CN103592435A

CN103592435A - 检测莫能菌素的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用

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Publication number: CN103592435A
Application number: CN201210290312.1A
Authority: CN
Inventors: 何方洋; 周德刚; 冯静; 岳欣荣; 韩京朋; 余厚美
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2012-08-15
Filing date: 2012-08-15
Publication date: 2014-02-19

Abstract

本发明涉及检测莫能菌素的磁颗粒化学发光试剂盒，包括的试剂有：发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。发光标记物是异鲁米诺发光标记物标记的莫能菌素半抗原，荧光标记物是指荧光素或其衍生物标记的莫能菌素单克隆抗体，分离试剂是指包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。本发明还涉及一种采用所述的试剂盒检测动物源性食品中莫能菌素的方法，本方法对莫能菌素检测具备较高的灵敏度、特异性和较快的检测速度。

Description

检测莫能菌素的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种直接化学发光检测试剂盒及其检测方法。特别是检测动物组织、饲料等样本中莫能菌素药物残留的磁颗粒竞争直接化学发光检测试剂盒。

背景技术

莫能菌素（Monensin）是聚醚类抗生素，被广泛用于动物疾病的治疗，其主要作用机理是干扰球虫细胞内钠钾离子的正常交换，是大量的钠离子进入细胞内，造成钠离子在胞内浓度高，渗透压上升，跟多的水分进图球虫内，为了排除细胞内多余的钠，球虫必须动用能量将多余的钠外泵排除，最终造成有限的能量被用完；而后钠钾离子交换中断停止，细胞膨胀、变形、破裂、崩解。莫能菌素还可以影响反刍动物瘤胃内能量代谢，改善瘤胃发酵，提高丙酸与乙酸的产出比例，降低挥发性脂肪酸，减少甲烷生成，提高蛋白质利用效率。因此能够显著提高反刍动物的饲料利用率和促进生长的作用。但是莫能菌素在动物食品中的残留会影响人类健康，因此，欧美国家及我国均规定了莫能菌素在动物组织中的最大残留量。

目前，莫能菌素药物的残留检测主要采用高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和酶联免疫吸附法等方法。

1、高效液相色谱法（HPLC）具有检测精度高、假阳性率低的特点。HPLC法的主要缺点是仪器价格昂贵，操作比较繁琐，耗时长，检测费用昂贵，对检测人员专业要求较高，样本前处理较复杂。

2、气相色谱-质谱法（GC-MS）灵敏度很高，假阳性率低。该方法的主要缺点是样品需要衍生化这样复杂的前期处理。虽然经过衍生化处理的样品能在质谱中给出更多的结构信息，但是衍生化会产生多个不同的产物并导致样品的部分丢失，造成实验结果的偏差。

3、酶联免疫法（ELISA）是20世纪70年代出现，用于微量物质的检测，最早应用于传染病、肿瘤标志物、激素水平等临床检测，90年代开始在我国食品安全检测领域推广应用，目前依托ELISA技术的试剂盒、试纸条已经成为食品安全快速检测领域的主导产品，同时也是我公司研发和销售的主要产品类型。酶联免疫检测法基于抗原-抗体的特异性反应，检测灵敏度较高、特异性较好，技术操作简易，容易掌握，确实解决了大量的以前难以解决的许多微量小分子物质如抗生素、激素、农药残留等的定性、定量分析工作，对食品安全快速检测技术的发展起到了积极的促进作用。但是，ELISA方法存在许多自身无法克服的缺陷，主要表现在：

1）非均相反应：检测过程中为分离游离物与结合物，需要多步洗板过程，耗时费力，难以提高操作的自动化程度。

2）酶催化反应：借助酶催化底物显色，测定反应液吸光度值。反应的时间与温度对酶活力存在较大影响，试剂稳定性差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测莫能菌素的化学发光试剂盒，采用该试剂盒进行莫能菌素的检测时不仅具备较高的灵敏度，特异性，而且具有较高的反应速度。

本发明的另一个目的在于提供一种莫能菌素的测试方法，该方法操作简单，灵敏度高，特异性好。

实现上述目的，本发明提供一种莫能菌素检测试剂盒，其包含的主要试剂有：发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。

所述的分离试剂是包被有羊抗FITC抗体的顺磁性纳米微珠。

所述的顺磁性纳米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH₂活性基团的微珠，用于包被羊抗FITC单克隆抗体，其内芯是Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃，使得微珠具有顺磁性。

所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的莫能菌素半抗原。所述的异鲁米诺衍生物是ABEI、AHEI或ABEN。

所述的试剂盒还包括标准品，质控品和浓缩洗液。

所述的荧光素标记物是FITC标记莫能菌素单克隆抗体。

本发明还提供一种利用试剂盒检测莫能菌素的方法，包括下列步骤：

1）分别吸取20μl-100μl标准品或样本，然后加入20μl-100μl发光标记物，再加20μl-100μl荧光素标记物，充分混匀后，37℃温育15min；

2）加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150μl，混匀后在37℃温育5min；

3）用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500μl冲洗复合物沉淀；

4）上述清洗步骤重复2-4次；

5）所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度（RLU），样本中的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU集合标准曲线法计算莫能菌素的浓度。

所述的发光底物的主要成分是NaOH和H₂O₂。

本发明中分析测试方法所用的分析仪是：包括电源电路、自动注射泵1和2、测量室、发光室、光电倍增管计数器和输出***，同时还配置有计算机与中文界面的Windows控制软件，可进行资料录入、结果汇总、质量控制、结果储存和结果查询等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告结果，自动生成并储存、更新功能，两点自动修正标准曲线，所采用的***是 CI-2008 ***。

本发明所述的分离试剂是包被羊抗FITC单克隆抗体，其表面基团的含量是0.1-0.3eqm/g，其保存于含有8-10%卵清蛋白，0.05-0.10%Tween-20，0.02-0.04%NaN₃，pH7.2 的PBS缓冲液中。所述的FITC是异硫氰酸荧光素。所述百分含量为质量百分含量。

所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物ABEI、AHEI或ABEN标记的莫能菌素半抗原，其保存于含pH7.2，0.1-0.3%Tween-20，0.01%NaN₃的PBS缓冲液中。所述百分含量是质量百分含量。

所述的荧光素标记物是FITC标记的莫能菌素单克隆抗体，其保存于pH7.2，含5-8%牛血清白蛋白，0.02-0.04%NaN₃的PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

莫能菌素标准品溶液（0ng/ml，0.02ng/ml，0.06ng/ml，0.18ng/ml，0.54ng/ml， 1.6ng/ml），标准品稀释液为pH7.2，0.03%NaN₃，0.1mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

莫能菌素质控品溶液浓度分别为0.05ng/ml，1.0ng/ml，质控品稀释液pH7.2，0.03%NaN₃，0.1mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

所述的浓缩洗液为pH7.2，0.2-0.4%Tween-20，0.02-0.04% NaN₃，0.1-0.2mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

本发明的有益效果如下：

1）本发明试剂盒可特异性检测莫能菌素。

2）本发明试剂盒的灵敏度较高，对莫能菌素的检测灵敏度可达0.02g/ml。

3）本发明试剂盒的检测快捷，检测时间低于20min。

具体实施方式

实施例一试剂盒具体组分的制备

1）莫能菌素人工抗原的制备

将莫能菌素与牛血清白蛋白（BSA）采用活化酯法(NHS-DCC)进行偶联得到免疫原。

3）单克隆抗体的制备

动物免疫：以免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。

细胞融合和克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9 ：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，得到单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的制备与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁷个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到单克隆抗体。

4）发光标记物的制备

取4.5mmol/L ABEI，溶于4ml蒸馏水中，5.0mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺溶于0.5ml N，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混匀后室温反应3-4h。取上述制备的莫能菌素半抗原15mg，用pH7.4 PBS调节体积到1.5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混匀后室温反应过夜，过G-25凝胶柱纯化。

5）荧光标记物制备

用0.025mol/L，pH9.0的碳酸盐缓冲液将莫能菌素单克隆抗体稀释成1.0％质量百分比浓度；根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0.01mg FITC，用分析天平准确称取所需的FITC粉末。用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液，按上述抗体溶液体积的3-5倍，混入FITC稀释液；在4~℃避光条件下电磁搅拌、标记30-48h；将标记溶液3000r/min，室温离心20min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再pH7.4的PBS缓冲液透析2-3天，期间至少更换透析液3次；取透析过夜的标记物，通过SephadexG-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光标记物进行鉴定，分装，贮存于4℃冰箱中。

6）分离试剂制备

a）磁珠活化

表面-COOH基团的磁珠（购于DYNAL，粒径为2.8μm），其含量是0.15eq/g；取100μl磁珠，用100μl 25mmol/L, pH5.0, 0.05%Tween-20 MES溶液洗涤两次，磁分离后移除上清；使用前，用4℃贮存的25mmol/L MES溶液分别配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μl 新配置的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min；离心管置于磁分离架上磁分离4min，移除上清，加入100μl，25mmol/L，pH5.0, MES清洗2-3次后即可得表面羧基活化的磁珠。

b）磁珠偶联羊抗FITC单克隆抗体

将50-100μg羊抗FITC单克隆抗体溶解到60μl，25mmol/L，pH5.0 MES中，用所述MES溶液调节总体积至100μl，轻柔混匀磁珠与抗体；室温条件下至少偶联30min或4℃偶联2h，该期间可利用涡旋仪使磁珠保持混匀状态；离心管置于磁分离架上磁分离3-5min，移除上清；为了淬灭未反应的-COOH，可加入100μl，pH7.4，TRIS反应15min或100μl，pH8.0，含有50mmol/L乙醇胺的PBS封闭磁珠；用100μl，0.1-0.3%BSA，0.1%Tween-20的PBS或TRIS清洗封闭好的磁珠3-5次；最后将磁珠复溶于含0.1-0.5%BSA，0.01-0.1%Tween-20，0.02%NaN₃的PBS或TRIS缓冲液中，2-8℃保藏。

实施例二试剂盒的组建

组建检测莫能菌素的磁颗粒直接竞争化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：

FITC标记的莫能菌素单克隆抗体的荧光标记物

ABEI标记的莫能菌素半抗原的发光标记物

表面包被羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠的分离试剂

莫能菌素标准品溶液（0ng/ml，0.02ng/ml，0.06ng/ml，0.18ng/ml，0.54ng/ml，1.6ng/ml），标准品稀释液为pH7.2，0.03%NaN₃，0.1mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

浓缩洗液为pH7.2，0.2-0.4%Tween-20，0.02-0.04% NaN₃，0.1-0.2mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。

实施例三实际样品中莫能菌素的检测

1、样本前处理

（一）猪肉/肝前处理方法

用均质器均质样本；称取3.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml甲醇，再加入1ml去离子水，振荡5min，3000g以上，室温（20-25℃）离心5min；取2ml上清液至50ml塑料离心管中，加入2ml 1M 氢氧化钠溶液混匀，再加入6ml正己烷，涡动3min，3000g以上，室温（20-25℃）离心5min；取3ml上清液至10ml玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干，加入1ml复溶工作液涡动2～3min；取50μl用于分析，样本稀释倍数：2。

（二）鸡肉/肝前处理方法

用均质器均质样本；称取3.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml甲醇，再加入1ml去离子水，振荡5min，3000g以上，室温（20-25℃）离心5min；取2ml上清液至50ml塑料离心管中，加入1ml 2M 氢氧化钠溶液混匀，再加入6ml正己烷，涡动3min，3000g以上，室温（20-25℃）离心5min；取3ml上清液至10ml玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干，加入1ml复溶工作液涡动2～3min；取50μl用于分析，样本稀释倍数：2。

2、用试剂盒检测与结果分析

分别吸取20μl-100μl标准品或样本，然后加入20μl-100μl发光标记物，再加20μl-100μl荧光素标记物，充分混匀后，37℃温育15min；加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150μl，混匀后在37℃温育5min；用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500μl冲洗复合物沉淀；所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度（RLU），样本中莫能菌素的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU结合标准曲线法计算莫能菌素的浓度。

激发底物1是NaOH，激发底物2是H₂O₂。底物装载前，用蒸馏水清洗底物泵10-20遍，排空管道内残存的水迹后，再将相应的底物直接放入仪器内，将泵管***底物瓶中；用底物冲洗管道5次，并测定底物的RLU值，正常情况下，底物的RLU值不应超过1200。若超过1200，需重新用蒸馏水对管道和底物泵进行更多次清洗，直至空白值降至合理范围内。若超过三天不做实验，需卸载底物瓶，并盖上盖子，以防蒸发。随后用蒸馏水清洗管道，并排空，以免强碱溶液腐蚀底物泵。

本发明采用6个莫能菌素标准品（0ng/ml，0.02ng/ml，0.06ng/ml，0.18ng/ml，0.54ng/ml，1.6ng/ml）进行曲线测绘。仪器根据所述方法检测得到一条RLU值与莫能菌素浓度相关的定标曲线，此后测量中，每一个样本中的莫能菌素浓度与标准曲线相比较得出样本中的莫能菌素含量。

实施例四试剂盒质量的测定

1、试剂盒的灵敏度

试剂盒灵敏度的定义为：测定20次零标准品，测定的平均值加上3倍标准差。该试剂盒的灵敏度为0.02ng/ml。

2、样本的准确度和精密度

准确度是指测定值与真值间的符合程度，试剂盒准确度常用回收率表示。精密度又称可重复性，常用变异系数表示。

按照实施例三的样本提取方法，以0.08ng/g、0.16ng/g两个浓度的莫能菌素分别对鸡肉、猪肉样本进行添加回收，每种样本每个浓度各4个平行，用三批试剂盒进行测定，计算样本的平均回收率及精密度。实验结果见下表。

表1 准确度和精密度测定 ng/g

从表可知，猪肉、鸡肉样品中莫能菌素两个浓度均添加的平均回收率范围在87.5-102.0%之间，批内、批间均变异系数小于15%。

3、特异性

交叉反应率是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。

表2 试剂盒交叉反应率

药物名称	交叉反应率
		莫能菌素	100%
盐霉素	小于1%
		马杜霉素	小于1%

4、相关性

X=CI-2008，Y=RIA

Y=1.26X-2.83

R=0.9671

X为CI-2008***测定结果，Y为放免测定结果。

Claims

1.一种检测莫能菌素的磁颗粒化学发光试剂盒，包括的试剂有：发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的分离试剂是包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的顺磁性纳米微珠是里面包覆有Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃，表面含有-OH、-COOH或-NH₂活性基团的微珠。

4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的莫能菌素半抗原。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的异鲁米诺发光标记物是ABEI、AHEI或ABEN。

6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括标准液、质控品和浓缩洗液。

7.根据权利要求1-3之一所述的试剂盒，其特征在于：所述的荧光素标记物是FITC标记的莫能菌素单克隆抗体。

8.一种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒检测莫能菌素的方法，包括下列步骤：

4）上述清洗步骤重复2-4次；

5） 4）所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度（RLU），样本中莫能菌素的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU集合标准曲线法计算莫能菌素的浓度。