min）和70%乙醇（2×2min）中进行脱石蜡。玻片用去离子水洗涤，并转移到低pH靶标修复液（Dako S1700）中。之后，玻片在PT-Link预处理模块（Dako）中加热至97度，持续20min。在转移至洗涤缓冲液DakoS2343中之前，玻片冷却至65度20min。

然后使用以下操作指南，将玻片在自动染色仪中染色：

-过氧化物酶封闭，Dako S2023，3min

-洗涤

-一抗：玻片1～3和7～9，没有一抗；玻片4～6，1μg/mL HER2抗体，在以下孵育介质中：0.1%4-氨基安替比林（4-aminoantipurine）、0.2%Procline、2%BSA、0.2%酪蛋白、2%PEG、0.1%吐温20、0.1M NaCl、10mM HEPES，pH7.2（ABCPT-缓冲液），20min

-洗涤

-二抗：玻片1～6，抗HER2-葡聚糖70-HRP，级分11，500pM于ABCPT-缓冲液中；玻片7～9，抗HER2-葡聚糖70-HRP，级分11，500pM+1μg/mL HER2肽于ABCPT-缓冲液中，20min

-两次洗涤

-第一沉积混合物：50mM咪唑：HCl pH6.8、0.58mM过氧化氢、5mMα-氰基-4-羟基肉桂酸和10μM Fer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(FITC)，10min

-两次洗涤

-三抗：40nM抗FITC-F(ab)1-碱性磷酸酶于ABCPT-缓冲液中，10min

-洗涤

-液体永固红，Dako K0640，10min

-洗涤

-苏木精，3min

-用水洗涤

-洗涤

玻片用去离子水脱盐，在99.9%乙醇中脱水，并用膜封片机（Sakura）封片，通过明场显微镜观察。在所有玻片上均观察到2～3μm的红点。在Scanscope（Aperio）上扫描玻片，并使用Indica Labs的“ISH算法vs.1.0”对图像进行自动图像分析。算法调整成检测红点以及蓝色核。仅对与核相距5微米以内的点进行计数。结果总结在下表中：

这些结果清楚地表明，MDA468细胞系确实表达非常低水平的HER2。使用Her2抗体（玻片4～6）或添加在孵育介质中的含有表位的HER2肽（玻片7～9）以阻断第一结合剂（抗HER2-葡聚糖70-HRP，级分11）对样本中Her2的结合的对照实验显示，第一结合剂与靶标之间的结合确实是特异性的。

实验也证实，无色的第一底物ACHCA对于信号需要放大至极限的低表达靶标检测具有很大的功用。

实施例4：对不同生物学标记物的快速灵敏的IHC染色

作为试验材料，使用如下玻片，其具有含不同的正常和死亡的人组织类型的阵列的块的FFPE切片（以下称为“玻片”）。

玻片通过浸在二甲苯（2×5min），接着在96%乙醇（2×2min）和70%乙醇中（2×2min）进行脱石蜡。玻片用去离子水洗涤，并转移到低pH靶标修复液（Dako S1700）中。之后，玻片在PT-Link预处理模块（Dako）中加热至97度，持续20min。在转移至洗涤缓冲液DakoS2343中之前，玻片冷却至65度20min。

然后使用以下操作指南，将玻片在自动染色仪中染色：

-过氧化物酶封闭，Dako S2023，3min

-洗涤

-一抗：Dako的RTUs，孵育3、5或8分钟（参见以下）

-洗涤

-二抗：山羊抗兔F(ab)1-HRP30nM和山羊抗小鼠30nM于孵育介质中，孵育介质为：0.1%4-氨基安替比林、0.2%Procline、2%BSA、0.2%酪蛋白、2%PEG、0.1%吐温20、0.1M NaCl、10mM HEPES，pH7.2（ABCPT-缓冲液），3min

-两次洗涤

-第一沉积混合物：50mM咪唑：HCl pH6.8、0.58mM过氧化氢、 13mM ACHCA和3.5μMFer-(Lys(Fer))3-L150-Lys(FITC)，3min

-两次洗涤

-三抗：50nM抗FITC-F(ab)1-HRP于ABCPT-缓冲液中，3min

-洗涤

-第二沉积混合物，50mM咪唑：HCl pH7.4、5.8mM过氧化氢、2.8mM DAB，3min

-洗涤

-苏木精，3min

-用水洗涤

-洗涤

-玻片在去离子水中脱盐，在99.9%乙醇中脱水，用膜封片机（Sakura）封片，并通过明场显微镜观察。

结果.

1.Pan特异细胞角蛋白，Dako IR053，孵育5min：

所有已知的细胞角蛋白阳性结构均染色。在肾组织中，低表达和高表达的位点均强烈染色。非常低表达的肝脏组织显示出完全的膜染色。

2.细胞角蛋白18，Dako IR618，孵育8min：

所有已知的细胞角蛋白18阳性结构均染色。非常低表达的肝脏组织示出完全的膜染色。

3.AMACR，Dako IR060，5min：

结肠粘膜强烈染色，脑组织也是。明显地，结肠平滑肌显示出多个小的粒状结构，并且非死者的***示出相当的粒状染色。

4.CD4，Dako IR649，8min：

低表达结构例如扁桃体生发中心中的巨噬细胞被染色，以及在肝脏中的非常低表达的Kupfer细胞中。

5.Ki67、Dako IR626，3min：

在所有组织类型中，一些***的单个细胞因强烈染色而清晰地显示出来。在生长的组织扁桃体和肠中存在大量的染色，包括扁桃体上皮中的低表达结构。

结论：在所有情况中，对于抗体的建议孵育时间是20min，Ki67 除外，对于这些RTU抗体，建议更加有效的高pH靶标。这些结果证实，更温和的组织保存靶标修复可以与较短的孵育时间组合使用，使用所有四种（二抗-HRP，沉积混合物三抗-HRP和DAB染色）基本孵育的3分钟持续时间仍得到非常强的染色。

在所有情况中，靶标染色看上去是非常明晰的常规均质化染色而没有点的清晰分辨率。

该实施例示出，ACHCA也可以用作提供常规的靶标染色形态（例如基于HRP-DAB的IHC常规染色）的染色***的成分。当需要对大量靶标进行染色并由此使细胞形态可视化时，可以使用该方法。

实施例5：作为第二底物的小结合物分子

如上所述，本文所述的放大***，像WO2011/0476680或WO2010/094283和WO2010/094284中记载的放大***一样，可以利用大量可以充当报告物的结合物分子。利用一些相对较大的结合物的染色过程的非限制性实例在以上实施例1～4中记载。该实施例描述采用相对较小的结合物分子作为报告物的组织学染色的非限制性情形。使用这些较小报告物用于靶标染色的一个优点是在采用DAB、ACHCA和阿魏酸的信号放大***中均产生较小的沉积，因此，样本中的靶标被可视化为较小的点。较小的结合物在提供常规类型的靶标染色（即，均质化非点状染色）的沉积条件下也可起作用。

合成

结合物

Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-β-丙氨酸-Lys(Flu)（D21155）

Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-gly-Lys(Flu)（D21154）

Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-Lys(Flu)（D21152）

使用Boc溶液相化学法与前述报告物相似地进行制备。简而言之，MBHA树脂装载有Boc-Lys(Fmoc)（装载量为约0.1mmol/g树脂）。之后进行与Boc-L30-OH（对于D19112和D21150为五个循环，对于D20118为两个循环，对于D20086为单次循环）的结合或与Boc-gly-OH（D21154）、Boc-β丙氨酸-OH（D21155）的结合。没有连接物结合至D21152。在所有情况下，之后进行两个循环的与Boc-Lys(2Cl-Z)-OH 的结合。Fmoc保护的赖氨酸侧链用NMP中的20%哌啶去保护（2×5min），并进行反复的羧基荧光素标记（0.2M于NMP，用0.9当量HATU、1当量DIPEA预活化2min）3×20min。树脂用NMP中的20%哌啶处理，然后用NMP、DCM和TFA洗涤。

用TFA：TFMSA：甲基苯基硫醚：间甲酚（6:2:1:1，3mL，1h）从树脂上切割中间产物，用***沉淀，再悬浮于TFA，用***沉淀，再悬浮于NMP，并再次用***沉淀，得到油状中间产物。用DIPEA调整成碱性，并直接溶解于用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化的0.3M阿魏酸中。在10min后，粗产物用***沉淀，再溶解于NMP，并添加10%乙二胺。在2min后，产物用***沉淀，并再悬浮于TFA，用***沉淀，溶解在水中的25%乙腈中，并进行RP-HPLC纯化。使用MALDI-TOF质谱来鉴定具有纯产物的级分。UV-VIS光谱学用来确定浓度和收率，使用498nm处（荧光峰）73.000的摩尔消光系数。

使用如上所述的合成法，可以通过在Z头和Y尾以及其他非氨基酸结构的一个位置或所有位置上用2,3-二氨基-丙酸或相似的较小二氨基酸替代赖氨酸而制备甚至更小的结合物。

使用结合物D21155、D21154和D21152对Her2进行免疫组织化学检测

将关于点尺寸的特性（performance）与之前描述的具有同类Y头的报告物以及具有不同类Y头的一个报告物进行比较，同类Y头的报告物为：

Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L30-Lys(Flu)（D20086）、

Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L60-Lys(Flu)（D20118）以及

Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L150-Lys(Flu)（D19112），

不同Y头的报告物为：

Sin-Lys(Sin)-Tyr-L150-Lys(Flu)D21150。

免疫化学染色如在以上实施例中记载的那样进行。

以下表格示出使用DAB作为第一底物的所测试组织学样本的染色结果：

*相对点尺寸约对应于最佳条件下以微米为单位的最大点直径，最佳条件为：组织的高pH靶标修复，10μM报告物，1.6mM H₂O₂和0.28mM DAB，室温下沉淀反应10min，用20nM抗FITC-AP进行报告物识别10min，之后是10min的LPR。已根据不同条件（靶标修复和报告物浓度）下的多个实验对不同组织样本和对照细胞系评价相对分数，并且是定性的。

通常而言，含有不同长度（参考表格，从“无”（即L是共价键）到至少150个原子（当L是L150时））的连接物化合物和不同Y头的所有报告物工作良好。然而，结果显示出，当期望较大尺寸（3～4微米）的点时，可能更优选延长的连接物，当希望点更小时（1～2微米），更优选具有短连接物的报告物。

如果假设点基本是球形的，则点的直径对应于立方级的报告物效率，报告物D21047在所有的测试条件下，通过提供最大的点而可再现地优于任何其他报告物。

具有甘氨酸连接物的报告物D21154，与具有相同Z头且没有延伸的β-丙氨酸连接物的相似报告物（D21152）或具有相同Z头和一个碳原子延伸的β-丙氨酸连接物的相似报告物（D21155）相比，生成更小的点。

具有延伸的Z头（4个阿魏酸衍生物或芥子酸衍生物）的报告物比在Z头具有3个阿魏酸或芥子酸衍生物的类似物引起更小的点。原因可能是，相比含有3个酶底物的那些，Z头中的4个酶底物可以以更快的速度形成沉积；非常高效的第二底物沉积可以形成更靠近酶活性中心的沉积，因此，被沉积覆盖的面积将更小，从而被可视化为更小直径的点。

具有简单的二取代的二肽Sin-Lys(Sin)-Tyr-作为Z头的报告物D21150表现良好。

在0.6～5.8mM H₂O₂的存在下，使用5mM ACHCA或1.5个阿魏酸来替代DAB作为第一底物，所有报告物也都产生点，然而，与使用DAB得到的点相比，点略微更小（25～50%）（在ACHCA的情况下）或更不清晰且颜色更弱（在阿魏酸的情况下）。

Claims

1.一种用于非诊断目的的用于检测样本中的固定化靶标的免疫化学方法，其中所述靶标固有地包括具有氧化还原酶酶促活性的酶或与具有氧化还原酶酶促活性的酶相连，所述方法包括在水溶液中孵育假定包括所述靶标的样本，所述水溶液包括

(i)所述具有氧化还原酶酶促活性的酶的第一底物，

(ii)所述具有氧化还原酶酶促活性的酶的第二底物，以及

(iii)过氧化物化合物，

其中所述第一底物是α-氰基-4-羟基肉桂酸(ACHCA)，所述第二底物是包括一种或多种能够作为所述具有氧化还原酶酶促活性的酶的底物的化合物以及可检测标记物的结合物分子，其是式(I)的结合物分子：

式(I)：(Y)n-L-(Z)m，

其中

Y是能够作为具有氧化还原酶酶促活性的酶的底物的式(II)的化合物：

式(II)：其中

R1是-H、-O-X、N(X)₂或-S-X；

R2是-H、-O-X、-N(X)₂或-S-X；

R3是-H、-OH、-NH₂或-SH；

R4是-H、-O-X、-N(X)₂或-S-X；

R5是-H、-O-X、N(X)₂或-S-X；

R6是-CON(X)₂或CO-X，

其中

H是氢；

O是氧；

S是硫；

N是氮；且

X是H、烷基或芳基；

Z是可检测标记物，

L是连接物化合物或化学键，

n是1～150的整数，

m是1～150的整数，

其中α-氰基-4-羟基肉桂酸(ACHCA)的量在0.15mM至50mM的范围内。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有氧化还原酶酶促活性的酶与选自酚氧化酶或过氧化物酶的酶相关联。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有氧化还原酶酶促活性的酶是过氧化物酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合物包括至少两个式(II)的化合物Y。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述结合物包括一个或多个阿魏酸残基。

6.根据权利要求1或权利要求4所述的方法，其中所述结合物包括可检测标记物，所述可检测标记物为荧光物质、发光物质、发色物质或放射性物质。

7.根据权利要求1所述的方法，其中ACHCA的量在0.75mM至5.75mM的范围内。

8.根据权利要求1所述的方法，其中ACHCA的量在5.85mM至50mM的范围内。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标并不固有地包括具有氧化还原酶酶促活性的酶，且所述具有氧化还原酶酶促活性的酶经由试剂与所述靶标相连。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述试剂是靶标特异性结合剂或能够特异性结合至与所述靶标相连或相关联的物质的试剂。

11.根据权利要求10所述的方法，包括

a)将假定包括所述靶标的样本与一种或多种结合剂孵育，形成样本a，其中至少一种结合剂是靶标特异性结合剂且至少一种结合剂包括具有氧化还原酶酶促活性的酶；

b)在权利要求1～8中任一项中所述的水溶液中孵育样本a，形成样本b；

c)在样本b中检测包括一种或多种能够作为所述具有氧化还原酶酶促活性的酶的底物的化合物以及可检测标记物的结合物分子的沉积。

12.根据权利要求1、9、10或11所述的方法，其中所述靶标是生物学分子。

13.根据权利要求10或11所述的方法，其中至少一种所述靶标特异性结合剂是抗体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中第一结合剂是包括过氧化物酶或酚氧化酶的一个部分的多克隆一抗的(Fab)₁片段，所述第一结合剂为直接并特异性地结合样本中靶标的结合剂。

15.根据权利要求13所述的方法，其中第二结合剂是包括过氧化物酶或酚氧化酶的一个部分的多克隆二抗的(Fab)₁片段，所述第二结合剂为直接并特异性地结合至直接与靶标相关联的物质的结合剂。

16.根据权利要求1-4和9-11中任一项所述的方法，其中所述样本是包括细胞的生物学样本。