CN103575827B - 一种检测单糖的方法及衍生试剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域,涉及一种单糖的检测方法及衍生试剂的制备方法,包括如下步骤:(1)用衍生试剂对单糖进行衍生;(2)将衍生产物进行液相色谱质谱联用(LC-MS)分析;衍生试剂包括1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)和1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)。该检测方法对微量样品既可以定性又可以定量,检测灵敏度高,操作简便,可同时对两种未知样品进行相对定量,质谱图信噪比低,分离所需流动相极性小,大大延长了柱子的使用寿命。本发明方法比传统1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮(PMP)衍生法的灵敏度高4-5倍,比传统NMP衍生法更好地分离单糖,不会出现单糖色谱峰重叠的现象。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,涉及一种检测单糖的方法及衍生试剂的制备方法。
背景技术
目前,多糖领域中面临很多挑战。多糖的研究不仅仅限于对大量样品的分析,对于生物来源的样品研究也越来越多。由于生物来源(如血液、细胞、组织)的样品多糖量少,单糖极性较强,结构相近,且缺乏光学活性,采用常规方法对其分离鉴定较为困难。糖在紫外区无吸收,传统的示差折光检测法的灵敏度低且不利于梯度洗脱。为了改善其分离选择性和提高检测灵敏度,人们常采用衍生化处理,将糖类组分转变为带发色基团的分子,然后进行紫外或荧光检测。
液相色谱质谱联用(LC-MS)是一种很好的检测方法。它以液相色谱作为分离***,质谱为检测***。样品由流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱的优势互补,将色谱对复杂样品的高分离能力,与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来,在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。
糖类物质的衍生反应多基于还原氨化法,不仅过程繁琐、反应时间长,而且可导致不稳定基团如唾液酸残基的解离,给测定结果带来偏差。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP),常被用于衍生单糖,结合高效液相色谱法分析,具有反应条件较温和,产物无立体异构等优点。1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)也是常用的衍生试剂,如孙志伟等用NMP衍生测定油菜花粉多糖中单糖的组成(孙志伟,刘凌君,户宝军,等.1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生试剂的制备及其在高效液相色谱-质谱法测定糖类化合物中的应用[J].色谱,2008(02):200-205),其反应机理与PMP相同,都可以与单糖反应生成具有紫外吸收的糖-双衍生试剂产物,但是以上两种衍生试剂都存在检测限高,样品消耗量大,用质谱检测只能对样品定性,不能定量等缺点。用普通衍生试剂衍生结合LC-MS对单糖定量,需要做一系列的标准曲线,不仅步骤繁琐,而且对珍贵的生物样品来说也是一种浪费,同时单糖的分离结果并不理想。
发明内容
针对以上现有技术存在的不足,本发明的目的是提供一种定性定量检测单糖的方法。
实现上述发明目的的技术方法是:
1.一种检测单糖的方法,具体包括如下步骤:
(1)用衍生试剂对单糖进行衍生;
(2)将衍生产物进行液相色谱质谱联用(LC-MS)分析;
所述的衍生试剂包括1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)和1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP);
所述的衍生试剂D3NMP单独使用或与NMP联用。
2.一种检测单糖的方法,其特征在于,所述的单糖为动物、植物和微生物来源的多糖及寡糖的基本组成单元。
3.D3NMP的制备方法包括如下步骤:
(1)称取萘肼盐酸盐,置于水中,加热至100℃,使其完全溶解,用20%NaOH溶液调节PH至8-9,抽滤后得到固体,用水洗涤直至PH为7,抽滤后真空干燥,得萘肼;
(2)将萘肼加入无水乙醇中,于55℃水浴条件下搅拌至其溶解,滴加氘代乙酰乙酸乙酯,滴加完毕后反应2h,然后升温至80℃回流7h,将反应液减压浓缩至原体积的1/3,用甲醇将其重结晶3次,得D3NMP;
其中萘肼与氘代乙酰乙酸乙酯的物质量之比为1.2:1。
反应方程式如下:
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明方法对微量样品既可以定性又可以定量,检测灵敏度高,操作简便,可以同时对两种未知样品进行相对定量,质谱图信噪比低,分离所需的流动相极生小,对色谱柱有很好的保护作用,大大延长了柱子的使用寿命。本发明方法比传统PMP衍生法的灵敏度高4-5倍,比传统NMP衍生法能够更好地分离单糖,不会出现单糖色谱峰重叠的现象。
附图说明
图1为七种单糖标准品D3NMP衍生产物的紫外吸收图。
图2为葡糖糖NMP衍生物及葡萄糖D3NMP衍生物的质谱图。
图3为葡糖糖醛酸NMP衍生物及葡萄糖醛酸D3NMP衍生物的质谱图。
图4为葡糖糖胺NMP衍生物及葡萄糖胺D3NMP衍生物的质谱图。
图5为未知样品1的NMP衍生物及未知样品2的D3NMP衍生物的质谱图。
图6为七种单糖标准品PMP衍生产物与D3NMP衍生产物紫外吸收对比图。
图7为标准单糖NMP衍生物的色谱分离图。
图8为甘露糖NMP衍生产物的一级质谱图。
具体实施方式
实施例1 D3NMP的制备
称取萘肼盐酸盐5g,置于60mL水中,加热至100℃,使其完全溶解,用20%NaOH溶液调节至8-9,抽滤后得到固体,用水洗涤直至PH为7,抽滤后真空干燥,得3.5g萘肼。
将2g萘肼加入20mL无水乙醇中,于55℃水浴条件下搅拌至其溶解,滴加1.37g氘代乙酰乙酸乙酯,滴加完毕后反应2h,然后升温至80℃回流7h,将反应液减压浓缩至原体积的1/3,用10mL甲醇将其重结晶3次,得0.9gD3NMP。
计算得D3NMP的收率为33.3%
实施例2 D3NMP衍生产物的液相分析
将D3NMP配成0.5mol/L乙醇溶液,在氨水碱性介质下和葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、半乳糖、岩藻糖(0.05mol/L)于70℃条件下反应90mm。反应完毕后,用氯仿萃取3次,离心,取上清液,终体积为25uL,进行LC-MS分析。液相条件:液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um,Agilent),流速1mL/min,流动相A为乙腈,流动相B为0.01mol/L乙酸铵溶液,上样量为2uL;流动相条件:流动相29%A15min,29%A30min线性增加到33%A,33%A15min线性增加到35%A,29%A10min,245nm检测。结果见图1。
结果显示,D3NMP衍生的七种单糖得到了很好的分离。
实施例3 NMP、D3NMP衍生的LC-MS分析
将NMP/D3NMP配成0.5mo1/L乙醇溶液,在氨水碱性介质下NMP与已知量的葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺(0.01mol/L)共10uL反应,D3NMP与待测的葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺反应,70℃反应90min。反应完毕后,用氯仿萃取3次,离心,取上清液,终体积都为50uL,等体积混合已知量与未知量样品,进行LC-MS分析。液相条件:液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um,Agilent),流速15uL/min,流动相A为乙腈,流动相B为0.01mol/L乙酸铵溶液,上样量为0.02uL;流动相条件:流动相27%A15min,27%A30min线性增加到31%A,31%A15min线性增加到34%A,27%A10min,245nm检测。质谱检测为负离子模式。结果见图2,图3,图4。
图2显示,m/z=609.22为NMP衍生的葡萄糖的质谱峰,m/z=615.24为D3NMP衍生的葡萄糖的质谱峰,两种衍生试剂可以成功衍生葡萄糖,通过相对丰度可知,待测葡萄糖的浓度为0.82mg/mL。
图3显示,m/z=623.20为NMP衍生的葡萄糖醛酸的质谱峰,m/z=629.24为D3NMP衍生的葡萄糖醛酸的质谱峰,两种衍生试剂可以成功衍生葡萄糖醛酸,通过相对丰度可知,待测葡萄糖醛酸的浓度为0.7mg/mL。
图4显示,m/z=608.22为NMP衍生的葡萄糖胺的质谱峰,m/z=614.24为D3NMP衍生的葡萄糖胺的质谱峰,两种衍生试剂可以成功衍生葡萄糖胺,通过相对丰度可知,待测葡萄糖胺的浓度为0.8mg/mL。
本实施例采用D3NMP和NMP分别衍生待测样品和已知样品,进行LC-MS分析,不仅能对待测样品进行定性而且还能定量。
实施例4 NMP、D3NMP衍生两种未知样品的LC-MS分析
将NMP/D3NMP配成0.5mol/L乙醇溶液,取含甘露糖的未知样品1和未知样品2各10uL,分别在氨水碱性介质下与NMP和D3NMP于70℃反应90min。反应完毕后,用氯仿萃取3次,离心,取上清液,终体积都为50uL,等体积混合未知样品1和未知样品2,进行LC-MS分析。液相条件:液相柱0.3×250mmSB-C18柱(5un,Agilent),流速15uL/min,流动相A为乙腈,流动相B为0.01mol/L乙酸铵溶液,上样量为0.02uL;流动相条件:流动相27%A15min,27%A30min线性增加到31%A,31%A15min线性增加到34%A,27%A10min,245nm检测。质谱检测为负离子模式。结果见图5。
图5显示,m/z=609.22为NMP衍生的未知样品1中甘露糖的质谱峰,m/z=615.24为D3NMP衍生的未知样品2中甘露糖的质谱峰,样品1中甘露糖的含量是样品2中甘露糖含量的1.82倍。说明该方法可以同时对两种未知样品进行相对定量。
对比实施例1 PMP衍生产物的液相分析
将PMP配成0.5mol/L乙醇溶液,在氨水碱性介质下和葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、半乳糖、岩藻糖(0.05mol/L)于70℃条件下反应90min。反应完毕后,用氯仿萃取3次,离心,取上清液,终体积为25ul,进行LC-MS分析。液相条件:液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um,Agilent),流速1mL/min,流动相A为乙腈,流动相B为0.01mol/L乙酸铵溶液,上样量为2uL;流动相条件:流动相17%A10min,17%A30min线性增加到21%A,21%A10min线性增加到23%A,17%A10min,245nm检测。结果见图6。
图6显示,PMP衍生的七种单糖得到了很好的分离。比较PMP衍生产物与D3NMP衍生产物的紫外吸收图,后者坐标比前者升高了4-5倍,说明对于等量样品的分析,D3NMP衍生比PMP衍生灵敏度升高了4-5倍。实施例2的流动相中乙腈含量比对比实施例1流动相中乙腈含量高,说明实施例2比对比实施例1的流动相极性小,这样对C-18反相柱有很好的保护作用,大大延长了柱子的使用寿命。
对比实施例2 NMP衍生产物的LC-MS分析
孙志伟等报道NMP衍生产物的LC-MS分析(孙志伟,刘凌君,户宝军,等.1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡比唑啉酮衍生试剂的制备及其在高效液相色谱-质谱法测定糖类化合物中的应用[J].色谱,2008(02):200~205),详细过程是:向安瓿瓶中加入200mL NMP乙腈溶液、20mL单糖标准品混合液、20mL17%氨水,封口后于70℃水浴中反应35min,取出放冷后用氮气吹干,加入2mL乙腈-水(体积比为4:1)超声溶解,取10uL进样分析。色谱柱:Hypersil ODS2柱(4.6mm×200mm,5um)。流动相:A相为30%乙腈(含30mmol/LNH4H2PO4);B相为60%乙腈。洗脱程序:0-50min,100%A-55%A;流速1.0m L/min;进样量10uL;柱温30℃;检测波长254nm。质谱条件:质谱分析时缓冲盐换为20mmol/L CH3COONH4(pH=5.0)。电喷雾电离源,正离子模式监测,电喷雾压力241.3kPa(35psi),干燥气流量为9L/min,干燥气温度350℃,毛细管电压3500V,单糖分离结果见图7,图8。
比较对比实施例2与实施例2的紫外吸收图,由图1可知,本发明可以很好地分离七种单糖标准品,但图7显示,两种中性糖葡萄糖和半乳糖并没有得到分离,二者的质谱峰有重叠,此结果说明本发明方法比传统的NMP方法可以更好地分离单糖。
比较对比实施例2与实施例3,对比实施例2最后用于LC-MS分析的每种单糖的物质的量为1×10-2umol,而实施例3最终的量为1×10-4umol,说明实施例3检测样品用量比对比实施例2降低了100倍;比较图2、图3、图4和图8,图2、图3,图4比图8的杂峰少,说明信噪比低;对比实施例2只能对待测样品进行定性,不能用LC-MS进行定量。
实施例2-4单糖与NMP、D3NMP的反应方程式如下:
X=H或D。
反应式中的葡萄糖可以为其他单糖,当X=H时反应物为NMP,当X=D时反应物为D3NMP。
Claims (3)
1.一种检测单糖的方法,包括如下步骤:
(1)用衍生试剂对单糖进行衍生;
(2)将衍生产物进行液相色谱质谱联用(LC-MS)分析;
其特征在于,所述的衍生试剂选自1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮或1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮;所述的衍生试剂1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮单独使用或与1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮联用;
所述的液相色谱质谱联用分析条件包括:Agilent液相柱5μm 0.3×250mm SB-C18柱,流速15μL/min,流动相A为乙腈,流动相B为0.01mol/L乙酸铵溶液,上样量为0.02μL;流动相27%A 15min,27%A30min线性增加到31%A,31%A 15min线性增加到34%A,27%A 10min,245nm检测,质谱检测为负离子模式。
2.如权利要求1所述的一种检测单糖的方法,其特征在于,所述的单糖为动物、植物和微生物来源的多糖及寡糖的基本组成单元。
3.制备权利要求1或2任意一项所述的1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)称取萘肼盐酸盐,置于水中,加热至100℃,使其完全溶解,用20%NaOH溶液调节PH至8-9,抽滤后得到固体,用水洗涤直至PH为7,抽滤后真空干燥,得萘肼;
(2)将萘肼加入无水乙醇中,于55℃水浴条件下搅拌至其溶解,滴加氘代乙酰乙酸乙酯,滴加完毕后反应2h,然后升温至80℃回流7h,将反应液减压浓缩至原体积的1/3,用甲醇将其重结晶3次,得1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮;
所述的萘肼与氘代乙酰乙酸乙酯的物质量之比为1.2∶1。
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