CN103589711A - 一种二氧化碳转化酶的固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种二氧化碳转化酶的固定化方法，步骤为（1）试剂的配制：酶溶液配制；碳纳米管溶液配制；氯化钙溶液配制；壳聚糖溶液配制；海藻酸钠溶液配制；（2）酶固定化步骤：将碳纳米管溶液，酶溶液及氯化钙溶液置于离心管中，反复摇匀，获得液体I；向液体I中加入壳聚糖溶液，混合均匀，获得液体II；取海藻酸钠溶液与碳纳米管溶液混合，搅拌，获得液体III；将液体II逐滴滴入液体III中，静置，形成微胶囊；洗涤微胶囊，过滤；置于氯化钙溶液中硬化，洗涤，获得固定化的含酶微胶囊。本发明的方法具有固定化率高，固定效果好，酶活损失少，稳定性强等优点。

Description

一种二氧化碳转化酶的固定化方法
技术领域
本发明涉及生物酶固定化技术，具体涉及CO2转化酶的固定化方法。
背景技术
生物酶法转化CO2主要是利用生物酶作为催化剂转化CO2生成甲酸、甲醇或其他一些有机酸，完成物质的代谢过程，并生成生物体内的代谢产物，如草酰乙酸，α-酮戊二酸，异柠檬酸等。目前，已有多种酶催化反应固定CO2的方法。Miyazaki等报道了一种新的酶合成方法，以丙酮酸脱羧酶为催化剂，硫胺素焦磷酸为辅酶，在高pH缓冲液条件下，以CO2和乙醛为底物实现了由CO2到丙酮酸的转化。此后又采用此法实现了CO2到乳酸的酶法合成。在此基础上，Tong等提出了一个新的多酶体系：醇脱氢酶（ADH）、丙酮酸脱羧酶（PyDC）和乳酸脱氢酶（LDH），以乙醇和CO2为底物，NAD+为辅酶并加入焦磷酸硫胺素，通入CO2来引发反应合成乳酸，同时伴随着内在辅因子的循环再生。
酶固定化效率的关键是如何设计和制备出适宜的固定化载体,从而为酶提供适宜的微环境，使固定化酶具有较高的催化活性和稳定性。研究表明纳米纤维作为载体的酶催化研究中，直径在100nm的聚合物纤维把酶催化有机合成反应的效率提高了5000倍之多，显示纳米结构独特的表面物理和化学性质对酶的催化活性有很大影响。因此，以碳纳米管材料为基础，开展酶或细胞的固定化具有广阔的应用前景。目前，CO2转化酶的固定化研究相对较少。现有的多孔无机材料固定酶具有酶活性丧失较多和酶稳定向下降较快等诸多不足。本发明主要针对CO2转化酶设计了无机材料和有机材料结合的新型固定化方法，游离酶酶和固定化酶的活性和稳定性分析表明，本发明的技术对CO2转化酶具有很好的固定效率，对于CO2转化研究具有重要的科学意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的酶催化活性和稳定性低的缺陷，提供一种二氧化碳转化酶的固定化方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种二氧化碳转化酶的固定化方法，包括以下步骤：
（1）试剂的配制：
①酶溶液的配制：取10uL浓度为1600-2500U/mL二氧化碳转化酶加入到1mL0.05mol/LTris-HCl pH=7.0缓冲液中，混匀，得到酶溶液；
②碳纳米管溶液的配制：取参数为：表面积是250-300m2/g，灰度小于3%，纯度高于97%，长度5-15μm，直径0.1-10nm的碳纳米管，用0.05mol/L Tris-HCl pH=7.0缓冲液配制成5mg/mL的碳纳米管溶液；
③氯化钙溶液的配制：取无水氯化钙用去离子水配制成0.02mg/mL的氯化钙溶液；
④壳聚糖溶液的配制：取壳聚糖用体积浓度为1%的乙酸水溶液配制成5-20mg/mL的壳聚糖溶液；
⑤海藻酸钠溶液的配制：取海藻酸钠用去离子水配制成2-2.5g/mL的海藻酸钠溶液；
（2）酶固定化步骤：
①将0.5mL碳纳米管溶液，0.005mL酶溶液及0.2mL氯化钙溶液置于2mL离心管中，反复摇匀，获得液体I；
②向液体I中加入0.5mL壳聚糖溶液，用取液器反复吸入、推出，使之混合均匀，获得液体II；
③取15mL海藻酸钠溶液与15mL的碳纳米管溶液混合，搅拌30min，获得液体III；
④用一次性的针头直径为0.7mm的注射器将液体II逐滴滴入液体III中，静置10-15min，形成微胶囊；
⑤用0.05mol/L Tris-HCl pH=7.0缓冲液洗涤微胶囊，过滤；
⑥将步骤⑤获得的微胶囊置于氯化钙溶液中硬化15min，用0.05mol/L Tris-HCl pH=7.0缓冲液洗涤，获得固定化的含酶微胶囊。
所述二氧化碳转化酶优选乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶或草酰乙酸脱羧酶。
本发明优点和效果：
1.本发明制备的固定化的含酶微胶囊经过一定处理后填充入发酵容器内，操作简单，灭菌方便。
2.本发明制备的固定化的含酶微胶囊经过灭菌后可以再次接种、重复使用。
3.本发明制备的固定化的含酶微胶囊提供了很好的催化微环境，使二氧化碳转化酶催化活性和稳定性得到显著提高。
4.减少了制备过程中固定化酶的损失，使成球效果更好，最大限度的保留了酶的活性。
具体实施方式
本发明的原理是通过多孔纳米材料对生物酶进行包埋处理，由于这些材料多孔，培养液及产物传质效果较好。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种二氧化碳转化酶的固定化方法，包括以下步骤：
（1）试剂的配制：
①酶溶液的配制：取10uL浓度为2500U/mL乳酸脱氢酶加入到1mL0.05mol/L Tris-HClpH=7.0缓冲液中，混匀，得到酶溶液；
②碳纳米管溶液的配制：取参数为：表面积是250-300m2/g，灰度小于3%，纯度高于97%，长度5-15μm，直径0.1-10nm的碳纳米管，用0.05mol/L Tris-HCl pH=7.0缓冲液配制成5mg/mL的碳纳米管溶液；
③氯化钙溶液的配制：取无水氯化钙用去离子水配制成0.02mg/mL的氯化钙溶液；
④壳聚糖溶液的配制：取壳聚糖用体积浓度为1%的乙酸水溶液配制成5mg/mL的壳聚糖溶液；
⑤海藻酸钠溶液的配制：取海藻酸钠用去离子水配制成2g/mL的海藻酸钠溶液；
（2）酶固定化步骤：
①将0.5mL碳纳米管溶液，0.005mL酶溶液及0.2mL氯化钙溶液置于2mL离心管中，反复摇匀，获得液体I；
②向液体I中加入0.5mL壳聚糖溶液，用取液器反复吸入、推出，使之混合均匀，获得液体II；
③取15mL海藻酸钠溶液与15mL的碳纳米管溶液混合，搅拌30min，获得液体III；
④用一次性的针头直径为0.7mm的注射器将液体II逐滴滴入液体III中，静置13min，形成微胶囊；
⑤用0.05mol/L Tris-HCl pH=7.0缓冲液洗涤微胶囊，过滤；
⑥将步骤⑤获得的微胶囊置于氯化钙溶液中硬化15min，用0.05mol/L Tris-HCl pH=7.0缓冲液洗涤，获得固定化的含酶微胶囊。
实施例2
一种二氧化碳转化酶的固定化方法，包括以下步骤：
（1）试剂的配制：
①酶溶液的配制：取10uL浓度为1600U/mL苹果酸脱氢酶加入到1mL0.05mol/L Tris-HClpH=7.0缓冲液中，混匀，得到酶溶液；
②碳纳米管溶液的配制：同实施例1步骤（1）②；
③氯化钙溶液的配制：同实施例1步骤（1）③；
④壳聚糖溶液的配制：取壳聚糖用体积浓度为1%的乙酸水溶液配制成10mg/mL的壳聚糖溶液；
⑤海藻酸钠溶液的配制：取海藻酸钠用去离子水配制成2.3g/mL的海藻酸钠溶液；
（2）酶固定化步骤：
①-③同实施例1步骤（2）①-③；
④用一次性的针头直径为0.7mm的注射器将液体II逐滴滴入液体III中，静置10min，形成微胶囊；
⑤-⑥同实施例1步骤（2）⑤-⑥。
实施例3
一种二氧化碳转化酶的固定化方法，包括以下步骤：
（1）试剂的配制：
①酶溶液的配制：取10uL浓度为2200U/mL草酰乙酸脱羧酶加入到1mL0.05mol/LTris-HCl pH=7.0缓冲液中，混匀，得到酶溶液；
②碳纳米管溶液的配制：同实施例1步骤（1）②；
③氯化钙溶液的配制：同实施例1步骤（1）③；
④壳聚糖溶液的配制：取壳聚糖用体积浓度为1%的乙酸水溶液配制成20mg/mL的壳聚糖溶液；
⑤海藻酸钠溶液的配制：取海藻酸钠用去离子水配制成2.5g/mL的海藻酸钠溶液；
（2）酶固定化步骤：
①-③同实施例1步骤（2）①-③；
④用一次性的针头直径为0.7mm的注射器将液体II逐滴滴入液体III中，静置15min，形成微胶囊；
⑤-⑥同实施例1步骤（2）⑤-⑥。
实验结果表明，本发明的固定化的含酶微胶囊为二氧化碳转化酶提供了很好的催化微环境，使二氧化碳转化酶催化活性和稳定性提高，酶的包埋率较非杂合的有机材料微囊具有明显的提高。本发明减少了制备过程中固定化酶的损失，使成球效果更好，最大限度的保留了酶的活性。
实施例4
1.酶活测定：分别选取了乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和草酰乙酸脱羧酶进行了酶活测定和固定化的含酶微胶囊分析。
（1）乳酸脱氢酶(LDH)酶活测定：分光光度法--乳酸脱氢酶以NADH为辅酶，NADH在340nm有特征吸收峰，通过340nm处的吸光值的改变来定量测定酶的含量。游离酶的酶活测定：一只石英比色皿中加0.05mol/L pH=7.0的Tris-Hcl缓冲液3mL在340nm处调零，另一只中加入丙酮酸钠溶液2.9mL，NADH溶液0.1mL，（NADH溶液：称3.5mg纯NADH置于试管中，加缓冲液1mL摇匀；丙酮酸溶液：称2.5mg丙酮酸钠，加缓冲液29mL,使其完全溶解，现用现配）加盖摇匀后测吸光值，再加入经稀释的酶液5μL，摇匀后每隔0.5min测定吸光值，连续测定3min。以A对时间作图，取反应最初线性部分计算出每分钟吸光度的降低值ΔA。
Figure BDA0000406363060000041
（2）苹果酸脱氢酶(MDH)酶活力测定方法：分光光度法--苹果酸脱氢酶以NADH为辅酶，NADH在340nm有特征吸收峰，通过340nm处的吸光值的改变来定量测定酶的含量。一只石英比色皿中加0.05mol/L pH7.0的Tris-Hcl缓冲液3mL在340nm处调零，另一只中加入草酰乙酸溶液2.9mL，NADH溶液0.1mL，（NADH溶液：称3.5mg纯NADH置于试管中，加缓冲液1mL摇匀；草酰乙酸溶液：称3mg草酰乙酸，加缓冲液29mL，现用现配）加盖摇匀后测吸光值，再加入经稀释的酶液5μL，摇匀后每隔0.5min测定吸光值，连续测定3min。以A对时间作图，取反应最初线性部分计算出每分钟吸光度的降低值ΔA。
Figure BDA0000406363060000042
（3）草酰乙酸脱羧酶酶活的测定方法：根据底物草酰乙酸于反应过程中在265nm处的吸光值减少来测定酶活，1mL酶反应体系包括:0.05mol/L，pH7.0的Tris-Hcl缓冲液，1mmol/L的草酰乙酸溶液，待反应体系在265nm处的吸光值稳定后，加入至少10μL的草酰乙酸脱羧酶的常备溶液。计算底物草酰乙酸于反应过程中在265nm处的吸光值的减少量。酶活力定义为每分钟催化1μmol草酰乙酸脱羧的酶量（IU），可根据下面公式进行计算，酶活力=ΔA265·1mL/ε265·min·cm，其中ε265=0.95L·mmol-1·cm-1。比活力为每mg酶蛋白的酶活力。
2.固定化的含酶微胶囊的酶活测定：用Tris-HCl缓冲液对固定化酶进行洗涤，测定酶活力，方法同步骤1的（1）（2）和（3）。在每次反应后，将固定化的含酶微胶囊进行过滤并用0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH=7.0）洗涤，以除去底物和产物。然后将固定化的含酶微胶囊再置于新鲜的反应体系中并再次测定酶的活性。将固定化的含酶微胶囊的初始活性认为是100％，每次反应后的酶活与初始酶活的比值被定义固定化的含酶微胶囊的相对酶活。将固定化的含酶微胶囊在4℃储存，然后分批测定其相对酶活，以确定固定化的含酶微胶囊的储存稳定性。
3.实验测得，本发明的方法对三种酶进行固定后，酶活损失较小。相较于游离酶，酶的操作稳定性和酶的储存稳定性均有了显著提高，如见表1-6。
表1固定化的含乳酸脱氢酶微胶囊操作稳定性
Figure BDA0000406363060000051
表2固定化的含乳酸脱氢酶微胶囊储存稳定性
Figure BDA0000406363060000052
表3固定化的含苹果酸脱氢酶微胶囊的操作稳定性
表4固定化的含苹果酸脱氢酶微胶囊的储存稳定性
Figure BDA0000406363060000062
表5固定化的含草酰乙酸脱羧酶微胶囊的操作稳定性
Figure BDA0000406363060000063
表6固定化的含草酰乙酸脱羧酶微胶囊的储存稳定性

Claims (2)

1.一种二氧化碳转化酶的固定化方法，其特征是包括以下步骤：
（1）试剂的配制：
①酶溶液的配制：取10uL浓度为1006-2500U/mL二氧化碳转化酶加入到1mL0.05mol/LTris-HCl pH=7.0缓冲液中，混匀，得到酶溶液；
②碳纳米管溶液的配制：取参数为：表面积是250-300m2/g，灰度小于3%，纯度高于97%，长度5-15μm，直径0.1-10nm的碳纳米管，用0.05mol/L Tris-HCl pH=7.0缓冲液配制成5mg/mL的碳纳米管溶液；
③氯化钙溶液的配制：取无水氯化钙用去离子水配制成0.02mg/mL的氯化钙溶液；
④壳聚糖溶液的配制：取壳聚糖用体积浓度为1%的乙酸水溶液配制成5-20mg/mL的壳聚糖溶液；
⑤海藻酸钠溶液的配制：取海藻酸钠用去离子水配制成2-2.5g/mL的海藻酸钠溶液；
（2）酶固定化步骤：
①将0.5mL碳纳米管溶液，0.005mL酶溶液及0.2mL氯化钙溶液置于2mL离心管中，反复摇匀，获得液体I；
②向液体I中加入0.5mL壳聚糖溶液，用取液器反复吸入、推出，使之混合均匀，获得液体II；
③取15mL海藻酸钠溶液与15mL的碳纳米管溶液混合，搅拌30min，获得液体III；
④用一次性的针头直径为0.7mm的注射器将液体II逐滴滴入液体III中，静置10-15min，形成微胶囊；
⑤用0.05mol/L Tris-HCl pH=7.0缓冲液洗涤微胶囊，过滤；
⑥将步骤⑤获得的微胶囊置于氯化钙溶液中硬化15min，用0.05mol/L Tris-HCl pH=7.0缓冲液洗涤，获得固定化的含酶微胶囊。
2.根据权利要求1所述的一种二氧化碳转化酶的固定化方法，其特征是所述二氧化碳转化酶为乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶或草酰乙酸脱羧酶。
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