CN103565970B - 一种治疗艾滋病的地榆提取物及其制备方法 - Google Patents
一种治疗艾滋病的地榆提取物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种治疗艾滋病的地榆提取物及其制备方法，所述地榆提取物主要含有没食子酸、鞣花酸、可水解鞣质、缩合鞣质。本发明提取物对R5嗜性和X4嗜性的艾滋病毒具有极佳的抑制活性及极低的细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及一种地榆提取物及其制备方法，具体涉及一种治疗艾滋病的地榆提取物及其制备方法。
背景技术
地榆为蔷薇科植物地榆SanguisorbaofficinalisL.或长叶地榆SanguisorbaofficinalisL.var.longifolia(Bert.)YüetLi的干燥根，其性微寒、苦、涩、酸，归肝、胃、大肠经，有凉血止血、解毒敛疮之功效。
地榆的化学成分研究主要集中在鞣质类、三萜及三萜皂苷类、黄酮及甾体类化合物，其中以鞣质和三萜及三萜皂苷类含量最高。鞣质被认为是其发挥收敛止血作用的物质基础。
鞣质(Tannins)又称单宁，是存在于植物体内的一类结构较复杂的多酚类化合物。KFrendenberg于1920年按照鞣质的化学结构特征将其分为可水解鞣质(hydrolysabletannin)和缩合鞣质(condensedtannin)两大类。可水解鞣质，即没食子酸酯类多酚，是多元醇与没食子酸或与没食子酸有生源关系的酚酸所形成的酯，其分子内具有酯键或苷键，在稀酸、稀碱或酶的作用下易水解，产生多元醇和小分子类酚酸，根据其水解产物的不同，分为没食子鞣质(gallotannin)和鞣花鞣质(ellagitannin)两大类。缩合鞣质，即聚黄烷醇类多酚，是由儿茶素或没食子酸儿茶素等黄烷-3-醇类化合物以碳-碳键聚合而形成的化合物，不被酸所水解，通常三聚体以上才具有鞣质的性质。
艾滋病自1981年被首次发现以来一直以惊人的速度在全球蔓延，至今人类仍然没有找到治愈艾滋病的有效方法。当前，对艾滋病的研究主要集中在预防HIV-1感染疫苗的开发和对艾滋病患者病情的控制。AIDS是由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起。通常认为HIV作用的主要靶细胞为淋巴细胞和单核巨噬细胞，经吸附、融合过程后进入宿主细胞。在1996年证实，趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV-1进入的共受体。由此，以趋化因子受体为靶点的抗HIV药物成为研究的新热点。
发明内容
本发明的一个目的在于提供地榆在制备抗艾滋病毒药物中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种治疗艾滋病的地榆提取物；
本发明的另一个目的在于提供所述地榆提取物的制备方法；
本发明的另一个目的在于提供所述地榆提取物在制备抗艾滋病毒药物中的应用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种治疗艾滋病的地榆提取物，由地榆经溶剂提取得到，其特征在于，提取物中主要含有：没食子酸、鞣花酸、可水解鞣质、缩合鞣质。
一种治疗艾滋病的地榆提取物，由地榆经溶剂提取得到，其特征在于，提取物中主要含有：没食子酸0-15%、鞣花酸0-8%、可水解鞣质2-20%、缩合鞣质1-70%，百分比是指重量百分比。
优选的，所述地榆提取物中，主要含有没食子酸4-10%、鞣花酸2-6%、可水解鞣质4-15%、缩合鞣质30-70%。
进一步优选的，所述地榆提取物中，主要含有没食子酸6-8%、鞣花酸3-5%、可水解鞣质4-12%、缩合鞣质45-65%。
优选的，所述地榆提取物中，主要含有没食子酸0.1-2%、鞣花酸0.1-1.5%、可水解鞣质4-6%、缩合鞣质1-20%。
所述溶剂包括水或有机溶剂，有机溶剂选自：①芳香烃类：苯、甲苯、二甲苯等；②脂肪烃类：戊烷、己烷、辛烷等；③脂环烃类：环己烷、环己酮、甲苯环己酮等；④卤化烃类：氯苯、二氯苯、二氯甲烷等；⑤醇类：甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇等；⑥醚类：***、环氧丙烷等；⑦酯类：醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯等；⑧酮类：丙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮等;⑨二醇衍生物:乙二醇单甲醚、乙二醇单***、乙二醇单丁醚等；⑩其他：乙腈、吡啶、苯酚等。
所述地榆提取物选自由地榆经相应溶剂提取得到的如下提取物：地榆水提取物、地榆乙醇提取物、地榆水提取物或乙醇提取物经乙酸乙酯萃取得到的乙酸乙酯萃取物、地榆水提取物或乙醇提取物经正丁醇萃取得到的正丁醇萃取物、地榆水提取物或乙醇提取物经乙酸乙酯、正丁醇依次萃取得到的乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物、和/或地榆水提取物或乙醇提取物经乙酸乙酯或正丁醇萃取后的水层留余物；
所述地榆提取物进一步优选为地榆乙醇提取物经乙酸乙酯萃取得到的乙酸乙酯萃取物、地榆乙醇提取物经正丁醇萃取得到的正丁醇萃取物或地榆乙醇提取物经乙酸乙酯、正丁醇依次萃取得到的乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。
本发明所述地榆提取物由如下方法制备：
地榆药材用水或乙醇提取，提取物进一步经乙酸乙酯、正丁醇依次萃取或分别萃取即得乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水层留余物。
本发明所述地榆提取物优选由如下方法制备：
取地榆药材，用水或30-80%乙醇提取，提取液浓缩后即得水提取物或乙醇提取物；水提取物或乙醇提取物进一步经乙酸乙酯、正丁醇依次萃取或分别萃取即得乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水层留余物；
所述乙醇提取方法为浸渍、回流或超声提取；
所述的水提取方法为：浸渍或煎煮；
所述提取溶剂用量为8-10体积倍，提取次数为1-3次；
所述浓缩优选减压浓缩；
所述萃取次数优选为3-5次；
所述乙醇的浓度优选50-80%；
本发明所述地榆提取物可按照常规工艺加入常规辅料制成茶剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释制剂、控释制剂、口服液、滴丸或纳米制剂，也可与其他相关药物配伍使用。
本发明所述地榆或其提取物在制备抗艾滋病毒药物中的应用。
优选的，所述艾滋病毒为R5嗜性或X4嗜性艾滋病毒。
为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。
本发明所述可水解鞣质含量以水解后没食子酸和鞣花酸含量（不包含游离的没食子酸和鞣花酸）之和计算。
本发明提取物对R5嗜性和X4嗜性的艾滋病毒具有极佳的抑制活性及极低的细胞毒性。
附图说明
图1地榆水提取物对艾滋病毒ADA和HXB2以及水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
图2地榆水层留余物对艾滋病毒ADA和HXB2以及水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
图3地榆乙酸乙酯萃取物Ⅰ对艾滋病毒ADA和HXB2以及水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
图4地榆正丁醇萃取物Ⅱ对艾滋病毒ADA和HXB2以及水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
具体实施方式
实施例1
地榆药材粗粉100g，用10倍水（V/W）煎煮提取2次，每次1小时，合并两次提取液，减压浓缩至干，得地榆水提物13.7g。
实施例2
地榆药材粗粉1000g，用10倍量（V/W）的60%乙醇超声提取2次，每次1小时，合并两次提取液，减压浓缩至无醇味后，分别先后用乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得到3个极性不同的萃取物：乙酸乙酯萃取物-Ⅰ（ETOAC-I）10.2g、正丁醇萃取物-I（BUOH-I）18.4g及水层留余物（DW）59.3g。
实施例3
地榆药材粗粉100g，用10倍量（V/W）的60%乙醇回流提取2次，每次1小时，合并两次提取液，减压浓缩至无醇味，得60%醇提物12.5g；醇提物经乙酸乙酯萃取5次，合并萃取物，减压回收至干，即得地榆乙酸乙酯萃取物-II（ETOAC-II）。
实施例4
地榆药材粗粉100g，用10倍量水（V/W）煎煮3次，每次1.5小时，合并两次提取液，减压浓缩至干，得地榆水提物；水提物经正丁醇萃取5次，合并萃取物，减压回收至干，即得地榆正丁醇萃取物-II（BUOH-II）。
实施例5地榆提取物鞣质类成分含量测定
1地榆提取物中没食子酸、鞣花酸和可水解鞣质的含量测定
1.1实验材料与试剂
水提物：由实施例1制备；
乙酸乙酯萃取物-I、正丁醇萃取物-I和水层留余物：由实施例2制备；
乙酸乙酯萃取物-II：由实施例3制备；
正丁醇萃取物-II：由实施例4制备；
鞣花酸（美国Sigma公司，纯度>98%）；
没食子酸（美国Sigma公司，纯度>98%）
1.2实验方法
1.2.1对照品溶液的制备
精密称取鞣花酸对照品5.22mg置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤后，为鞣花酸对照品储备液（208.8μg/mL）。精密量取该对照品储备液适量，用甲醇稀释，配制成浓度分别为5.22、10.44、20.88、41.76、62.64、83.52、125.28μg/mL的鞣花酸对照品系列溶液。
精密称取没食子酸对照品5.00mg置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤后，为没食子酸对照品储备液（200μg/mL）。精密量取该对照品储备液适量，用甲醇稀释，配制成浓度为分别为5、10、20、30、40、50、60、80μg/mL的没食子酸对照品系列溶液。
1.2.2供试品溶液的制备
水解前样品的制备：称取地榆水提物5mg、乙酸乙酯萃取物Ⅰ和Ⅱ各2mg、正丁醇萃取物Ⅰ和Ⅱ各3mg、水层留余物5mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
水解后样品的制备：称取地榆水提物5mg、乙酸乙酯萃取物Ⅰ和Ⅱ各2mg、正丁醇萃取物Ⅰ和Ⅱ各3mg、水层留余物5mg，置于5mL棕色小瓶，加入0.5mL2.0mol/L盐酸溶液，密封，95℃下酸解8h，结束酸解后，冷却至室温，加入甲醇超声30min，转移至5mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
1.2.3HPLC分析色谱条件以及样品的测定
色谱柱：UltimateAQ-C18色谱柱（5μm,4.6*250mm，美国Welch公司）。
流动相：以乙腈和0.2%甲酸-水为流动相，乙腈浓度0min(5%)-10min(15%)-25min(25%)-35min(30%)-45min(90%)；流速1mL/min；进样量20μL；检测波长254nm。
将上述制备的对照品与供试品溶液，分别按照上述HPLC色谱分析条件进行分析。以外标标准曲线法计算各供试品溶液酸解前后没食子酸和鞣花酸含量。可水解鞣质含量=（水解后没食子酸含量+水解后鞣花酸含量）-（水解前没食子酸含量+水解前鞣花酸含量）。即可水解鞣质以水解前后的没食子酸和鞣花酸之和计。
1.3实验结果
各样品含量测定结果见表1。
表1地榆提取物中可水解鞣质含量
2地榆提取物中缩合鞣质的含量测定
2.1实验材料与试剂
水提物：由实施例1制备；
乙酸乙酯萃取物-I、正丁醇萃取物-I和水层留余物：由实施例2制备；
乙酸乙酯萃取物-II：由实施例3制备；
正丁醇萃取物-II：由实施例4制备；
儿茶素（美国Sigma公司，纯度>98%）；香草醛、浓硫酸、甲醇均为市售国产分析纯试剂。
2.2实验方法
2.2.1对照品溶液的制备
精密称取儿茶素对照品52.59mg置于50mL容量瓶中，用甲醇溶剂并稀释至刻度，摇匀，即为对照品贮备液（1.0518mg/mL）。精密量取该对照品贮备液适量，用甲醇稀释，配制成浓度分别为0.0526、0.1052、0.2104、0.3155、0.4207、0.5259mg/mL的儿茶素系列对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备
称取地榆水提物5mg、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物样品各2mg，水层留余物50mg，置于5mL容量瓶中，加入甲醇，超声溶解后，用甲醇稀释至刻度，摇匀，为供试品溶液。
2.2.3样品的测定方法
分别量取上述对照品溶液或供试品溶液0.5mL，加入包有锡箔的试管中，分别加入2.5mL3%香草醛甲醇溶液和2.5mL30%浓硫酸甲醇溶液，摇匀，避光显色20min后，在500nm处测定吸光度A500。以外标标准曲线法计算各供试品缩合鞣质含量。
2.3实验结果
结果见表2。
表2地榆提取物中缩合鞣质含量
| 样品 | 缩合鞣质含量（mg/g） |
| 水提物 | 181.72±1.41 |
| 乙酸乙酯萃取物-I | 594.52±16.76 |
| 正丁醇萃取物-I | 476.27±13.33 |
| 水层留余物 | 14.41±0.29 |
| 乙酸乙酯萃取物-II | 607.81±12.33 |
| 正丁醇萃取物-II | 541.28±15.92 |
实施例6地榆提取物对艾滋病毒抑制作用的研究
1实验材料与试剂
1.1细胞系：293T,GHOST(3)-CCR5和GHOST(3)-CXCR4细胞由美国NIH提供（AIDSResearchandReferenceReagentProgram）。
1.2质粒：PNL4-3R-E-Luc+美国NIH提供;HIV包膜基因表达质粒ADA、HXB2和水疱性口炎病毒包膜基因表达质粒由美国NIH提供。
1.3DNA转染试剂盒、Dulbecco’sModifiedEagleMedium(DMEM)细胞培养液、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素、G418、puromycin和hygromycinB均购买于美国Invitrogen公司。细胞裂解液、细胞活性检测试剂盒和荧光素酶试剂盒购自美国promega公司。细胞培养板和白板均购自美国BD公司。
1.4实验药物：水提物（由实施例1制备）；乙酸乙酯萃取物-I、正丁醇萃取物-I和水层留余物（由实施例2制备）；乙酸乙酯萃取物-II（由实施例3制备）；正丁醇萃取物-II（由实施例4制备）。
鞣花酸（美国Sigma公司，纯度>98%）；没食子酸（美国Sigma公司，纯度>98%）
1.5仪器：酶联免疫检测仪
2实验方法
2.1细胞培养
293T细胞、GHOST(3)-CCR5和GHOST(3)-CXCR4细胞均用常规贴壁细胞培养方法培养。用于培养293T细胞的培养基成分包括10%灭活胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。用于培养GHOST(3)-CCR5和GHOST(3)-CXCR4细胞的培养基成分包括10%灭活胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、500μg/mlG418，1μg/mlpuromycin,和100μg/mlhygromycinB；培养条件为37℃，5%CO2，2～3d换液1次。
2.2病毒制备
2.2.1R5嗜性HIV假病毒的制备：R5嗜性HIV病毒包膜蛋白的表达质粒（ADA）和带有萤光素酶报告基因的HIV-1基因（pNL4-3-Luc.R-E-）共转染至293T细胞后（方法参见转染试剂盒说明书）,48小时后收集上清液获得ADA病毒。
2.2.2X4嗜性HIV假病毒的制备：将表达X4嗜性病毒包膜蛋白的质粒（HXB2）与带有萤光素酶报告基因的HIV-1基因（pNL4-3-Luc.R-E-）共转染至293T细胞后（方法参见转染试剂盒说明书）,48小时后收集上清液获得HXB2病毒。
2.2.3水疱性口炎病毒假病毒的制备：将表达水疱性口炎病毒假病毒包膜蛋白的质粒（VSV）与带有萤光素酶报告基因的HIV-1基因（pNL4-3-Luc.R-E-）共转染至293T细胞（方法参见转染试剂盒说明书）,48小时后收集上清液获得水疱性口炎病毒假病毒。
2.3HIV抑制活性的测定
分别取处于对数生长期的GHOST(3)-CCR5或者GHOST(3)-CXCR4细胞接种于96孔板，每孔100μL，细胞密度为8×103/孔，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。24小时后，将HIV病毒与系列稀释的药物混合物加入细胞进行感染。R5嗜性HIV假病毒ADA的感染用GHOST(3)-CCR5细胞。X4嗜性HIV假病毒HXB2的感染用GHOST(3)-CXCR4细胞。水疱性口炎病毒假病毒VSV的感染用GHOST(3)-CCR5或者GHOST(3)-CXCR4细胞。3组阴性对照组中分别加入R5嗜性HIV假病毒ADA、X4嗜性HIV假病毒HXB2和水疱性口炎病毒假病毒VSV与药物溶剂DMSO的混合物。然后将培养板置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。48小时后，移去培养液。小心加入50ul细胞裂解液，室温裂解细胞30分钟后，吸取40ul细胞裂解液转移至96孔白板。最后加入100ul萤光素酶底物，用酶联免疫检测仪检测化学发光值。按如下公式求出病毒抑制率：
抑制率(%)＝[(病毒组化学发光值－药物组化学发光值)/(病毒组化学发光值－细胞组化学发光值)]×100%
注：病毒组为细胞中加入病毒而不加药物的实验组；药物组为细胞中加入病毒和系列稀释药物混合物的实验组；细胞组为没有加入病毒和药物的实验组。
3实验结果
实验结果见表3-10。对水提物、水层留余物、乙酸乙酯萃取物Ⅰ、正丁醇萃取物Ⅰ，以提取物浓度（μg/ml）为横坐标、对病毒的抑制率为纵坐标作图，见图1-4。
表3水提物对艾滋病毒ADA、HXB2和水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
| 50.000 | 25.000 | 12.500 | 6.250 | 3.125 | 1.560 | 0.780 | 0.390 | 0.195 | 0.098 | |
| ADA | 96% | 87% | 82% | 64% | 49% | 39% | 13% | 22% | 25% | 15% |
| HXB2 | 100% | 99% | 94% | 77% | 41% | 16% | 8% | 27% | 11% | 0% |
| VSV | 32% | 21% | 38% | 29% | 22% | 13% | 24% | 23% | 18% | 2% |
表4水层留余物对艾滋病毒ADA、HXB2和水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
| 50.000 | 25.000 | 12.500 | 6.250 | 3.125 | 1.560 | 0.780 | 0.390 | 0.195 | 0.098 | |
| ADA | 85% | 75% | 61% | 59% | 42% | 29% | 21% | 0% | 0% | 3% |
| HXB2 | 99% | 96% | 86% | 64% | 41% | 23% | 5% | 4% | 22% | 5% |
| VSV | 29% | 20% | 21% | 34% | 36% | 11% | 13% | 17% | 9% | 4% |
表5乙酸乙酯萃取物-I对艾滋病毒ADA、HXB2和水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
| 12.5 | 6.25 | 3.125 | 1.56 | 0.78 | 0.39 | 0.195 | 0.098 | |
| ADA | 92% | 83% | 67% | 52% | 24% | 22% | 28% | 15% |
| HXB2 | 97% | 77% | 46% | 31% | 30% | 12% | 31% | 13% |
| VSV | 32% | 46% | 42% | 15% | 15% | 12% | 8% | 6% |
表6正丁醇萃取物-I对艾滋病毒ADA、HXB2和水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
| 12.5 | 6.25 | 3.125 | 1.56 | 0.78 | 0.39 | 0.195 | 0.098 | |
| ADA | 93% | 83% | 70% | 58% | 21% | 23% | 17% | 7% |
| HXB2 | 99% | 87% | 52% | 39% | 21% | 22% | 7% | 0% |
| VSV | 33% | 32% | 24% | 9% | 13% | 15% | 11% | 5% |
表7没食子酸对艾滋病毒ADA、HXB2和水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
| 12.5 | 6.25 | 3.125 | 1.56 | 0.78 | 0.39 | 0.195 | 0.0975 | |
| ADA | 98% | 97% | 92% | 80% | 60% | 37% | 41% | 26% |
| HXB2 | 100% | 99% | 96% | 55% | 13% | 1% | 3% | 0% |
| VSV | 22% | 18% | 12% | 5% | 1% | 0% | 9% | 3% |
表8鞣花酸对艾滋病毒ADA、HXB2和水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
| 12.5 | 6.25 | 3.125 | 1.56 | 0.78 | 0.39 | 0.195 | 0.0975 | |
| ADA | 50% | 39% | 23% | 11% | 18% | 25% | 10% | 32% |
| HXB2 | 45% | 34% | 34% | 12% | 5% | 1% | 0% | 9% |
| VSV | 22% | 41% | 28% | 15% | 11% | 22% | 14% | 0% |
表9乙酸乙酯萃取物-II对艾滋病毒ADA、HXB2和水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
| 12.5 | 6.25 | 3.125 | 1.56 | 0.78 | 0.39 | 0.195 | 0.098 | |
| ADA | 94% | 85% | 68% | 53% | 21% | 20% | 25% | 13% |
| HXB2 | 98% | 79% | 45% | 29% | 28% | 15% | 29% | 11% |
| VSV | 31% | 46% | 40% | 13% | 11% | 10% | 9% | 5% |
表10正丁醇萃取物-II对艾滋病毒ADA、HXB2和水疱性口炎病毒假病毒VSV的抑制作用
| 12.5 | 6.25 | 3.125 | 1.56 | 0.78 | 0.39 | 0.195 | 0.098 | |
| ADA | 95% | 85% | 71% | 57% | 23% | 22% | 15% | 8% |
| HXB2 | 97% | 89% | 55% | 40% | 22% | 21% | 9% | 0% |
| VSV | 31% | 30% | 21% | 8% | 11% | 14% | 12% | 4% |
结果表明：①地榆水提物、乙酸乙酯萃取物-I、乙酸乙酯萃取物Ⅱ、正丁醇萃取物-I、正丁醇萃取物Ⅱ及水层留余物对R5嗜性和X4嗜性的艾滋病毒ADA和HXB2均有抑制作用。上述提取物对R5嗜性和X4嗜性艾滋病毒的抑制活性，随着其浓度的升高而不断增强，其中组分乙酸乙酯萃取物Ⅰ、Ⅱ和正丁醇萃取物Ⅰ、Ⅱ对病毒的抑制活性较强，IC50小于3.13μg/ml。水提物和水层留余物的IC50在3.13μg/ml到6.25μg/ml之间。②没食子酸对R5嗜性和X4嗜性的艾滋病毒均有抑制活性，随着其浓度的升高，对病毒的抑制活性不断升高，IC50约为0.78μg/ml；鞣花酸没有明显抗病毒活性。
因为游离没食子酸在以上四种提取物/萃取物中含量很低，当各提取物/萃取物达到病毒抑制率为50%时，即使水解后其没食子酸的浓度也均小于其半数抑制浓度0.78μg/ml，不显示抗艾滋病毒的活性(详见表11）。由此可以确定以上四种提取物/萃取物的抗艾滋病毒活性并非单纯来源于游离没食子酸，其中还含有未知的抗艾滋病毒活性成分如没食子鞣质或缩合鞣质。
表11各提取物/萃取物达到IC50时没食子酸浓度
实施例7药物的细胞毒性实验
1实验材料与试剂
1.1细胞系：GHOST(3)-CCR5细胞由美国NIH提供（AIDSResearchandReferenceReagentProgram）。
1.2Dulbecco’sModifiedEagleMedium(DMEM)细胞培养液、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素、G418、puromycin和hygromycinB均购买于美国Invitrogen公司。细胞裂解液、细胞活性检测试剂盒和荧光素酶试剂盒购自美国promega公司。细胞培养板和白板军购自美国BD公司。
1.3仪器：酶联免疫检测仪
2实验方法：
2.1细胞培养
GHOST(3)-CCR5细胞用常规贴壁细胞培养方法培养。培养基成分包括10%灭活胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、500μg/mlG418，1μg/mlpuromycin,和100μg/mlhygromycinB；培养条件为37℃，5%CO2，2～3d换液1次。
2.2药物的细胞毒性实验
取处于对数生长期的GHOST(3)-CCR5细胞接种于96孔板，每孔100μL，细胞密度为8×103/孔，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。24小时后，将系列稀释的药物加入细胞，然后将培养板置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。48小时后，移去培养液。小心加入50μl细胞裂解液，室温裂解细胞30分钟后，加入100μl细胞活力检测底物。室温孵育10分钟后，用酶联免疫检测仪检测化学发光值。按如下公式求出细胞存活率：
存活率(%)＝[(药物组化学发光值)/(细胞组化学发光值)]×100%
药物组为细胞中加入系列稀释药物的实验组；细胞组为细胞中没有加入药物的实验组。
3实验结果
结果见表12-19。
表12水提物的细胞毒性作用
| 50μg/ml | 25μg/ml | 12.5μg/ml | |
| 细胞存活率 | 101% | 122% | 100% |
表13水层留余物的细胞毒性作用
| 50μg/ml | 25μg/ml | 12.5μg/ml | |
| 细胞存活率 | 97% | 105% | 108% |
表14乙酸乙酯-I萃取物的细胞毒性作用
| 50μg/ml | 25μg/ml | 12.5μg/ml | 6.25μg/ml | |
| 细胞存活率 | 50% | 65% | 84% | 116% |
表15正丁醇萃取物-I的细胞毒性作用。
| 50μg/ml | 25μg/ml | 12.5μg/ml | 6.25μg/ml | |
| 细胞存活率 | 47% | 56% | 91% | 108% |
表16鞣花酸的细胞毒性作用
| 50μg/ml | 25μg/ml | 12.5μg/ml | |
| 细胞存活率 | 17% | 23% | 108% |
表17没食子酸的细胞毒性作用
| 50μg/ml | 25μg/ml | 12.5μg/ml | 6.25μg/ml | |
| 细胞存活率 | 13% | 16% | 109% | 107% |
表18乙酸乙酯萃取物-II的细胞毒性作用
| 50μg/ml | 25μg/ml | 12.5μg/ml | 6.25μg/ml | |
| 细胞存活率 | 53% | 67% | 87% | 115% |
表19正丁醇萃取物-II的细胞毒性作用
| 50μg/ml | 25μg/ml | 12.5μg/ml | 6.25μg/ml | |
| 细胞存活率 | 43% | 53% | 88% | 107% |
结果表明，地榆水提物、乙酸乙酯萃取物（包括乙酸乙酯萃取物Ⅰ和Ⅱ）、正丁醇萃取物（包括正丁醇萃取物Ⅰ和Ⅱ）、水层留馀物在相同剂量下的细胞毒性明细低于鞣花酸以及没食子酸。
实施例8地榆提取物（采用实施例5类似的方法测定地榆提取物中各成分的含量）
主要成分为：没食子酸7.9%、鞣花酸5.5%、可水解鞣质15.5%、缩合鞣质65%。
制备方法：地榆药材，用10倍70%乙醇（V/W）回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，即得地榆乙醇提取物。
实施例9地榆提取物（采用实施例5类似的方法测定地榆提取物中各成分的含量）
地榆药材，用8倍量水（V/W）回流提取2次，每次1.5小时，合并两次提取液，减压浓缩至干，得地榆水提物；水提物分别先后用乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得到3个极性不同的萃取物：乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水层留余物。
其中，所得乙酸乙酯萃取物主要成分为：没食子酸6.5%、鞣花酸3.7%、可水解鞣质13.5%、缩合鞣质58.3%；
正丁醇萃取物主要成分为：没食子酸5.2%、鞣花酸2.7%、可水解鞣质6%、缩合鞣质46.1%；
水层留余物主要成分为：没食子酸0.4%、鞣花酸0.3%、可水解鞣质5.1%、缩合鞣质2.5%。
实施例10地榆提取物
地榆药材，用10倍量水（V/W）煎煮2次，每次1小时，合并两次提取液，减压浓缩至干，得地榆水提物；水提物经乙酸乙酯萃取5次，合并萃取物，减压回收至干，即得地榆乙酸乙酯萃取物。采用实施例5类似的方法测定地榆提取物中各成分的含量，没食子酸6.2%、鞣花酸4.0%、可水解鞣质10.2%、缩合鞣质51.2%
实施例11地榆提取物
地榆药材，用8倍量50%乙醇（V/W）超声提取3次，第一次1h，第二、三次每次0.5小时，合并两次提取液，减压浓缩至无醇味，得地榆乙醇提取物；乙醇提取物经正丁醇萃取4次，合并萃取物，减压回收至干，即得地榆正丁醇萃取物。采用实施例5类似的方法测定地榆提取物中各成分的含量：主要成分为：乙酸乙酯萃取物中，主要含没食子酸6.7%、鞣花酸4.6%、可水解鞣质8.3%、缩合鞣质62.5%。
Claims (8)
1.地榆单味药在制备抗艾滋病毒药物中的应用。
2.一种治疗艾滋病的地榆提取物，由地榆经溶剂提取得到，其特征在于所述地榆提取物中，主要含有：没食子酸4-10％、鞣花酸2-6％、可水解鞣质4-15％、缩合鞣质30-70％。
3.一种治疗艾滋病的地榆提取物，由地榆经溶剂提取得到，其特征在于所述地榆提取物中，主要含有：没食子酸0.1-2％、鞣花酸0.1-1.5％、可水解鞣质4-6％、缩合鞣质1-20％。
4.如权利要求2-3任一项所述的地榆提取物，其特征在于所述地榆提取物选自地榆水提取物、地榆乙醇提取物、地榆水提取物或乙醇提取物经乙酸乙酯萃取得到的乙酸乙酯萃取物、地榆水提取物或乙醇提取物经正丁醇萃取得到的正丁醇萃取物、地榆水提取物或乙醇提取物经乙酸乙酯、正丁醇依次萃取得到的乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物、和/或地榆水提取物或乙醇提取物经乙酸乙酯或正丁醇萃取后的水层留余物。
5.如权利要求4所述的地榆提取物，其特征在于所述地榆提取物选自地榆乙醇提取物经乙酸乙酯萃取得到的乙酸乙酯萃取物或地榆乙醇提取物经正丁醇萃取得到的正丁醇萃取物或地榆乙醇提取物经乙酸乙酯、正丁醇依次萃取得到的乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。
6.如权利要求2-3任一项所述地榆提取物的制备方法，其特征在于所述地榆提取物由如下方法制备：
取地榆药材，用水或30-80％乙醇按常规方法提取，提取液减压浓缩后所得提取物进一步经乙酸乙酯或正丁醇萃取，或依次经乙酸乙酯、正丁醇萃取，制得萃取物，所述萃取物即为地榆提取物。
7.如权利要求2-3任一项所述地榆提取物作为唯一活性成分在制备抗艾滋病毒药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述艾滋病毒为R5嗜性或X4嗜性艾滋病毒。
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