CN103588960A - 一类非标记离子型共轭聚电解质及其合成方法、在生物检测的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类非标记离子型共轭聚电解质的设计及其检测应用，其结构可由通式(Ⅰ)表示；包含9位取代的芴单元和具有吸电子特性的受体单元Ar，Ar是苯并噻二唑、苯并噻唑、噻唑、苯并二唑、氟化硼络合二吡咯甲川类单元、含铱配合物单元、含金属卟啉单元、苝酰亚胺、萘酰亚胺等取代基中的一种；芴基与Ar的比例x:y为17:3～18:2，侧基含m+1个CH2单元；其中，Ion为水溶性基团季胺基、羧基或磺酸基中的一种；本发明的非标记共轭聚电解质具有极高的溶解性和稳定性，而且可以应用于多种无标记的生物检测，是一类全新的传感检测平台。

Description

一类非标记离子型共轭聚电解质及其合成方法、在生物检测的应用

技术领域

本发明涉及一类共轭聚电解质设计，具体来说是一类由芴基和另一种发光材料组合而成的非标记共轭聚电解质的设计及其在表面活性剂、DNA、蛋白质活性物质的生物检测应用。

背景技术

共轭聚合物新型材料的结构使得其有大量吸收单元。激发能量可以沿着聚合物骨架迁移，然后转移到生色团，这将导致光谱信号放大。因此，共轭聚合物可以充当捕光材料和基于荧光共振能量转移（FRET）的光放大工具。由于这些卓越的性能，共轭聚合物已被用来作为高度敏感的化学和生物传感器的光学平台。

而应用于生物检测，则通常使用可溶于水的，带电荷的（阴、阳离子）的共轭聚电解质。水溶液中的金属离子、有机、生物分子和生物大分子等带负电荷的分子，和共轭聚电解质通过静电的相互作用而发生聚集、构象变化或者FRET，从而改变荧光光谱。例如，阳离子共轭聚噻吩衍生物已被广泛用于DNA的快速，高灵敏度检测，因为相比于单链DNA（ssDNA），聚合物与双链DNA（dsDNA）结合后，会有重大的构象改变。这种构象变化转导DNA杂交信号转化为比色或荧光信号方便检测。

传统使用的检测方法中，往往需要对DNA或其他待测物质进行荧光标记从而实现FRET检测。这样的预先标记往往导致检测过程复杂，甚至在一些未知物的检测中难以实现。无标记检测由于简便性和低成本而引起人们的极大兴趣。到目前为止，大多数基于共轭聚合物的生物传感器还是需要使用一个荧光标记探针。后来人们开始使用无需提前标记的嵌入式染料，这种嵌入式染料可以很好的嵌入到dsDNA中，但是这种特征也限制了这种检测策略只能用于检测DNA而不适用于其他生物分子。而我们的聚电解质只需要和被检测分子静电结合就可以得到有效的检测结果，这使得我们的聚电解质的应用范围更加广泛。

发明内容

技术问题：本发明的目的是设计一类具有优异水溶性、稳定性等优点的共轭聚电解质，同时拓展其部分生物检测的无标记、低成本应用。本发明中所涵盖的共轭聚电解质材料具有良好的发光性能，化学稳定性、热稳定性、光稳定性和高水溶性，同时，侧链连接的离子基团，具有适当电荷，为广泛、专一的进行非标记生物、化学检测提供条件。

技术方案：本发明的一类非标记共轭聚电解质的设计思路，其结构可由如下通式(Ⅰ)表示：

其中Ar是苯并噻二唑、苯并噻唑、噻唑、苯并二唑、氟化硼络合二吡咯甲川类单元、含铱配合物单元、含金属卟啉单元、苝酰亚胺、萘酰亚胺等取代基中的一种；芴基与Ar的比例x:y为17:3～18:2。

设计思路包括以下要求：

1).式（Ⅰ）通式中，Ar是苯并噻二唑、苯并噻唑、噻唑、苯并二唑、氟化硼络合二吡咯甲川类单元、含铱配合物单元、含金属卟啉单元、苝酰亚胺、萘酰亚胺等取代基中的一种。该Ar的选择需要在非芴基特征峰区域有良好发光性能的特征。

2).式（Ⅰ）通式中，芴基与Ar的聚合比例x:y为17:3～18:2。

3).上述要求的选材和比例选择在于，当该聚电解质分散较好时，体系荧光只有芴基的特征峰；而当该聚电解质发生聚集时，体系荧光芴基的特征峰下降甚至消失，而Ar的特征峰出现并且增强。

4).式（Ⅰ）通式中，芴基的侧链为三至五个碳，且末端为带电荷的离子基团形式。这样的选择的特征在于，该聚电解质可以非常好的溶于水且其水溶液在常温下保存非常稳定。

5).本发明的上述化合物，较为典型的有如下几种：

m=2,Ion为季胺基团，Ar为苯并噻二唑，x:y=17:3；其结构式为：

m=2,Ion为季胺基团，Ar为芳香铱配合物，x:y=18:2，其结构式为：

m=2,Ion为羧酸钠基团，Ar为苝酰亚胺基团，x:y=18:2，其结构式为：

本发明提出化合物的合成方法如下：

（1）2,7-二溴芴为起始原料，在碱作用下，合成9位双烷基取代的芴单体A；

（2）芴单体A在钯催化条件下，与无水醋酸钾、频呐醇联硼酯在无水二甲亚砜溶剂中加热得到2,7-二硼酸酯的芴单体B；

（3）聚合物合成

芴单体A、芴单体B和其他含双溴的受体单元在甲苯中，用2M碳酸钠溶液，三苯基膦钯作为催化剂，反应得到聚合物，经沉降、离子化得到离子型共轭聚电解质。聚电解质的平均数均分子量在15000以上，数均聚合度大于50。

非标记离子型共轭聚电解质材料用于生物检测方法，具体步骤如下：

用去离子水将共轭聚电解材料配成约10^-6M稀溶液；

将待测物质的溶液通过微量移液枪加入共轭聚电解材料溶液中，并加去离子水定容，其中共轭聚电解材料测试中的最终浓度为10^-6M；

测定在不同待测物质存在下，共轭聚电解材料的紫外可见吸收光谱、荧光发射光谱，根据共轭聚电解材料荧光光谱在短波和长波区域峰值变化，可对待测物进行检测；

待测物质的浓度、带电荷行为、共轭聚电解材料溶液微环境变化均能作为共轭聚电解材料多发射非标记检测的机理。

应用方面，我们设计的聚电解质无需使用嵌入式染料，只需要和被检测分子静电结合就可以得到有效的检测结果，这使得我们的聚电解质的应用范围更加广泛。

有益效果：与现有技术相比，本发明设计的非标记共轭聚电解质材料，具有水溶性优异、光/热稳定性好、成本低廉的优点。本发明得到了一类非标记共轭聚电解质，通过紫外、荧光等方法对其光学性质进行了研究。

当其应用于生物分子检测时，无需对材料以及生物分子进行任何标记，并且也无需任何外加的染料材料，就能很好地实现对生物分子的无标记检测。

附图说明

图1.非标记共轭聚电解质P1的紫外图谱。

图2.非标记共轭聚电解质P1在水中及不同缓冲溶液中的荧光图谱。

图3.非标记共轭聚电解质P1用于DNA检测的荧光图谱。

图4.非标记共轭聚电解质P1用于各种蛋白质检测的荧光图谱。

具体实施方式

非标记共轭聚电解质合成过程通用实施方案1：

在25mL的Schlenk管中，将9,9-双（3,3'-二甲基-1-丙胺基）-芴-2,7-双硼酸频哪醇酯（588.4mg,1.0mmol）,9,9-双（3,3'-二甲基-1-丙胺基）-2,7-二溴芴(345.8mg,0.7mmol)，4,7-二溴-苯并噻二唑（88mg,0.3mmol）,3.5mg四（三苯基膦）钯，溶于12毫升新蒸四氢呋喃和6毫升饱和碳酸钾混合溶液中。避光，85度，氩气保护下加热搅拌36小时。得到的黄色聚合物溶液在***中沉降，收集固体，溶解于乙醇中，再次用350毫升***沉降，得到黄色丝状固体，为中性聚合物。

取中性聚合物30毫克，溶解于5毫升二甲亚砜中，45度加热搅拌下加入3毫升溴乙烷，待有沉淀生成，加入20毫升丙酮，继续搅拌下加入3毫升溴乙烷。待反应40小时候，过滤固体沉淀，得到非标记共轭聚电解质P1。P1的结构如下：

按照非标记共轭聚电解质合成过程通用实施方案1方法，通过控制含双硼酸酯单体、含双溴单体和通式（1）所示的第三单体的比例，在类似的反应条件下可得到典型的结构有如下几种：

m=2,Ion为季胺基团，Ar为苯并噻二唑，x:y=18:2；其结构式为：

m=2,Ion为季胺基团，Ar为芳香铱配合物，x:y=18:2，其结构式为：

非标记共轭聚电解质合成过程通用实施方案2

在25mL的Schlenk管中，将9,9-双（1-丙酸甲酯）-2,7-双硼酸频哪醇酯-芴（118mg,0.2mmol）,9,9-双（1-丙酸甲酯）-2,7-二溴芴(79.4mg,0.16mmol)，2,6-二溴-苝酰亚胺（27.7mg,0.04mmol）,3mg四（三苯基膦）钯，溶于15毫升新蒸甲苯和7毫升饱和碳酸钾混合溶液中。避光，85度，氩气保护下加热搅拌36小时。得到的红色聚合物溶液在乙醇中沉降，收集固体，溶解于氯仿中，再次用350毫升乙醇沉降，得到深红色丝状固体，为中性聚合物。取中性聚合物30毫克，溶解于15毫升四氢呋喃中，70度加热搅拌下加入50%氢氧化钾溶液，待有沉淀生成，加入20毫升水，继续搅拌下。待反应40小时候，过滤固体沉淀，得到非标记阴离子共轭聚电解质。共轭聚电解质结构具有下述特征。

m=2,Ion为羧酸钠基团，Ar为苝酰亚胺基团，x:y=18:2，其结构式为：

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

以下实施例是根据本发明的选材选择了一种非标记共轭聚电解质P1，应用于生物分子检测。P1结构式如下：

实施例1：

纯水体系中加入4.5μM的P1（浓度以平均重复单元数计算），测其紫外吸收光谱。即图1。

实施例2：

分别在纯水、Tris缓冲溶液（pH=7.4）和PBS缓冲溶液（pH=7.4）中加入4.5μM的P1，测其荧光发射光谱。即图2。激发波长为381nm,狭缝为（3；5）。

实施例3：

订购DNA序列为(5’至3’)：TAA CAA TAA TCC TTT TTT TTT T。纯水体系中加入4.5μM的P1（浓度以平均重复单元数计算），测其荧光。再分别加入0.25nM、2.5nM、25nM、250nM、2.5μM的DNA，分别测其荧光，得到P1用于DNA检测的荧光图谱。即图3。激发波长为381nm，狭缝为（3；5）。

实施例4：

纯水体系中加入4.5μM的P1，测其荧光。再分别加入下列蛋白：BSA(250nM)、AFP(250nM)、Hb(250nM)、Lys(250nM)、Mb(250nM)、CEA(250nM)、PSA(250nM)、NSE(250nM)、CA19-9(250KU)、CA125(250KU)、CA153(5KU)，分别测其荧光，得到P1用于蛋白检测的荧光图谱。即图4。激发波长为381nm，狭缝为（3；5）。

传统的聚电解质检测生物分子的方法中，需要在生物分子上进行标记或者额外加入嵌入其他发色团。而从以上实验结果中可以看出，应用我们设计的非标记共轭聚电解质过程中，对检测对象不必使用任何额外的修饰或嵌入式发色团，只需要和被检测分子静电结合就可以得到有效的检测结果，这使得我们的聚电解质的应用范围更加广泛。

Claims (9)

1.一种非标记离子型共轭聚电解质材料，其特征在于具有下述式(Ⅰ)所示结构：

其中，芴基9位侧链含m+1个CH₂单元;

Ion为水溶性基团；

Ar为长波吸收、发射的芳香基。

2.根据权利要求1或2所述的非标记离子型共轭聚电解质材料，其特征在于，m<5。

3.根据权利要求1或2所述的非标记离子型共轭聚电解质材料，其特征在于，Ion为水溶性基团：季胺基团、羧基、磺酸基中的任一种。

4.根据权利要求1或2所述的非标记离子型共轭聚电解质材料，其特征在于，Ar为长波吸收、发射的芳香基：苯并噻二唑、噻唑、苯并二唑、氟化硼络合二吡咯甲川类单元、芳基铱配合物单元、含金属卟啉单元、苝酰亚胺、萘酰亚胺取代基中的任一种。

5.根据权利要求1或2所述的非标记离子型共轭聚电解质材料，其特征在于在式（Ⅰ）通式中，芴基与Ar的聚合比例x:y为17:3～18:2。

6.根据权利要求1或2所述的非标记离子型共轭聚电解质材料，其特征在于在式（Ⅰ）通式中，具有电荷的Ion基团与DNA、PNA、RNA、蛋白、多肽或酶具有静电相互作用，从而实现传感检测功能。

7.根据权利要求1或2或3所述的非标记离子型共轭聚电解质材料，其特征在于，聚合物主链共聚单元Ar的选择需要在450纳米以上区域有良好发光性能的特征；并要求聚电解质稀溶液中，仅有聚芴段的荧光发射，而Ar具有微弱荧光发射或无荧光发射；选材和比例选择在于，当该聚电解质在纯水介质中分散非常好时，体系荧光只有芴基的特征峰；而当该聚电解质发生聚集时，体系荧光芴基的特征峰下降甚至消失，而Ar的特征峰出现并且增强。

8.一种非标记离子型共轭聚电解质材料合成方法，其特征在于，合成权利要求1至7任一项的化合物，其方法如下：

（1）2,7-二溴芴为起始原料，在碱作用下，合成9位双烷基取代的芴单体A；

（2）芴单体A在钯催化条件下，与无水醋酸钾、频呐醇联硼酯在无水二甲亚砜溶剂中加热得到2,7-二硼酸酯的芴单体B；

（3）聚合物合成

芴单体A、芴单体B和其他含双溴的受体单元在甲苯中，用2M碳酸钠溶液，三苯基膦钯作为催化剂，反应得到聚合物，经沉降、离子化得到离子型共轭聚电解质。聚电解质的平均数均分子量在15000以上，数均聚合度大于50。

9.一种非标记离子型共轭聚电解质材料生物检测方法，特征在于，权利要求1至7任一项的化合物用于生物检测，具体步骤如下：

用去离子水将共轭聚电解材料配成约10^-6M稀溶液；

将待测物质的溶液通过微量移液枪加入共轭聚电解材料溶液中，并加去离子水定容，其中共轭聚电解材料测试中的最终浓度为10^-6M；

测定在不同待测物质存在下，共轭聚电解材料的紫外可见吸收光谱、荧光发射光谱，根据共轭聚电解材料荧光光谱在短波和长波区域峰值变化，可对待测物进行检测；

待测物质的浓度、带电荷行为、共轭聚电解材料溶液微环境变化均能作为共轭聚电解材料多发射非标记检测的机理。

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