CN103571954A - Tert启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，属于生物技术领域。TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，所述TERT启动子的单核苷酸多态性序列为：TERT启动子chr5,1,295,228位为C或T的碱基多态性序列；TERT启动子chr5,1,295,242-1,295,243位为CC或TT的碱基多态性序列；TERT启动子chr5,1,295,250位为C或T的碱基多态性序列。所述泌尿***肿瘤为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌。本发明的优点在于首次在泌尿系肿瘤中发现TERT启动子的高频突变，为泌尿生殖***肿瘤预后和监测的提供一种新的生物标志物。

Description

TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用。

背景技术

膀胱癌是排在第九位的全球最常见的肿瘤。2013年,在美国有超过73000名患者被诊断为膀胱癌，其中死亡人数约15000人。其中超过90%的患者最初诊断为原发性膀胱癌，大约75%的患者目前为表浅***,20%的为浸润性***,剩下的5%初诊为转移性肿瘤。先前的研究表明,膀胱癌有着多变的临床表现和遗传背景。最近的***研究报道了8个相关基因(UTX,MLL-MLL3,CREBBP-EP300,NCOR1, ARID1A,CHD6)。

目前检测“膀胱癌”采用的肿瘤标记物主要有以下几种，但是各肿瘤标志物都存在不同的缺点：

(1)、***抗原(BTA)：BTA试剂分为BTA stat和BTA test两种；首先，这两种试剂都不能独立用于确诊膀胱癌；另外，BTA试剂价格昂贵，目前尚难以全面推广使用；

(2)、Lewis X抗原检测：Lewis X是一种ABO血型相关抗原，在正常尿路上皮中不存在该抗原；而5%～89%的移行细胞癌可检出Lewis X，但Lewis X与肿瘤的分级无关；

(3)、核基质蛋白22(nuclear matrix protein22，NMP22)：NMP22是核有丝***器蛋白，诊断膀胱癌的敏感性为48%～90%，特异性为70%～92%，NMP22对高级，高期膀胱癌敏感性较高；

(4)、纤维蛋白/纤维蛋白降解产物(fibrin degradation products，FDP)：用快速免疫检测法测定尿中FDP诊断膀胱癌的敏感性为68%，对T2～T4期膀胱癌的敏感性更是高达100%；

(5)、玻璃酸酶检测hyaluronidase,HAase：玻璃酸酶是一种细胞外降解基质透明质酸的内源性糖苷酶，在肿瘤进展中起重要作用，应用凝胶技术检测G2，G3级膀胱癌尿液中玻璃酸酶活性，敏感性达92%～100%；

(6)、端粒酶活性(telomerase)：端粒是位于染色体末端的保护性结构，随细胞***逐步缩短，直至细胞死亡，端粒酶的作用就是延长端粒，现已发现多种肿瘤细胞中端粒酶活性增强，该法诊断包括低级，低期肿瘤在内的膀胱癌，敏感性可达91%。

然而，导致***发生的关键点仍未完全阐明，同时由于这些个体标记的灵敏性较低以至于未被应用于临床实践中，这表明需要新的灵敏性高的生物标记。

发明内容

在本发明的试验过程中，在超过85%的人类肿瘤研究中发现端粒酶逆转录酶(TERT， TERT通过Human Genome Browser获取 NCBI发布版本37的人类基因组序列：Feb.2009(GRCh37/hg19 )；>hg19_ensGene_ENST00000310581_0 range=chr5:1295163-

1296562 5'pad=400 3'pad=0 strand=- repeatMasking=none)活跃,我们认为是一个人类肿瘤发生的重要机制。TERT是端粒酶的催化部分，位于5号染色体短臂 , 在人类肿瘤中调节端粒酶活性。最近人们应用全基因组测序在黑素瘤中发现TERT启动子突变。人们在一些膀胱癌样本中证实了高频率的TERT启动子突变。一些研究发现, 具有活性的端粒酶或TERT表达增加与肿瘤的病理分期以及临床分期是相关联的。然而,人们还未获得TERT基因拷贝，TERT的表达或活性对膀胱癌的临床影响仍然是有争议的。在本发明中，我们通过试验得到TERT启动子的高频突变位点，并进行了相关的体外功能分析试验来证实：这些启动子的突变可提高ETRT活性，是导致恶性肿瘤发生的关键点所在，还分析了应用临床病理因素来评估TERT基因作为早期癌症检测和预后的生物标记的作用，表明这些突变对泌尿生殖***恶性肿瘤的诊断和预后具有重要的意义。

本发明的目的在于公开了TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，所述TERT启动子的单核苷酸多态性序列为：

TERT启动子chr5, 1,295,228位为C或T的碱基多态性序列；

TERT启动子chr5, 1,295,242-1,295,243位为CC或TT的碱基多态性序列；

TERT启动子chr5, 1,295,250位为C或T的碱基多态性序列。

上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，其中，所述泌尿***肿瘤为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌。

上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，其中，所述应用包括下述步骤：

(1)、从样本泌尿***组织中提取DNA；

(2)、以包含TERT启动子基因的待测基因组DNA为模板，以引物对P为引物， PCR扩增TERT启动子基因，所述引物对P为：

TF：5’-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3’， 

TR：5’-GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’；

PCR扩增完成后，对PCR产物进行sanger测序，当样本中含有TERT启动子的单核苷酸多态性序列时，该样本为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌样本。

上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，其中，所述的PCR反应体系体积为20μl，含有dNTP 2 μl、10×PCR Buffer 2 μl 、TF(10 μM) 1μl、TR(10 μM) 1μl、模板DNA 1μl、dH₂O 12.5μl和TaKaRa Taq HS 0.5μl。

上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，其中，所述的PCR扩增反应程序为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

本发明具有以下有益效果： 

1、本发明为检测膀胱癌提供一种新的肿瘤标志物，对发现膀胱癌及其相关疾病的易感人群和基因诊断有重要价值； 

2、本发明中的TERT启动子的高频突变可能膀胱癌发生的关键点所在，对探索膀胱癌等疾病的发病机制有重要意义； 

3、本发明为临床生物治疗提供了分子靶向，同时也开辟新的治疗途径起到重要作用。

附图说明：

图1为通过ABI 3730 XL测序仪对PCR产物进行sanger测序得到的反链上体细胞突变位点；

图2为PCR(RT-PCR)对TERT表达的分析结果，其中WT为野生型、C228T为正链chr5, 1,295,228C>T突变和C250T为正链chr5, 1,295,250 C>T；

图3为蛋白免疫印记技术检测TERT的表达分析结果，其中WT为野生型、C228T为正链chr5, 1,295,228C>T突变和C250T为正链chr5, 1,295,250 C>T；

图4为染色质免疫共沉淀 (ChIP)试验检测TERT表达分析结果，其中WT为野生型、C228T为正链chr5, 1,295,228C>T突变和C250T为正链chr5, 1,295,250 C>T；

图5为划痕愈合实验检测TERT启动子突变对膀胱癌细胞的侵袭能力的结果，其中WT为野生型、C228T为正链chr5, 1,295,228C>T突变和C250T为正链chr5, 1,295,250 C>T；

图6为TERT 启动子突变和膀胱癌患者的病理因素分析结果图。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用作进一步的说明。

试验例1： 通过TERT启动子的单核苷酸多态性序列检测泌尿***肿瘤：

一、样本来源及选择标准：

用中国泌尿生殖***癌症基因组学协会(UCGC)会员机构新诊断的泌尿***癌症病人的肿瘤组织作为实验组，同时用患者的外周血或形态正常膀胱组织作为对照组。所有标本收集后用液氮快速冷冻并立即存储在-80℃的环境中以用于更远研究。由两个独立的病理学家在显微镜下评估由苏木精-伊红(HE)染色制备的癌组织切片。在本研究中，仅有肿瘤细胞超过80%的肿瘤组织被用来提取DNA和进行随后的测序。目前研究中总共有302位泌尿生殖系肿瘤患者参与测序，包括216名膀胱癌患者，11名肾盂癌患者，24名肾细胞癌患者，21名肾上腺肿瘤患者，17名睾丸癌患者及13名***癌患者。

样本的选择标准：1、所有患者(302例)在术前都未经放疗或化疗；2、患者都是由中山肿瘤中心确诊的；3、样本组织都是新鲜组织，切下后30分钟内放入RNAlater中，并在4°C冷藏过夜，其后-80°C低温储存；4、经HE染色，肿瘤细胞超过80%的肿瘤组织；5、正常扥肾组织在病理学检查中显示正常的肾小管和肾小球且无肿瘤细胞污染；6、年龄大于18岁。

二、主要试剂和仪器：

 QIAamp DNA Mini Kits (试剂盒、希尔登, 德国)；Dual 96-well GeneAmp PCR System 9700(美国，Life Technologies公司)；ABI 3730 XL测序仪(美国应用生物***公司)；TAKARATaqTM Hot Start(试剂盒、大连宝生物工程有限公司)。

三、操作步骤：

(一)、按照QIAamp DNA Mini Kits试剂盒中说明书的步骤对302例样本(癌症患者的肿瘤组织作为实验组，同时用患者的外周血或形态正常膀胱组织作为对照组)中的DNA进行提取：

1、切割组织样品，确定组织的数量，对于样本组织的取材应在25mg以内。DNA产量与组织类型和大小有关,一般来说1mg组织可得到大约0.2-1.2μg的DNA。

2、将切割下来的组织样品切碎(step2a)，研磨(step2b)：

2a.将约25毫克的组织样品切成小块。放入一个1.5ml离心管,并添加180μl Buffer ATL。

2b.在将组织样品置于液氮中,研磨磨彻底后倒入到1.5ml离心管。加入180μl Buffer ATL。此过程中，液氮可以挥发，但组织不能融化。

3、加入20μl proteinase K，振荡处理20s，56℃水浴至组织完全裂解。

注：proteinase K必须使用，因为QIAGEN Protease在Buffer ATL存在的情况下活性已降低。裂解时间视组织块大小而定，通常1-3h即可完全裂解。过夜处理是合理的，无不良影响。为保证裂解效率，应使用振荡水浴或者振荡台。

4、1.5毫升微型离心机短时离心，以去除离心管盖内沿液体。

5、加入200μl Buffer AL，振荡15S，70℃水浴10min。1.5毫升微型离心机短时离心，以去除离心管盖内沿液体。

加入Butter AL后，可能会产生白色沉淀物，70℃水浴中大都可以溶解。这些沉淀物对于抽提过程和后续实验没有影响。

6、加入200μl乙醇(浓度为96%-100%)，振荡15s，1.5毫升微型离心机短时离心，以去除离心管盖内沿液体。加入乙醇后，可能会产生白色沉淀物。这些沉淀物对于抽提过程和后续实验没有影响。

7、仔细的将以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp Mini spin column中,将离心柱放入2ml收集管中。盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供),丢弃旧的收集管与滤液。6000×g (8000rpm)离心是为了减少噪音，最大速度离心不影响DNA产量和纯度。务必使所有溶液进入到收集管，如没有，则需再次以更高速度离心直至所有溶液进入收集管。

8、小心加入500μl Buffer AW1到QIAamp Mini spin column中,盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)。丢弃收集管及其中的虑液。

9、小心加入500μl Buffer AW2到QIAamp Mini spin column中；盖紧离心管盖，以20000×g(14000rpm)离心3min。

10、将QIAamp Mini spin column置入一支新的2ml收集管中(自备)，丢弃旧的收集管与滤液。全速离心1min。此步是为了防止Buffer AW2残留。

11、将QIAamp Mini spin column置入一支洁净1.5ml收集管中(自备)，丢弃旧的收集管与滤液。小心在QIAamp Mini spin column中加入200μl Buffer AE或蒸馏水。室温下静置1min，6000×g(8000rpm)离心1min。

12、重复step 11之离心操作。将收集管盖好，保存于-20℃，此时收集管中为肿瘤和正常对照的DNA。

(二)、PCR引物设计：

针对TERT核心启动子序列设计引物，用primer5.0设计引物：

TF:  5’-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3’； 

TR: 5’-GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’。

(三)、进行PCR扩增：利用Dual 96-well GeneAmp PCR System 9700 (美国，Life Technologies公司) PCR扩增仪，用步骤(二)中相同的引物扩增从步骤(一)中获得的DNA模板，.按照TAKARATaqTM Hot Start PCR试剂盒的说明书要求扩增出启动子片断：

(1)、按表1中的组份配制 PCR 反应体系(在冰上进行反应体系的配制)。

表1           PCR反应体系

(2)、在eppendof PCR热循环仪上进行PCR扩增，热循环条件为：94℃ 5分钟酶的活性化反应；94℃ 30秒、65℃ 30秒和72℃ 30秒，共35个循环；72℃ 10分钟；

(3)、将获得的PCR产物在4℃保存。

通过上述PCR扩增得到肿瘤组与正常对照组的PCR产物。

(四)、扩增出的PCR片断送到深圳华大基因研究院，利用ABI 3730 XL测序仪进行sanger测序，再将得到的峰图用novosnp软件分析寻找体细胞突变位点，总结如附图的图1所示。

(五)、.通过上述步骤得到的结果SEQ NO.ID 4(SEQ NO.ID 4中首位为chr5, 1,296,562末位为chr5, 1,295,163)与正常序列SEQ NO.ID 3 (SEQ NO.ID 3中首位为chr5, 1,296,562末位为chr5, 1,295,163)的对比分析得到：TERT的chr5 p15；33反链上的三处突变：chr5, 1,295,250 G>A (10.2%)；chr5, 1,295,228 G>A (42.6%)；chr5, 1,295,242-1,295,243 GG>AA (1.4%)，从而得到TERT的chr5 p15；33上chr5, 1,295,250 C>T；chr5, 1,295,228 C>T；chr5, 1,295,242-1,295,243 CC>TT这三处突变热点；如SEQ NO.ID 4中第1313、1320-1321、1335位所示。

结果：

一、泌尿生殖***肿瘤中TERT启动子基因突变的发生率分析： 

表2     泌尿生殖***肿瘤中TERT启动子基因突变的发生率分析

如表2所示，43%(130／302)的泌尿生殖道肿瘤显示TERT启动子体细胞突变，这些基因突变的在不同类型的肿瘤之间频率差别很大(表2)。高频率的突变发生在两种来源于泌尿上皮细胞的两类肿瘤中，包括膀胱癌和肾盂癌。在我们的样本中，在膀胱癌(55.6%)和肾盂癌(63.7%)中均有端粒酶逆转录酶核心启动子突变，但这些突变在肾细胞癌(8.3%)和肾上腺肿瘤(4.8%) 中较为罕见,在睾丸癌和***癌还未被发现。在我们的样品基因组中chr5:1295228 G>A 和ch5:1295250 G >A两个突变热点(分别对应到chr5, 1,295,228 C>T，chr5, 1,295,250 C>T)尤其常见(图1和表2所示)。chr5, 1,295,228 G>A突变在膀胱癌和盂癌中发生率分别为42.6%、45.5%。chr5, 1,295,250 G>A突变发生率则分别为10.2%、18.2%。在肾细胞癌和肾上腺肿瘤患者中，只有chr5, 1,295,228 G>A突变可以观察到(分别为8.3%和4.8%)。此外，我们还发现在膀胱癌患者的其他两个突变的低频，包括单碱基G→T取代chr5:1295228和串联GG＞AA突变的位置chr5:1295242-1295243 (chr5, 1,295,242-1,295,243  CC>TT)。两种低频突变只能在1.4%(3／216)的肿瘤患者中观察到。本试验表明TERT启动子突变可导致ETRT活性增加，是导致恶性肿瘤发生的关键点所在。

试验例2： TERT启动子突变的体外功能分析试验：

根据上述试验例1的得到的TERT启动子突变的结果，为了评估TERT启动子突变对膀胱癌功能的影响，我们进行一系列体外功能分析试验：

主要试剂和或仪器：；Lipofectamine 2000(试剂盒，美国，Life Technologies公司)；SYBR Green (试剂盒, Roche Diagnostics公司 ,美国)；酶染色IP套件(Cell Signaling公司)； ETS1抗体(圣克鲁斯，SC-55581)；徕卡DMI 6000 B 显微镜 (徕卡，韦茨，德国)。

一、方法：

以下各方法中所述chr5, 1,295,228 C>T 和chr5, 1,295,250 C>T为正链，其对应的反链为chr5, 1,295,228 G>A 和 chr5, 1,295,250 G>A。

(一)、通过TALENs方法将突变热点引入膀胱癌T24细胞系。

采用TALENs(参见Shuji Takada, Tempei Sato, Yoshiaki Ito, Satoshi Yamashita1, Tomoko Kato1, Miyuri Kawasumi,Masami Kanai-Azuma, Arisa Igarashi1, Tomomi Kato, Moe Tamano1, Hiroshi Asahara：Targeted Gene Deletion of miRNAs in Mice by TALEN System.PLOS ONE  October 2013,Volume 8, Issue 10,e76004)将上述突变热点引入位于TERT转录起始位点上游chr5, 1,295,228 C>T 和chr5, 1,295,250 C>T的位置(反链上chr5, 1,295,228 G>A 和 chr5, 1,295,250 G>A )，通过GoldenGate 方法整合到T24细胞中。简而言之，将针对TERT启动子chr5, 1,295,228和chr5, 1,295,250位点的TALENs克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.1(-) 上，并按照制造商的说明书使用Lipofectamine 2000(试剂盒，美国，Life Technologies公司)转染导入T24细胞系。

(二)、染色质免疫共沉淀 (ChIP)试验

按照Shuji Takada, Tempei Sato, Yoshiaki Ito, Satoshi Yamashita1, Tomoko Kato1, Miyuri Kawasumi,Masami Kanai-Azuma, Arisa Igarashi1, Tomomi Kato, Moe Tamano1, Hiroshi Asahara：Targeted Gene Deletion of miRNAs in Mice by TALEN System.PLOS ONE  October 2013,Volume 8, Issue 10,e76004.中操作标准，使用简单的芯片酶染色IP套件(＃9003，Cell Signaling公司)，应用ETS1抗体(SC-55581,圣克鲁斯公司，)对携带野生型(WT)和启动子突变(反链上chr5, 1,295,228 G> A和chr5, 1,295,250 G> A)的T24细胞为标本来进行芯片检测。

(三)、TERT表达分析

    利用实时定量PCR(RT-PCR)(参见David Vilchez, Leah Boyer, Ianessa Morantte, Margaret Lutz, Carsten Merkwirth, Derek Joyce, Brian Spencer, Lesley Page,Eliezer Masliah, W. Travis Berggren, Fred H. Gage & Andrew Dillin：Increased proteasome activity in human embryonic stem cells is regulated by PSMD11.VOL489，NATURE，(13 SEPTEMBER 2012)304-308.)对TERT表达的分析：利用Light-Cycler 2特异性引物对：F，5-caccctcgaggtgagacg-3； R，5-gccgattgtgaacatggact-3来进行。TERT的转录扩增产物通过结合荧光染料SYBR Green (试剂盒, Roche Diagnostics公司 ,美国) 染色被检测到。所有扩增产物的循环条件如下：最初95℃10分钟，接下来的45个循环需在94℃25秒，60℃下25秒，和72℃15秒。在2.5 mM的氯化镁存在下进行所有的循环反应。特定基因产物经熔解曲线分析。基因的正常表达通过管家基因GAPDH的表达及以下引物对：F，5-gatgatgttctggagagccc-3；R，5-ttcgtcatgggtgtgaacc-3来完成。

(四)、蛋白免疫印记技术检测TERT的表达

按照Ting Tan, Zhi-Qi Hu：Construction and expression of retroviral vector pLEGFP-N1-TERT in preparation of seed cells for skin tissue engineering.Asian Pacific Journal of Tropical Medicine (2013)960-963.中的方法从T24细胞中提取的总蛋白溶于7.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶中，并转印到膜。将样品置于兔抗人TERT单克隆抗体孵育37℃下2小时，然后将其存储在4℃下保温过夜。再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG室温下孵育1小时后，黑暗条件下2分钟样品将会被显色底物染色。其中β-肌动蛋白担任的内部控制作用。

(五)、划痕愈合实验

按照Imad Al Ghouleh, Andrés Rodríguez, Patrick J. Pagano and Gábor Csányi：Proteomic Analysis Identifies an NADPH Oxidase 1(Nox1)-Mediated Role for Actin-Related Protein 2/3Complex Subunit 2 (ARPC2) in Promoting Smooth Muscle Cell Migration. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 20220-20235；doi:10.3390/ijms141020220.中的方法将拥有野生型和突变型的启动子的T24细胞接种于6孔板中，达到80%左右汇合。首先，细胞被至于含2%胎牛血清(FCS)的培养基中饥饿24小时。随后进行划痕操作，接着使用一个10μL白尖为每个划痕进行治愈。然后，细胞用PBS冲洗后用徕卡DMI 6000 B 显微镜 (徕卡，韦茨，德国)拍照。受伤的区域的细胞孵育24小时后，再进行一次拍照。

二、结果：(TERT启动子突变的体外功能分析) 

为了评估TERT启动子突变的潜在功能后果，我们通过TALENs将chr5, 1,295,228G> A和chr5, 1,295,250G> A突变导入膀胱癌T24细胞株，然后观察这些突变所造成的功能变化。RT-PCR和免疫印迹分析的结果(见图2和图3)表明，相比WT细胞株，拥有chr5, 1,295,228 G> A或chr5, 1,295,250 G> A突变等位基因的膀胱癌细胞TERT表达水平显着不受限制。这一结果表明，chr5, 1,295,228 G> A和chr5, 1,295,250 G> A突变可能有利于TERT启动子的转录因子结合，从而增强TERT的表达。由于肿瘤中单碱基和串联突变的确定，我们猜测TERT启动子突变产生突变的结合基序的转录因子Ets1，我们使用抗Ets1抗体进行了染色质免疫共沉淀技术检测突变是否会增加转录因子与TERT启动子的结合。与非特异性IgG对照抗体相比，在突变的T24细胞中而非在WT T24细胞中可观察到TERT启动与ETS1抗体的显着富集(见图4)。这项研究结果确认，chr5, 1,295,228G> A和chr5, 1,295,250G> A突变增强了TERT启动子和转录因子ETS1之间的结合。

为研究TERT启动子突变是否会影响膀胱癌细胞的侵袭能力，我们进行了伤口愈合实验，以检查的WT和突变T24的细胞的细胞活力。24h后，我们观察到相比野生型对组, chr5, 1,295,228 G> A和chr5, 1,295,250 G> A突变细胞实验组均显着促进划痕愈合 (见图5)。这一结果证明，TERT启动子中chr5, 1,295,228G> A和chr5, 1,295,250 G> A突变均可提高膀胱癌细胞的侵袭能力。

试验例3 ： TERT突变与膀胱癌(试验例1中的216例:具体的信息总结如表3)患者临床特征相关性分析：

表3           膀胱癌患者的病理因素分析

病人特征(Clinical features)	突变(# of samples with mutations)	非突变(# of samples without mutations)	P 值(P value)
				表浅的/浸润性的
表浅的	39	49	0.0059
				浸润性的	81	47
浸润深度-分级
				Ta-1	56	58	0.0443
T2-4	64	38
				性别
男	107	77	0.0655
				女	13	19
年龄
				10-49	15	25	0.0109
50-89	105	71

TERT 启动子突变和膀胱癌患者的病理因素分析：由图6和表3所示，在临床上，有两个不同的膀胱癌(TCC)组，高达70%的病例是表层的非肌层浸润性膀胱癌(NMI TCCS，Ta和T1期)，这类病人很容易复发，但一般不会危及生命；而高达30%的病例是浸润性膀胱癌(MI TCCS，T2–T4期)，这类患者由于存在远处转移而具有较高的死亡率。在我们的TCC的队列中，我们发现TERT启动子突变均与移行细胞癌侵袭能力有关。在MI-TCC亚型TERT启动子突变率(81 / 128,63.3 %)显著高于NMI -TCC亚型(39／88,44.3 %；应用皮尔森χ2试验得P = 0.0059)。这一结果表明TERT启动子突变可能提高TCC肿瘤细胞的侵袭力，促进TCC发生及进展。因此，我们的数据显示：相比于TERT启动子在低级别亚型(49.1%， Ta和T1的56／114)突变频率，在高级别TCC亚型中突变频率(62.7%，T2-4的64／102)更高(P＜0.05)。这一结果表明TERT启动子突变可能存在于TCC发生发展的晚期事件中，以及用于远处转移风险的预测。我们还发现男性患者的TERT启动子突变频率(58%，107／184)高于女性患者(41%，13／32)，但差异不显著(应用皮尔森χ2试验得P = 0.0655)。此外，我们发现患者的年龄50岁以上的TERT启动子突变的频率(59.7%，105／176)明显高于50岁以下（37.5%，15／40)(应用皮尔森χ2试验得P = 0.0109)。这一结果表明，老年人TERT启动子突变更可能促进TCC的发生、发展。本发明中，通过TERT启动子的单核苷酸多态性序列检测泌尿***肿瘤，筛选了302个泌尿生殖肿瘤的TERT启动子的突变，并确定了几个高频率突变热点，通过试验例2进行了体外功能分析，表明并进行了相关的体外功能分析试验来证实：这些启动子的突变可提高ETRT活性，是导致恶性肿瘤发生的关键点所在，同时还分析了应用临床病理因素来评估TERT基因作为早期癌症检测和预后的生物标记的作用，这些突变对泌尿生殖***恶性肿瘤的诊断和预后具有重要的意义。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  深圳市第二人民医院

 

<120>  TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  引物对P中上游引物序列TF

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(18)

 

<400>  1

cagcgctgcc tgaaactc                                                     18

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  引物对P中上游引物序列TP

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(18)

 

<400>  2

gtcctgcccc ttcacctt                                                     18

 

 

<210>  3

<211>  1400

<212>  DNA

<213>  TERT正常序列

 

<400>  3

gtggcagaga caattcacaa acacagccct ttaaaaaggc ttagggatca ctaaggggat       60

 

ttctagaaga gcgacctgta atcctaagta tttacaagac gaggctaacc tccagcgagc      120

 

gtgacagccc agggagggtg cgaggcctgt tcaaatgcta gctccataaa taaagcaatt      180

 

tcctccggca gtttctgaaa gtaggaaagg ttacatttaa ggttgcgttt gttagcattt      240

 

cagtgtttgc cgacctcagc tacagcatcc ctgcaaggcc tcgggagacc cagaagtttc      300

 

tcgcccctta gatccaaact tgagcaaccc ggagtctgga ttcctgggaa gtcctcagct      360

 

gtcctgcggt tgtgccgggg ccccaggtct ggaggggacc agtggccgtg tggcttctac      420

 

tgctgggctg gaagtcgggc ctcctagctc tgcagtccga ggcttggagc caggtgcctg      480

 

gaccccgagg ttgccctcca ccctgtgcgg gcgggatgtg accagatgtt ggcctcatct      540

 

gccagacaga gtgccggggc ccagggtcaa ggccgttgtg gctggtgtga ggcgcccggt      600

 

gcgcggccag caggagcgcc tggctccatt tcccaccctt tctcgacggg accgccccgg      660

 

tgggtgatta acagatttgg ggtggtttgc tcatggtggg gacccctcgc cgcctgagaa      720

 

cctgcaaaga gaaatgacgg gcctgtgtca aggagcccaa gtcgcgggga agtgttgcag      780

 

ggaggcactc cgggaggtcc cgcgtgcccg tccagggagc aatgcgtcct cgggttcgtc      840

 

cccagccgcg tctacgcgcc tccgtcctcc ccttcacgtc cggcattcgt ggtgcccgga      900

 

gcccgacgcc ccgcgtccgg acctggaggc agccctgggt ctccggatca ggccagcggc      960

 

caaagggtcg ccgcacgcac ctgttcccag ggcctccaca tcatggcccc tccctcgggt     1020

 

taccccacag cctaggccga ttcgacctct ctccgctggg gccctcgctg gcgtccctgc     1080

 

accctgggag cgcgagcggc gcgcgggcgg ggaagcgcgg cccagacccc cgggtccgcc     1140

 

cggagcagct gcgctgtcgg ggccaggccg ggctcccagt ggattcgcgg gcacagacgc     1200

 

ccaggaccgc gcttcccacg tggcggaggg actggggacc cgggcacccg tcctgcccct     1260

 

tcaccttcca gctccgcctc ctccgcgcgg accccgcccc gtcccgaccc ctcccgggtc     1320

 

cccggcccag ccccctccgg gccctcccag cccctcccct tcctttccgc ggccccgccc     1380

 

tctcctcgcg gcgcgagttt                                                 1400

 

 

<210>  4

<211>  1400

<212>  DNA

<213>  TERT突变序列

 

<400>  4

gtggcagaga caattcacaa acacagccct ttaaaaaggc ttagggatca ctaaggggat       60

 

ttctagaaga gcgacctgta atcctaagta tttacaagac gaggctaacc tccagcgagc      120

 

gtgacagccc agggagggtg cgaggcctgt tcaaatgcta gctccataaa taaagcaatt      180

 

tcctccggca gtttctgaaa gtaggaaagg ttacatttaa ggttgcgttt gttagcattt      240

 

cagtgtttgc cgacctcagc tacagcatcc ctgcaaggcc tcgggagacc cagaagtttc      300

 

tcgcccctta gatccaaact tgagcaaccc ggagtctgga ttcctgggaa gtcctcagct      360

 

gtcctgcggt tgtgccgggg ccccaggtct ggaggggacc agtggccgtg tggcttctac      420

 

tgctgggctg gaagtcgggc ctcctagctc tgcagtccga ggcttggagc caggtgcctg      480

 

gaccccgagg ttgccctcca ccctgtgcgg gcgggatgtg accagatgtt ggcctcatct      540

 

gccagacaga gtgccggggc ccagggtcaa ggccgttgtg gctggtgtga ggcgcccggt      600

 

gcgcggccag caggagcgcc tggctccatt tcccaccctt tctcgacggg accgccccgg      660

 

tgggtgatta acagatttgg ggtggtttgc tcatggtggg gacccctcgc cgcctgagaa      720

 

cctgcaaaga gaaatgacgg gcctgtgtca aggagcccaa gtcgcgggga agtgttgcag      780

 

ggaggcactc cgggaggtcc cgcgtgcccg tccagggagc aatgcgtcct cgggttcgtc      840

 

cccagccgcg tctacgcgcc tccgtcctcc ccttcacgtc cggcattcgt ggtgcccgga      900

 

gcccgacgcc ccgcgtccgg acctggaggc agccctgggt ctccggatca ggccagcggc      960

 

caaagggtcg ccgcacgcac ctgttcccag ggcctccaca tcatggcccc tccctcgggt     1020

 

taccccacag cctaggccga ttcgacctct ctccgctggg gccctcgctg gcgtccctgc     1080

 

accctgggag cgcgagcggc gcgcgggcgg ggaagcgcgg cccagacccc cgggtccgcc     1140

 

cggagcagct gcgctgtcgg ggccaggccg ggctcccagt ggattcgcgg gcacagacgc     1200

 

ccaggaccgc gcttcccacg tggcggaggg actggggacc cgggcacccg tcctgcccct     1260

 

tcaccttcca gctccgcctc ctccgcgcgg accccgcccc gtcccgaccc cttccgggtt     1320

 

tccggcccag ccccttccgg gccctcccag cccctcccct tcctttccgc ggccccgccc     1380

 

tctcctcgcg gcgcgagttt                                                 1400

 

Claims (5)

1.TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，所述TERT启动子的单核苷酸多态性序列为：

TERT启动子chr5, 1,295,228位为C或T的碱基多态性序列；

TERT启动子chr5, 1,295,242-1,295,243位为CC或TT的碱基多态性序列；

TERT启动子chr5, 1,295,250位为C或T的碱基多态性序列。

2.根据权利要求1所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，其特征在于：所述泌尿***肿瘤为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌。

3.根据权利要求1或2所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，其特征在于，所述应用包括下述步骤：

(1)、从样本泌尿***组织中提取DNA；

(2)、以包含TERT启动子基因的待测基因组DNA为模板，以引物对P为引物， PCR扩增TERT启动子基因，所述引物对P为：

TF：5’-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3’， 

TR：5’-GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’；

PCR扩增完成后，对PCR产物进行sanger测序，当样本中含有TERT启动子的单核苷酸多态性序列时，该样本为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌样本。

4.根据权利要求3所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，其特征在于，所述的PCR反应体系体积为20μl，含有dNTP 2 μl、10×PCR Buffer 2 μl 、TF(10 μM) 1μl、TR(10 μM) 1μl、模板DNA 1μl、dH₂O 12.5μl和TaKaRa Taq HS 0.5μl。

5.根据权利要求3所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿***肿瘤中的应用，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

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