CN103570663A - 一种高纯度槲皮素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度槲皮素的制备方法，包括如下步骤：A）精制芦丁的步骤：按一定液料比将芦丁加至沸腾的溶剂中，所述芦丁溶解完全后，趁热抽滤，收集滤液，冷却析晶，过滤得到精制后的芦丁；B）水解芦丁的步骤：将硫酸与水混合得酸水混合物，加热至沸腾后按一定液料比加入所述精制后的芦丁，水解完全后，过滤，收集滤饼，水洗至中性，干燥，得到槲皮素粗品；C）精制槲皮素的步骤：按一定液料比将所述槲皮素粗品加至精制溶剂中洗涤，过滤，干燥，得到高纯度槲皮素。与现有技术相比，本发明提供的方法简单易行，能耗较低，提高了槲皮素的纯度，可实现高纯度的药用级槲皮素的制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种槲皮素的制备方法，尤其涉及一种高纯度槲皮素的制备方法，属于植物提取技术领域。
背景技术
槲皮素化学名称为3,3',4',5,7-五羟基黄酮，是植物界分布最广泛的黄酮类化合物，大约68％的植物中都含有槲皮素，多种食物均含此成分。依据饮食***均每天摄入10～100mg槲皮素。槲皮素具有广泛的生物学作用，如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降压、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗血小板聚集和清除自由基等。槲皮素的结构式如下所示：
工业上目前主要通过酶水解法、微波水解法、高压水解法和酸水解法等方法来水解芦丁获取得到槲皮素，应用最多的是酸水解法。但是现有的制备方法并不能获取得到高纯度的槲皮素，市售的槲皮素纯度一般低于98.0%，无法达到99.0%以上的高纯度。如酸水解法一般都要经过芦丁水解的步骤，芦丁水解后得到的槲皮素中的主要杂质为山奈酚和异鼠李素，该两个杂质在芦丁中是以糖苷的形式存在，并随着芦丁水解为槲皮素的同时被水解成苷元，一旦形成苷元后，该两个杂质（尤其是异鼠李素）很难通过精制的方法降低含量，因此槲皮素的纯度达到98.0%以后很难进一步提高，进一步提高槲皮素的纯度成为本行业的一个技术发展瓶颈，特别是对于药用级原料药而言，槲皮素纯度的进一步提升具有重要的产业化意义。目前我国药物注册申报对原料药的纯度要求一般不低于98.5%。因此，想要把槲皮素开发成药物应用于临床，制备高纯度的原料药是首要的条件。但现有技术制备获得的槲皮素在纯度上达不到药物生产制造要求。
发明内容
针对现有技术所存在的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高纯度槲皮素的制备方法，该方法简单易行，能耗低，环境污染小。
为实现上述的目的，本发明采用下述的技术方案：
本发明提供一种高纯度槲皮素的制备方法，包括如下步骤：
A）精制芦丁的步骤，包括：
按一定液料比将芦丁加至沸腾的溶剂中，所述芦丁溶解完全后，趁热抽滤，收集滤液，冷却析晶，过滤得到精制后的芦丁；
B）水解芦丁的步骤，包括：
将硫酸与水混合得酸水混合物，加热至沸腾后按一定液料比加入所述精制后的芦丁，水解完全后，过滤，收集滤饼，水洗至中性，干燥，得到槲皮素粗品；
C）精制槲皮素的步骤，包括：
按一定液料比将所述槲皮素粗品加至精制溶剂中洗涤，过滤，干燥，得到高纯度槲皮素。
优选地，所述精制芦丁的步骤中，所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、甲醇-水溶液或乙醇-水溶液中的一种。
其中较优地，所述精制芦丁的步骤中，所述溶剂为水。
优选地，所述精制槲皮素的步骤中，所述精制溶剂选自乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙醇、甲醇水溶液或乙醇水溶液中的一种。
其中较优地，所述精制槲皮素的步骤中，所述精制溶剂为乙醇。
更进一步，所述精制槲皮素的步骤中，槲皮素粗品与乙醇的料液比为1kg：10～20L。
优选地，所述精制芦丁的步骤中，所述芦丁与所述溶剂的料液比为1kg：50～250L。
其中较优地，所述精制芦丁的步骤中，所述芦丁与所述溶剂的料液比为1kg：180～200L。
优选地，所述水解芦丁的步骤中，所述精制后的芦丁与所述酸水混合物的料液比为1kg：15～50L。
其中较优地，所述水解芦丁的步骤中，所述精制后的芦丁与所述酸水混合物的料液比为1kg：25～50L。
本发明的突出优点是：本发明通过增加芦丁在特定溶剂中精制的前处理步骤，并使用特定的精制溶剂对槲皮素的粗品进行精制，可有效控制目标产物中的杂质（尤其是异鼠李素）含量，使槲皮素的纯度达到99.0%以上，从而满足药用级原料药对于样品纯度与含量的要求；而且本发明提供的方法简单，易控制，溶剂环保、易得，能大大降低生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供一种高纯度槲皮素的制备方法，包括如下步骤：A）精制芦丁的步骤，包括：按一定液料比将芦丁加至沸腾的溶剂中，所述芦丁溶解完全后，趁热抽滤，收集滤液，冷却析晶，过滤得到精制后的芦丁；B）水解芦丁的步骤，包括：将硫酸与水混合得酸水混合物，加热至沸腾后按一定液料比加入所述精制后的芦丁，水解完全后，过滤，收集滤饼，水洗至中性，干燥，得到槲皮素粗品；C）精制槲皮素的步骤，包括：按一定液料比将所述槲皮素粗品加至精制溶剂中洗涤，过滤，干燥，得到高纯度槲皮素。下面对本高纯度槲皮素的制备方法展开详细的说明：
本发明的实施例中，槲皮素粗品为水解后得到的产品；槲皮素成品为槲皮素粗品精制后的得到产品。
槲皮素的含量测定方法：
槲皮素的含量测定可采用高效液相色谱法（参照中国药典2010年版），具体方法如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷酸水溶液（53:47，v/v）为流动相；检测波长366nm，理论踏板数按槲皮素峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备：取槲皮素对照品，加色谱甲醇制成100μg/ml的溶液，即得。
供试品溶液的配置：取精制所得的槲皮素粉末，加色谱甲醇，制成100μg/ml的溶液，即得。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
槲皮素成品中有关物质测定方法：
槲皮素成品中有关物质的测定也可采用高效液相色谱法，具体方法如下：
供试品溶液配置：取槲皮素成品，加流动相溶解并稀释成0.5mg/ml的溶液，作为供试品溶液；
混合对照品溶液配置：
（1）山奈酚和异鼠李素对照品溶液配置：称取山奈酚和异鼠李素对照品各10mg，置100ml量瓶中，加色谱甲醇适量使溶解，用色谱甲醇稀释至刻度，摇匀，即得杂质山奈酚和异鼠李素对照品溶液。
（2）精密量取供试品溶液500μl，置100ml量瓶中，再加入精密量取的5ml山奈酚和异鼠李素对照品溶液置100ml量瓶中，用色谱甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
测定方法：精密量取供试品溶液和混合对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。槲皮素有关物质检测的流动相梯度洗脱时间如表1所示。
表1槲皮素有关物质检测的流动相梯度洗脱时间表
| 时间（分钟） | 甲醇（%） | 0.1%甲酸水溶液（%） |
| 0 | 10 | 90 |
| 15 | 40 | 60 |
| 30 | 90 | 10 |
| 40 | 90 | 10 |
实施例1高纯度槲皮素的制备
将20L水加热至沸腾后加入芦丁100g，并保持搅拌状态以溶解芦丁，待芦丁溶解完全后，趁热抽滤，室温放置过夜析晶，过滤，干燥，得到精制后的芦丁；将1%体积百分含量的硫酸水溶液加热至沸腾后加入精制后的芦丁，精制后的芦丁与硫酸水溶液的料液比为1kg：25L，水解完全后，过滤，收集滤饼，蒸馏水洗至中性，以pH试纸检测，达标后将样品置于烘箱中干燥，得到槲皮素粗品；往槲皮素粗品中按照1kg：15L的液料比加入乙醇，搅拌均匀，静置，过滤，干燥，得槲皮素成品，槲皮素成品的纯度为99.52%，山奈酚的含量为0.20%，异鼠李素的含量为0.13%，其中纯度以峰面积归一法进行计算。
实施例2高纯度槲皮素的制备
将18L水加热至沸腾后加入芦丁100g，并保持搅拌状态以溶解芦丁，待芦丁溶解完全后，趁热抽滤，室温放置过夜析晶，过滤，干燥，得到精制后的芦丁；将1%体积百分含量的硫酸水溶液加热至沸腾后加入精制后的芦丁，精制后的芦丁与硫酸水溶液的料液比为1kg：15L，水解完全后，过滤，收集滤饼，蒸馏水洗至中性，以pH试纸检测，达标后将样品置于烘箱中干燥，得到槲皮素粗品；往槲皮素粗品中按照1kg：10L的液料比加入甲醇，搅拌均匀，静置，过滤，干燥，得槲皮素成品，槲皮素成品的纯度为99.50%，山奈酚的含量为0.25%，异鼠李素的含量为0.16%，其中纯度以峰面积归一法进行计算。
实施例3高纯度槲皮素的制备
将25L水加热至沸腾后加入芦丁100g，并保持搅拌状态以溶解芦丁，待芦丁溶解完全后，趁热抽滤，室温放置过夜析晶，过滤，干燥，得到精制后的芦丁；将1%体积百分含量的硫酸水溶液加热至沸腾后加入精制后的芦丁，精制后的芦丁与硫酸水溶液的料液比为1kg：50L，水解完全后，过滤，收集滤饼，蒸馏水洗至中性，以pH试纸检测，达标后将样品置于烘箱中干燥，得到槲皮素粗品；往槲皮素粗品中按照1kg：20L的液料比加入乙醇，搅拌均匀，静置，过滤，干燥，得槲皮素成品，槲皮素成品的纯度为99.51%，山奈酚的含量为0.21%，异鼠李素的含量为0.14%，其中纯度以峰面积归一法进行计算。
实施例4芦丁质量对获得的槲皮素成品纯度的影响分析
分别采用精制后芦丁与未预先精制的芦丁进行对比实验，以考察对芦丁进行前处理的必要性。
采用精制后芦丁的工艺方法：将18L水加热至沸腾后加入芦丁100g，并保持搅拌状态以溶解芦丁，待芦丁溶解完全后，趁热抽滤，室温放置过夜析晶，过滤，干燥，得到精制后的芦丁；将1%体积百分含量的硫酸水溶液加热至沸腾后加入精制后的芦丁，精制后的芦丁与硫酸水溶液的料液比为1kg：25L，水解完全（约4-5h）后，过滤，收集滤饼，蒸馏水洗至中性，以pH试纸检测，达标后将样品置于烘箱中干燥，得到槲皮素粗品；往槲皮素粗品中按照1kg：15L的液料比加入乙醇，搅拌均匀，静置，过滤，干燥，得槲皮素成品。重复三次实验，所得的槲皮素纯度和成品质量和收率如表2所示，槲皮素有关物质含量如表3所示，其中纯度以峰面积归一法进行计算。
未预先精制芦丁的工艺方法：将1%体积百分含量的硫酸水溶液2.5L加热至沸腾后加入芦丁100g，水解完全得到水解产生的槲皮素，过滤，收集滤饼，蒸馏水洗至中性，以pH试纸检测，达标后将样品置于烘箱中干燥，得到槲皮素粗品；往槲皮素粗品中按照1kg：15L的液料比加入乙醇，搅拌均匀，过滤，干燥，得槲皮素成品。重复三次实验，所得的槲皮素纯度和成品质量收率如表2所示，槲皮素有关物质含量如表3所示，其中纯度以峰面积归一法进行计算。
表2采用精制后芦丁和未精制芦丁的制备工艺获得的槲皮素纯度和收率
表3采用精制后芦丁和未精制芦丁的制备工艺获得的槲皮素有关物质含量
从表2和表3可以看出，采用精制后的芦丁制备槲皮素，获得的槲皮素成品纯度以及对主要杂质的控制均明显优于未经精制的芦丁制备的槲皮素。
实施例5对比现有技术进行精制芦丁对提高槲皮素纯度的影响分析
现有的槲皮素制备工艺通常采用未精制的芦丁作为酸水解步骤的原料。通过采用现有技术的试验方案，分别考察精制后芦丁与未经精制芦丁对制备得到的槲皮素纯度及其有关物质的影响。
采用现有技术的工艺方法：将芦丁100g（1:12，g/ml）加入0.616mol/L的硫酸水溶液中，保持沸腾2～3h；过滤，过滤后得到的滤饼用温度为60-70℃水洗涤，洗至中性，以pH试纸检测，达标后，干燥，得到槲皮素粗品滤饼；往槲皮素粗品中加入甲醇溶液（1:20，g/ml），搅拌均匀，静置，过滤，滤饼再用10倍甲醇洗涤，最后用5倍纯水洗至无色无味，干燥，得槲皮素精品。重复三次实验，槲皮素纯度和收率结果及槲皮素的有关物质含量如表4、5所示。
在现有技术基础上加入精制芦丁步骤的工艺方法：将20L水加热至沸腾后加入芦丁100g，并保持搅拌状态以溶解芦丁，待芦丁完全溶解后，将芦丁溶液趁热抽滤至容器中，室温放置过夜析晶，过滤得到精制后的芦丁样品，干燥得到精制后的芦丁，备用；将精制后的芦丁（1:12，g/ml）加入0.616mol/L的硫酸水溶液中，保持沸腾2～3h，过滤，过滤后得到的滤饼用温度为60-70℃水洗涤，洗至中性，以pH试纸检测，达标后，干燥，得到槲皮素粗品滤饼；往槲皮素粗品中加入甲醇溶液（1:20，g/ml），搅拌均匀，静置，过滤，滤饼再用10倍甲醇洗涤，最后用5倍纯水洗至无色无味，干燥，得槲皮素精品。重复三次实验，结果如表4、5所示。
表4采用精制芦丁和未精制芦丁工艺用现有技术制备的槲皮素纯度和收率
表5采用精制后芦丁和未精制芦丁制备的槲皮素的有关物质含量
结果表明，槲皮素含量的提高是通过降低芦丁中山奈酚-3-芸香糖和异鼠李素-3-芸香糖两有关物质以及水解产生的槲皮素中山奈酚和异鼠李素而实现；而没有通过前期精制的芦丁得到的槲皮素均无法获得高纯度（>99.0%）的槲皮素。按照专利申请201110408133.9中实验例4的设计仅能获得纯度为98.5%的槲皮素，纯度根本无法达到报道的99.63%。
实施例6精制芦丁的溶剂对获得的精制后芦丁纯度的影响分析
分别用不同溶剂（甲醇、乙醇、体积比为1:1的甲醇水溶液、体积比为1:1的乙醇水溶液、水）加热至沸腾后加入芦丁，并保持搅拌状态以溶解芦丁。待芦丁溶解完全后，趁热抽滤，室温放置过夜以进行析晶。分别检测精制后芦丁的纯度以及主要杂质的纯度（采用HPLC峰面积归一法），不同的精制溶剂对精制后芦丁的纯度和有关物质的含量影响结果如表6所示。
表6不同的精制溶剂对精制后芦丁的纯度和有关物质的含量影响情况
| 精制溶剂 | 芦丁纯度 | 山奈酚-3-芸香糖和异鼠李素-3-芸香糖 |
| 甲醇 | 93.21% | 2.80% |
| 乙醇 | 93.83% | 2.72% |
| 甲醇/水=1/1 | 93.09% | 2.37% |
| 乙醇/水=1/1 | 93.14% | 2.45% |
| 水 | 95.47% | 1.49% |
| 无 | 93.26% | 2.75% |
从上表可以看出，根据精制后芦丁的纯度，结合精制溶剂的经济性与环保性，用水作为芦丁的精制溶剂效果最好。
实施例7槲皮素精制溶剂的选择分析
将20L水加热至沸腾后加入芦丁100g，并保持搅拌状态以溶解芦丁，待芦丁溶解完全后，趁热抽滤，室温放置过夜析晶，过滤得到精制后的芦丁，干燥，得到精制后的芦丁70g；将1%的硫酸水溶液1.75L加热至沸腾后加入精制后的芦丁，水解完全后，过滤，收集滤饼，蒸馏水洗至中性，以pH试纸检测，达标后将样品置于烘箱中干燥，得到槲皮素粗品36g；分别取用50mg槲皮素粗品，分别加入1.0ml不同的溶剂（乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙醇）于样品管中，超声30min，13000rpm离心3min，取上清100μl用甲醇稀释至1ml，用液相对样品进行纯度测定。不同的精制溶剂所得的槲皮素纯度及杂志含量如表7所示。样品的纯度用峰面积归一法进行计算。
表7槲皮素精制溶剂的选择
结果表明：使用乙醇处理得到的槲皮素成品纯度最优，且从工业化生产环保的角度出发，乙醇也是最优的选择。
实施例8槲皮素精制溶剂的用量分析
将20L水加热至沸腾后加入芦丁100g，并保持搅拌状态以溶解芦丁，待芦丁溶解完全后，趁热抽滤，室温放置过夜析晶，过滤得到精制后的芦丁，干燥，得到精制后的芦丁70g；将1%的硫酸水溶液1.75L加热至沸腾后加入得到的精制后的芦丁70g，水解完全后，过滤，收集滤饼，蒸馏水洗至中性，以pH试纸检测，达标后将样品置于烘箱中干燥，得到槲皮素粗品36g；分别取槲皮素粗品9g，分别按1:5、1:10、1:15和1:20（g/ml）的料液比例加入乙醇，搅拌均匀，静置，过滤，干燥，得槲皮素成品。不同的乙醇纯化槲皮素的料液比与收率和样品纯度实验结果如表8所示。样品的纯度用峰面积归一法进行计算，质量收率以槲皮素粗品计。精制前槲皮素样品纯度为98.21%，杂质的含量为山柰酚0.88%，异鼠李素0.63%。
表8乙醇纯化槲皮素的料液比与收率和样品纯度关系
结果表明，随着乙醇使用量的加大，槲皮素的质量收率逐渐降低，而纯度逐渐增加。使用15倍量的乙醇能获取到较高质量收率的槲皮素成品，纯度也可达到99.5%以上，当使用20倍的乙醇时，槲皮素成品的纯度略微提高到99.64%，但收率仅为45.1%，相对于15倍量下降较大，因此槲皮素精制溶剂的用量优选为料液比1:15。
按照本发明提供的制备方法制得的槲皮素成品，槲皮素含量大于99.0%，能够满足目前我国药物注册申报对原料药含量的要求；同时，槲皮素成品中山奈酚含量少于0.3%，异鼠李素含量少于0.2%，其他单个杂质峰面积之和小于0.1%，该杂质水平远远低于现有技术制备的槲皮素样成品的杂质水平；本发明提供的槲皮素成品中氯离子、硫酸盐均小于0.005%，重金属、砷盐、灼烧残渣检测分别小于10ppm、0.5ppm和0.01%，水分含量小于0.5%，乙醇含量小于0.5%，以上检测项目均满足药用级原料药的要求。
本发明提供的高纯度槲皮素的制备方法简单易行，能耗低，环境污染小，有效控制了有关物质的含量，制备的槲皮素成品纯度和含量均高于99.0%，应用前景广，可以满足原料药的相关要求。
上面对本发明所提供的高纯度槲皮素的制备方法进行了详细的说明。对本领域的一般技术人员而言，在不背离本发明实质精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，都将构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。
Claims (10)
1.一种高纯度槲皮素的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
A）精制芦丁的步骤，包括：
按一定液料比将芦丁加至沸腾的溶剂中，所述芦丁溶解完全后，趁热抽滤，收集滤液，冷却析晶，过滤得到精制后的芦丁；
B）水解芦丁的步骤，包括：
将硫酸与水混合得酸水混合物，加热至沸腾后按一定液料比加入所述精制后的芦丁，水解完全后，过滤，收集滤饼，水洗至中性，干燥，得到槲皮素粗品；
C）精制槲皮素的步骤，包括：
按一定液料比将所述槲皮素粗品加至精制溶剂中洗涤，过滤，干燥，得到高纯度槲皮素。
2.如权利要求1所述的高纯度槲皮素的制备方法，其特征在于，所述精制芦丁的步骤中，所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、甲醇-水溶液或乙醇-水溶液中的一种。
3.如权利要求2所述的高纯度槲皮素的制备方法，其特征在于，所述精制芦丁的步骤中，所述溶剂为水。
4.如权利要求1所述的高纯度槲皮素的制备方法，其特征在于，所述精制槲皮素的步骤中，所述精制溶剂选自乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙醇、甲醇水溶液或乙醇水溶液中的一种。
5.如权利要求4所述的高纯度槲皮素的制备方法，其特征在于，所述精制槲皮素的步骤中，所述精制溶剂为乙醇。
6.如权利要求5所述的高纯度槲皮素的制备方法，其特征在于，所述精制槲皮素的步骤中，槲皮素粗品与乙醇的料液比为1kg：10~20L 。
7.如权利要求1所述的高纯度槲皮素的制备方法，其特征在于，所述精制芦丁的步骤中，所述芦丁与所述溶剂的料液比为1kg：50~250L。
8.如权利要求7所述的高纯度槲皮素的制备方法，其特征在于，所述精制芦丁的步骤中，所述芦丁与所述溶剂的料液比为1kg：180~200L。
9.如权利要求1所述的高纯度槲皮素的制备方法，其特征在于，所述水解芦丁的步骤中，所述精制后的芦丁与所述酸水混合物的料液比为1kg：15~50L。
10.如权利要求9所述的高纯度槲皮素的制备方法，其特征在于，所述水解芦丁的步骤中，所述精制后的芦丁与所述酸水混合物的料液比为1kg：25~50L。
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