CN103571917A - Adh1b基因突变检测特异性引物和液相芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ADH1B基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对A3170G位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14，针对G3641T位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16，针对G4564T位点的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18，针对A5998G位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20，针对G531A位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22，和/或针对T4973C位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24；anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，能实现多个突变位点的野生型和突变型单独和并行检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种ADH1B基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术
ADH1B基因称乙醇脱氢酶1B，英文名称为alcohol dehydrogenase-1B，位于4号染色体4q23的长臂上，位于100227526到100242571碱基对之间。ADH1B基因编码的蛋白是乙醇脱氢酶家族的成员，这个酶家族成员可以消化代谢很多物质，包括乙醇、视黄醇、脂肪醇、脱氢氧化固醇以及脂质过氧化产物。这个编码蛋白由几个α，β和γ亚基的同质和异质二聚体组成，在乙醇氧化中具有很高的活性，并且在乙醇代谢中起着重要的作用。近来，人们还发现ADH1B基因的变异与癌症、肝脏功能紊乱、冠心病、糖尿病并发症、多发性神经病以及头颈部肿瘤也有一定的联系。
目前，ADH1B基因突变检测方法主要有：基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术（MALDI-TOF-MS），创造酶切位点法PCR（CRS-PCR），微阵列芯片技术，基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术是一种软电离技术，在蛋白质等生物大分子的检测中有着强大而成熟的功能，但是在核酸检测领域，由于核酸分子本身的特殊性，检测受到一定的限制。创造酶切位点引物的选择余地较小,只能利用多态性位点的近旁序列，而且CRS-PCR产物酶切后，不同等位基因间片段的长短差异只有大约一个引物的长度(一般为20bp~25bp)，如果扩增的长度较大，这样小的片段长度的差异在电泳时不易显示出来，将给基因型的判断带来很大不便。而微阵列技术存在成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围较窄，探针的合成与固定比较复杂等问题，因此这些检测方法都难以满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供ADH1B基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测ADH1B基因六种常见基因型A3170G、G3641T、G4564T、A5998G、G531A和T4973C的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下：
一种ADH1B基因突变检测液相芯片，包括有
（A）.针对ADH1B基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为：针对A3170G位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14，针对G3641T位点的SEQ IDNO.15及SEQ ID NO.16，针对G4564T位点的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18，针对A5998G位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20，针对G531A位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22，和/或针对T4973C位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.12；
（B）.有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.36，且所述anti-tag序列能相应地与（A）中所选的tag序列互补配对；
（C）.用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
在其中一个实施例中，所述扩增引物为：针对A3170G位点的SEQ ID NO.37及SEQ IDNO.38，针对G3641T位点的SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40，针对G4564T位点的SEQ IDNO.41及SEQ ID NO.42，针对A5998G位点的SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44，针对G531A位点的SEQ ID NO.45及SEQ ID NO.46，和/或针对T4973C位点的SEQ ID NO.47及SEQ IDNO.48。
在其中一个实施例中，所述ASPE引物为：针对A3170G位点的由SEQ ID NO.1和SEQID NO.13组成的序列及SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.14组成的序列，针对G3641T位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.16组成的序列，针对G4564T位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.17组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQID NO.18组成的序列，针对A5998G位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.19组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.20组成的序列，针对G531A位点的由SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.21组成的序列及由SEQ IDNO.10和SEQ IDNO.22组成的序列，和/或针对T4973C位点的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.23组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.24组成的序列。
本发明的另一目的是提供用于ADH1B基因突变检测的特异性引物。
实现上述目的技术方案如下。
用于ADH1B基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物为，针对A3170G位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14，针对G3641T位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16，针对G4564T位点的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18，针对A5998G位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20，针对G531A位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22，和/或针对T4973C位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的ADH1B基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的ADH1B基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3％；除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
3.本发明的检测方法步骤简单，6种突变位点检测可通过一步PCR即可完成6条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1ADH1B基因突变检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对ADH1B基因六种常见基因型A3170G、G3641T、G4564T、A5998G、G531A和T4973C的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1ADH1B基因的ASPE引物序列（tag序列+特异性引物序列）
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段（如上述表1所示）。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列。本发明tag序列在选取的时候，尽量避免各种tag序列、anti-tag序列、特异性引物序列之间的交叉反应，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag序列与不同ASPE引物序列可能形成的二级结构，同时，还能够满足检测***中的多种突变位点的引物和PCR产物并行检测的特异性要求，从而实现在同一个反应体系中并行检测多种突变类型，在整个并行检测体系中避免交叉反应，并使本发明液相芯片检测产品的特异性、灵敏度和重复性之间达到优化和平衡，准确区分各种型别的基因型。选择的12种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的12种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5－10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5－10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly（dT），寡聚四聚乙二醇以及（CH2）n间隔臂（n≥3），如（CH2）12、（CH2）18等。另外，如果存在poly（dA）干扰，还可以用poly（TTG）作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5－10个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球（购自Luminex公司）悬浮于50ul0.1mol/L的MES溶液中（pH4.5），加入10ul合成的anti-tag分子（100nmol/ml）。配制10ng/ml的EDC（N-（3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide）（购自Pierce Chemical公司）工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris（pH8.0）]，1mmol/L EDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对ADH1B基因六种常见基因型A3170G、G3641T、G4564T、A5998G、G531A和T4973C，设计扩增引物对（见表3），扩增出6条含有6个突变位点的目标序列。
表3扩增出具有突变位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用实施例1所述的ADH1B基因突变检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液（pH5.0）配方（250ml）：
2×Tm杂交缓冲液
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
设计6对引物，多重PCR一步扩增出6条分别含ADH1B基因六种常见基因型A3170G、G3641T、G4564T、A5998G、G531A和T4973C的目标序列，产物大小分别为397bp、349bp、306bp、323bp、227bp、248bp，引物序列（SEQ ID NO.37-48）见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.37-48的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
PCR扩增程序为：95℃ 3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 40s，30个循环；72℃ 10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应（ASPE）
利用实施例1中设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测基因相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
反应程序为：96℃ 2min；94℃ 30s，54℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的12种包被的微球（如实施例1所述），每种微球浓度均为2.5×105个/ml；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2－5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2－5min；
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值（MFI）和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI=样品MFI－PCR阴性对照MFI（NET MFI小于0的以0表示）；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷（突变型NET MFI+野生型NET MFI）
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值（cut-off值），以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的ADH1B基因SNP位点，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值（cut-off值）的设置如下：突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合子；30%-70%视为杂合子；80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的ADH1B基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的ADH1B基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出ADH1B的SNP类型，且结果稳定可靠。
表4样本检测结果（MFI）之一
表5样本检测结果（MFI）之二
表6样本ADH1B基因突变比值（%）
表7样本ADH1B基因突变类型分析结果
| 样本号 | 液相芯片检测结果 | 测序结果 |
| 1 | 野生型 | 野生型 |
| 2 | 野生型 | 野生型 |
| 3 | 野生型 | 野生型 |
| 4 | 531AA | 531AA |
| 5 | 野生型 | 野生型 |
| 6 | 野生型 | 野生型 |
| 7 | 野生型 | 野生型 |
| 8 | 3641GT | 3641GT |
| 9 | 野生型 | 野生型 |
| 10 | 4973TC | 4973TC |
| 11 | 野生型 | 野生型 |
| 12 | 野生型 | 野生型 |
| 13 | 野生型 | 野生型 |
| 14 | 野生型 | 野生型 |
| 15 | 5998GG | 5998GG |
| 16 | 野生型 | 野生型 |
| 17 | 3170GG | 3170GG |
| 18 | 野生型 | 野生型 |
| 19 | 野生型 | 野生型 |
| 20 | 野生型 | 野生型 |
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对ADH1B基因SNP位点的检测
一、液相芯片制备的设计（Tag序列及Anti-Tag序列的选择）
以ADH1B基因A3170G、G3641T、A5998G和T4973C位点突变检测液相芯片为例，分别针对A3170G、G3641T、A5998G和T4973C的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.36。具体设计如下表（表8）所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表8液相芯片制备的设计
一、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表9样本ADH1B基因A3170G检测结果与基因多态性分析
表10样本ADH1B基因G3641T检测结果与基因多态性分析
表11样本ADH1B基因A5998G检测结果与基因多态性分析
表12样本ADH1B基因T4973C检测结果与基因多态性分析
从本实施例可见，针对不同突变位点的液相芯片，ASPE引物运用表1中不同的tag序列，其结果依然稳定可靠。而ASPE引物选用实施例1所述液相芯片中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳（信噪比更好），参见本实施例试验组1、试验组5、试验组8和试验组12。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。实施例4ADH1B基因突变检测特异性引物序列的选择
一、液相芯片制备的设计（野生型和突变型特异性引物序列的选择）
以ADH1B基因G4564T和G531A的多态性位点检测液相芯片为例，以该突变位点所在目标序列的正向或反向互补序列为模板，分别针对G4564T和G531A的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，包括本发明实施例1中优选的特异性引物序列和2条备选的特异性引物序列，如表13所示。其中，框内碱基为多态性位点。
表13特异性引物序列
以ADH1B基因G4564T和G531A的多态性位点检测液相芯片为例，针对G4564T和G531A选用不同的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的tag序列则固定为实施例1中的最佳效果序列，并选用与之相对应的anti-tag序列，具体设计如下表（表14）所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表14液相芯片制备的设计之二
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：
表15样本ADH1B基因G4564T检测结果与基因多态性分析
表16样本ADH1B基因G531A检测结果与基因多态性分析
由本实施例可见，ASPE引物选用实施例1中特异性引物序列与tag序列搭配时，检测效果远好于其他的特异性引物序列（信噪比更好），参见本实施例试验组13和试验组16。其它来源于目标检测位点所在序列的正向或反向互补序列的不同特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，即依然是实施例2中所述的特异性引物序列与不同的tag序列搭配效果更佳，具体数据省略。
其它针对不同的SNP位点的多种特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，即实施例1所选择的特异性引物，具有更好的信噪比，检测效果也更好，具体数据省略。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种ADH1B基因突变检测液相芯片，其特征在于，包括有
（A）.针对ADH1B基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为：针对A3170G位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14，针对G3641T位点的SEQ IDNO.15及SEQ ID NO.16，针对G4564T位点的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18，针对A5998G位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20，针对G531A位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22，和/或针对T4973C位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.12；
（B）.有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.36，且所述anti-tag序列能相应地与（A）中所选的tag序列互补配对；
（C）.用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的ADH1B基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述扩增引物为：针对A3170G位点的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38，针对G3641T位点的SEQ ID NO.39及SEQID NO.40，针对G4564T位点的SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42，针对A5998G位点的SEQ IDNO.43及SEQ ID NO.44，针对G531A位点的SEQ ID NO.45及SEQ ID NO.46，和/或针对T4973C位点的SEQ ID NO.47及SEQ ID NO.48。
3.根据权利要求1或2所述的ADH1B基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述ASPE引物为：针对A3170G位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.13组成的序列及SEQ ID NO.2和SEQID NO.14组成的序列，针对G3641T位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.16组成的序列，针对G4564T位点的由SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.17组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.18组成的序列，针对A5998G位点的由SEQID NO.7和SEQ ID NO.19组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.20组成的序列，针对G531A位点的由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.21组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.22组成的序列，和/或针对T4973C位点的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.23组成的序列及由SEQID NO.12和SEQ ID NO.24组成的序列。
4.根据权利要求1或2所述的ADH1B基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述间隔臂为5-10个T。
5.用于ADH1B基因突变检测的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物为，针对A3170G位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14，针对G3641T位点的SEQ ID NO.15及SEQID NO.16，针对G4564T位点的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18，针对A5998G位点的SEQID NO.19及SEQ ID NO.20，针对G531A位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22，和/或针对T4973C位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24。
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|---|---|---|---|---|
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| WO2005047533A1 (en) * | 2003-11-17 | 2005-05-26 | Tm Bioscience Corporation | Method of detecting mutations associated with thrombosis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DUNBAR SA.: "Applications of Luminex xMAP technology for rapid, high-throughput multiplexed nucleic acid detection", 《CLIN CHIM ACTA》, vol. 363, no. 12, 31 January 2006 (2006-01-31), pages 71 - 82 * |
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