CN103588868B - 一种小麦蛋白TaMYB1及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦蛋白TaMYB1及其编码基因与应用。本发明提供的一种蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗病相关或具有转录激活活性的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现了一种蛋白TaMYB1，将其瞬时表达，发现其可以抗小麦白粉菌生理小种E09或大麦白粉菌A6引起的病害，进一步研究发现该蛋白还具有转录激活活性，其可以作为转录激活因子。上述研究表明，该蛋白可以为培育具有抗病性的转基因植物的研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小麦蛋白TaMYB1及其编码基因与应用。
背景技术
小麦白粉病(Powdery mildew)是由专性寄生真菌禾布氏白粉菌Bgt（Blumeria graminis f sp.tritici)引起的一种真菌性病害，属世界性分布的病害，严重影响了世界小麦的产量。近年来，由于作物种植密度的增高，氮肥施用量的增大，以及作物种植的单一，使小麦白粉病造成的危害日益严重。小麦受害后，可导致叶片早枯，光合作用降低，呼吸作用加强，分蘖数减少，成穗率降低，干粒重下降，一般可减产5％～10％，重病田减产达20％以上。由于小麦白粉病菌具有群体大、适应范围广、生理小种众多，且变异速度快，使得许多有效抗病基因丧失抗性。目前育种工作者一直以选育和推广抗病品种作为病害的主要防治手段，多年来颇见成效，但抗性丧失一直是未能解决的问题，抗源多样化是实现抗病性持久的有效途径。为此通过生物学的方法克隆新的抗病基因，利用转基因的方法提高小麦对白粉病的抗性是今后防治白粉病的有效策略之一。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种小麦蛋白TaMYB1及其编码基因。
本发明提供的蛋白，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗病相关或具有转录激活活性的由序列2衍生的蛋白质。
上述（a）或（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5＇端和/或3＇端连上表2所示的标签的编码序列得到。
上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的变异引起的，有的是由人工诱变处理引起的。
编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。
上述基因为如下1）-3）中任一一种的DNA分子：
1）序列表中序列1所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码与抗病相关或具有转录激活活性蛋白的DNA分子；
3）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与抗病相关或具有转录激活活性蛋白的DNA分子。
上述严格条件为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围；其中，重组载体可以为将序列表中的序列1***pUBI-Adaptor-NOS载体中得到的载体；也可以为将序列表中的序列1***35S-BD载体的BamHⅠ与SalⅠ酶切位点间得到的载体。
扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围；上述引物对可以是由序列表中的序列3所示的DNA分子和序列表中的序列4所示的DNA分子组成。
上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗病或使植物抗病中的应用也是本发明保护的范围。
上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育具有抗病性的转基因植物中的应用也是本发明保护的范围。
在上述应用中，所述抗病为抗白粉病；所述白粉病具体为小麦白粉病或大麦白粉病。
上述小麦白粉病的病原菌为小麦白粉病菌（Blumeria graminis f.sp.tritici)；所述小麦白粉病菌具体为小麦白粉菌生理小种E09；
上述大麦白粉病的病原菌为大麦白粉病菌（Blumeria graminis f.sp.hordei)；所述大麦白粉病菌具体为大麦白粉菌A6（virMla1,AvrMla6,AvrMla12,AvrMlg）。
上述植物为双子叶植物或单子叶植物；其中单子叶植物具体为小麦或大麦；本发明的实施例中的大麦品种为P01（含Mla1），小麦品种为Chancellor或科农199。
上述蛋白在作为转录激活因子中的应用也是本发明保护的范围。
上述蛋白作为转录激活因子体现在激活基因表达；本发明的实施例中基因为报告基因LUC。
本发明的实验证明，本发明发现了一种蛋白TaMYB1，将其瞬时表达，发现其可以抗小麦白粉菌生理小种E09或大麦白粉菌A6引起的病害，进一步研究发现该蛋白还具有转录激活活性，其可以作为转录激活因子。上述研究表明，该蛋白可以为培育具有抗病性的转基因植物的研究奠定基础。
附图说明
图1为TaMYB1的PCR扩增结果图
图2为抗病细胞和感病细胞的表型图
图3为TaMYB1瞬时表达后对吸器指数的影响结果
图4为TaMYB1转录激活报告基因表达结果图
图5为TaMYB1定位于细胞核内的结果图
图6为TaMYB1受小麦白粉菌诱导的表达图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的部分材料如下：
小麦品种豫麦66记载在普通小麦品种“豫麦66”抗白粉病基因的鉴定与分子标记.作物学报，2008，34(4):545-550，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
大麦P01记载在Recognition Specificity and RAR1/SGT1 Dependence in BarleyMla Disease Resistance Genes to the Powdery Mildew Fungus.Plant Cell,2003,15:732-744，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
小麦Chancellor记载在白粉病菌侵染后小麦叶片蛋白质变化的研究.华北农学报，2007，22（3）：126-128，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
小麦科农199记载在高产广适小麦新品种-科农199.麦类作物学报，2007，27（2）：368-370，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
Columbia型拟南芥(col-0)记载在Molecular characterization of thesubmergence response of the Arabidopsis thaliana ecotype Columbia.NewPhytologist.2011,190:457–471，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
小麦白粉菌生理小种E09（Blumeria graminis f.sp.Tritici)记载在利用人工合成小麦培育的大穗抗白粉小麦基因资源GB4.植物遗传资源学报，2007，8(3):378，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
大麦白粉菌A6（Blumeria graminis f.sp.Hordei）记载在RecognitionSpecificity and RAR1/SGT1 Dependence in Barley Mla Disease Resistance Genesto the Powdery Mildew Fungus.Plant Cell,2003,15:732-744，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得
质粒pUbiGUS记载在A Transient Assay System for the Functional Assessmentof Defense-Related Genes in Wheat.MPMI,1999,12:647–654，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
pUBI-Adaptor-NOS记载在Recognition Specificity and RAR1/SGT1 Dependence inBarley Mla Disease Resistance Genes to the Powdery Mildew Fungus.Plant Cell,2003,15:732-744，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
35S-BD载体记载在Soybean GmPHD-type transcription regulators improvestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoS ONE,2009,4(9):e7209，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
35S-BD-VP16记载在Soybean GmPHD-type transcription regulators improvestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoS ONE,2009,4(9):e7209，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
5×GAL4-LUC记载在Soybean GmPHD-type transcription regulators improvestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoS ONE,2009,4(9):e7209，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
Pptrl记载在Soybean GmPHD-type transcription regulators improve stresstolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoS ONE,2009,4(9):e7209，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
pUbi-Gateway-eYFP载体记载在The CC-NB-LRR-type Rdg2a resistance geneconfers immunity to the seed-borne balrey leaf stripe pathogen in the absenceof hypersensitive cell death.PLoS One,2010,5:e12599，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
实施例1、TaMYB1基因的获得
1、RNA的获得
小麦品种豫麦66的7天幼苗接菌小麦白粉菌生理小种E09，24小时取材，提RNA。
2、反转录获得cDNA
反转录体系:
RNA 2.5ul
Oligo-dT 1ul
DEPC-H2O 6.5ul
离心管混合上述溶液，70℃5分钟，冰上再放置5分钟。
离心管继续加入上述溶液，48℃温浴1小时，70℃15分钟，4℃10分钟，得到cDNA。
3、克隆TaMYB1
将上述cDNA加入25ul ddH2O，取1ul进行后续PCR反应为模板，用下述引物进行PCR扩增，
F：AAATTTGGATCCATGTCACGGATCGGAGAT（序列3）
R：GGGCCTGTCGACTTATATTGAGTTACCATCAT（序列4）
PCR体系如下：
PCR程序如下：
结果如图1所示，得到1188bp的PCR产物，将该PCR产物送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，该序列所示的基因命名为TaMYB1，编码区为序列表中序列1自5’末端第1-1188位核苷酸；该基因编码的蛋白命名为TaMYB1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
实施例2、TaMYB1基因在抗白粉病中的应用
一、基因枪瞬间超表达技术初步鉴定TaMYB1对白粉病的抗性
1、载体构建
1）以实施例1得到的PCR产物（或者人工合成序列1）为模板，用下述引物F’和R’进行PCR扩增，得到约1.2Kb的PCR产物。
F’：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCACGGATCGGAGAT
R’：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTATATTGAGTTACCATCAT
2）用上述PCR产物与pDNOR201载体（购自invitrogen公司）进行BP反应，得到ENTRY载体。
上述BP反应体系：
PCR产物 75ng
pDNOR201 75ng
BP酶 0.5ul
25℃过夜。
3）将上述ENTRY载体与pUBI-Adaptor-NOS载体进行LR反应，生成pUBI-TaMYB1载体。
LR反应体系：
ENTRY载体 75ng
pUBI-Adaptor-NOS载体 75ng
LR酶 0.5ul
25℃过夜。
pUBI-TaMYB1载体通过测序鉴定，该载体为将序列表中的序列1***pUBI-Adaptor-NOS载体中得到的载体。
2、基因枪瞬时超表达试验
1）金粉的制备
（1）称取9mg（w）金粉放在离心管中，65℃放置4小时以上。
（2）加入70%乙醇，漩涡振荡8分钟，静止15分钟。
（3）2000r/min离心2s，去掉上清液。
（4）加1ml消毒蒸馏水，旋涡振荡2分钟，静止1分钟，2000rpm/min离心2s，弃掉上清液。
（5）重复（4）三次。
（6）在沉淀的金粉中加入50%甘油，漩涡振荡。
2）DNA子弹的制作
（1）振荡50%甘油中的金粉5分钟，使之成为悬浮液。
（2）取50μl的悬浮液于离心管中。
（3）加入5μl的质粒DNA（2ug），边振荡便加入50μlCaCl2水溶液（2.5M），振荡中再在小管加入20μl亚精胺（0.1M），振荡3分钟，之后静置1min，2000rpm/min离心2s，去掉上清液。
（4）加入140μl 70%的乙醇，漩涡振荡，使沉淀均匀散开，则离心（2000rpm/min2s），弃掉上清液。
（5）加入140μl 100%的乙醇，漩涡振荡，使沉淀均匀散开，则离心（2000rpm/min2s），弃掉上清液。
（6）加入12μl 100%的乙醇，漩涡振荡，使沉淀均匀散开。
3）基因枪轰击转化方法
基因枪介导的方法：分别将大麦P01、小麦Chancellor和小麦科农199种子经保湿吹芽种植后，待长至一周左右，剪下第一片叶，叶面朝上，放置于含有培养基（1%的琼脂，100mg/L苯丙咪唑）的培养皿上，恢复4小时，得到大麦P01靶材料、小麦Chancellor靶材料和小麦科农199靶材料，备用基因枪轰击；
将目的质粒pUBI-TaMYB1和质粒pUbiGUS按1：1体积充分混合，包裹在直径为1um金粉微粒上，采用PDS-1000/He（美国Bio-Rad）分别按照上述方法轰击大麦P01靶材料、小麦Chancellor靶材料和小麦科农199靶材料，基因枪轰击参数为：阻挡网与轰击材料之间的距离为5.5cm，可裂膜压力为1100Pa（大麦为900Pa）。
基因枪轰击完毕后，将轰击后的大麦P01叶片放入培养箱中恢复培养4小时（培养条件22℃、16h光照/18℃8h黑暗），得到转入pUBI-TaMYB1和pUbiGUS的大麦P01叶片（EV-TaMYB1），15小时后进行接大麦白粉菌A6；
基因枪轰击完毕后，将轰击后小麦Chancellor叶片和轰击后小麦科农199叶片分别放入培养箱中恢复培养4小时（培养条件22℃、16h光照/18℃8h黑暗），得到转入pUBI-TaMYB1和pUbiGUS的小麦Chancellor叶片和转入pUBI-TaMYB1和pUbiGUS的小麦科农199叶片；然后15小时后进行接小麦白粉菌生理小种E09；
上述接种的方法均如下：将对应小种的孢子抖落在对应的大麦叶片或小麦叶片上，保证2个孢子/mm2。
将上述接种后的大麦P01叶片、小麦Chancellor叶片和轰击后小麦科农199培养48小时（培养条件22℃、16h光照/18℃8h黑暗），进行GUS染色，37℃过夜，染色完毕后进行脱色，两天后利用显微镜进行细胞观察。
统计表达GUS的细胞中感病细胞的比例来计算吸器指数，根据吸器指数来判断基因TaMYB1的功能。吸器指数越低，说明抗性越高。
抗病细胞的判断标准：细胞内表达GUS，且细胞内不含有吸器，而细胞表面附着有分生孢子的细胞为抗病细胞（图2A）。
感病细胞的判断标准：细胞内表达GUS，且细胞内含有吸器的细胞为感病细胞（图2B）。
吸器指数的计算公式：吸器指数=感病细胞的个数/（抗病细胞的个数+感病细胞的个数）×100%。
以转入pUBI-Adaptor-NOS和pUbiGUS的大麦P01叶片（OE-EV）、转入pUBI-Adaptor-NOS和pUbiGUS的小麦科农199（KN199）叶片（OE-EV）、转入pUBI-Adaptor-NOS和pUbiGUS的小麦Chancellor叶片（OE-EV）作为空对照。实验设3次重复，结果取平均值。
结果如图3所示：
转入pUBI-TaMYB1和pUbiGUS的大麦P01叶片的吸器指数为20.52%；
转入pUBI-Adaptor-NOS和pUbiGUS的大麦P01叶片的吸器指数为38.37%；
转入pUBI-TaMYB1和pUbiGUS的小麦Chancellor叶片的吸器指数为27.03%；
转入pUBI-Adaptor-NOS和pUbiGUS的小麦Chancellor叶片的吸器指数为67.93%；
转入pUBI-TaMYB1和pUbiGUS的小麦科农199叶片的吸器指数为38.86%；
转入pUBI-Adaptor-NOS和pUb iGUS的小麦科农199的吸器指数为53.44%。
结果显示，在大小麦叶片中过表达TaMYB1后，吸器指数均明显下降，说明TaMYB1在大小麦的白粉病抗性中有正调控作用。
二、TaMYB1作为转录激活因子的转录激活活性分析
1、35S-BD-TaMYB1载体构建
1）以实施例1得到的PCR产物（或者人工合成序列1）为模板，用下述引物F3和R3进行PCR扩增，得到约1.2Kb的PCR产物。
F3：AAATTTGGATCCATGTCACGGATCGGAGAT
R3：GGGCCTGTCGACTTATATTGAGTTACCATCAT
将上述PCR产物经过BamHⅠ与SalⅠ双酶切后与经过同样酶切的35S-BD载体连接，得到载体35S-BD-TaMYB1。
35S-BD-TaMYB1载体通过测序鉴定，该载体为将序列表中的序列1***35S-BD载体的BamHⅠ与SalⅠ酶切位点间得到的载体。
2、原生质体制备
三周Columbia型拟南芥幼嫩叶片若干，用刀片切成1毫米细条，黑暗下25度酶解4小时，经过滤、离心等一系列操作后用细胞计数板在显微镜下计数，一般每100ul中有2×105个原生质体。
3、质粒转化及荧光值测定
分装100ul原生质体到2ml的EP管中，分别加入下列质粒：Effectors:35S-BD-TaMYB1；CK-:35S-BD；CK+:35S-BD-VP16；Reporter:5×GAL4-LUC；Internalcontrol:Pptrl。25度暗培养16小时后检测报告基因LUC表达情况。
检测萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的荧光值，得到两者比率（萤火虫萤光素酶荧光值/海肾萤光素酶荧光值），即为报告基因相对活性。（详细检测方法见promega试剂盒Dual-Reporter Assay System货号E1910）
结果如图4所示，转入35S-BD-TaMYB1和5×GAL4-LUC的原生质体中LUC的相对活性为8.63；
转入35S-BD和5×GAL4-LUC的原生质体中LUC的相对活性为1；
转入35S-BD-VP16和5×GAL4-LUC的原生质体中LUC的相对活性为14.74；
上述结果表明，TaMYB1能够激活报告基因的表达，荧光值是对照质粒35S-BD的8.63倍，由此可以确定TaMYB1具有转录激活活性，是转录激活因子。
实施例3、TaMYB1的亚细胞定位和受白粉菌诱导的表达模式分析
一、TaMYB1的亚细胞定位
1、载体构建
1）以实施例1得到的PCR产物（或者人工合成序列1）为模板，用下述引物F1和R1进行PCR扩增，得到约1.2Kb的PCR产物。
F1：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-TC-ATGTCACGGATCGGAGAT
R1：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-C-TATTGAGTTACCATCATGT
2）用上述PCR产物与pDNOR201载体（购自invitrogen公司）进行BP反应，得到ENTRY-1载体。
上述BP反应体系：
PCR产物 75ng
pDNOR201 75ng
BP酶 0.5ul
25℃过夜。
3）将上述ENTRY-1载体与pUbi-Gateway-eYFP载体LR反应，生成pUBI-TaMYB1-mYFP载体。
LR反应体系：
中间载体 75ng
pUbi-Gateway-eYFP载体 75ng
LR酶 0.5ul
25℃过夜。
pUBI-TaMYB1-mYFP载体通过测序鉴定，该载体为将序列表中的序列1***pUbi-Gateway-eYFP载体中得到的载体。
2、基因枪介导的单细胞瞬时转化技术鉴定TaMYB1的亚细胞定位情况
小麦科农199种子经保湿吹芽种植后,待长至一周左右，剪下第一片叶，叶面朝上，放置于含有培养基（1%的琼脂，100mg/L苯丙咪唑）的培养皿上，恢复4小时，进行基因枪轰击；将目的质粒pUBI-TaMYB1-mYFP包裹在直径为1um金粉微粒上，采用PDS-1000/He（美国Bio-Rad）轰击靶材料，基因枪轰击参数为：阻挡网与轰击材料之间的距离为5.5cm，可裂膜压力为1100Pa。
基因枪轰击后叶片放置于植物培养室正常生长36小时后进行DAPI染色以标记细胞核，共聚焦显微镜不同荧光通道观察TaMYB1的亚细胞定位情况。
结果如图5所示，TaMYB1-mYFP的荧光与DAPI的荧光完全重叠，故TaMYB1定位于细胞核内。
二、TaMYB1受白粉菌诱导的表达模式分析
小麦科农199种子经保湿吹芽种植后,待长至一周左右，剪下第一片叶，叶面朝上，放置于含有培养基（1%的琼脂，100mg/L苯丙咪唑）的培养皿上，恢复24小时，接种小麦白粉病菌生理小种E09，分不同时间点取材，提RNA，反转录得到cDNA，将cDNA稀释10倍，取2ul进行Real time PCR。Real time PCR体系及程序参照promega公司试剂盒GoTaq-qPCR Master Mix（目录号A6001）操作说明。以未接菌处理为对照。
Real time PCR的引物如下：
F2：ATGGGCTGAAAAACTGGCAA
R2：AGTCTCAACTCCTCTTGTTCCGA
Real time PCR体系如下：
Real time PCR程序如下：
结果如图6所示，白粉菌生理小种E09接菌处理能够强烈诱导TaMYB1的表达，接菌0.5小时后表达量出现一个小的峰值，提高约6倍，随后降低；而接菌15小时TaMYB1的表达出现第二个峰值，达到未接菌时的13倍，而后表达量降低，接菌24小时TaMYB1的表达量为未接菌时的6倍。
Claims (5)
1.TaMYB1蛋白、TaMYB1蛋白编码基因或含有TaMYB1蛋白编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗病或使植物抗病中的应用；
所述TaMYB1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2；
所述抗病为抗小麦白粉病或抗大麦白粉病。
2.TaMYB1蛋白、TaMYB1蛋白编码基因或含有TaMYB1蛋白编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育具有抗病性的转基因植物中的应用；
所述抗病为抗小麦白粉病或抗大麦白粉病。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述小麦白粉病的病原菌为小麦白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)；所述大麦白粉病的病原菌为大麦白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.hordei)；所述植物为小麦或大麦。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述小麦白粉病菌为小麦白粉菌生理小种E09；
所述大麦白粉病菌为大麦白粉菌A6；
5.TaMYB1蛋白在作为转录激活因子中的应用；所述TaMYB1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
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