CN103564197B - 一种复合植物提取物饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及饲料技术领域，具体涉及一种复合植物提取物饲料添加剂及其制备方法。本发明的目的是提供一种具有强效抑菌效果的复合植物提取物饲料添加剂，解决了抗生素等其他合成药物添加到饲料中存在毒副作用等诸多弊端，取得了良好的效果。本发明的技术方案为提供一种复合植物提取物饲料添加剂，包括柑橘精油、大蒜素、柑橘黄酮、松针粉、松花精油。本发明有益效果：本发明复合植物提取物饲料添加剂借鉴传统中草药理论研究和实践的基础上选出4种中草药5种提取物，并测定其体外抑菌活性，从中筛选出对嗜水气单胞菌有抑制作用的植物提物，制备成复方制剂，具有良好的体外抑菌活性，具有高效、安全无毒，长期使用无残留的特点。

Description

一种复合植物提取物饲料添加剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及饲料技术领域，具体涉及一种复合植物提取物饲料添加剂及其制备方法。

背景技术

植物提取物饲料由一系列的植物生物活性成分及其衍生物构成，长期以来就被当作香料、防腐剂与药材使用。植物提取物类饲料添加剂被认为为“安全、高效、稳定、可控”的饲料添加剂，逐渐成为绿色环保安全动物食品生产和饲料工业充满活力的新的经济增长点。

水生动物与陆生动物所处环境各异，水的粘度为空气的800倍，具良好的保温性能，但透气性差。养殖水体中残饵粪便堆积，各类微生物物集聚，其中许多的致病菌混生。水生动物免疫缺少时最易导致病害的发生，而水产动物摄食行为不可避免的与病原微生物发生直面接触，诱发疾病的除了病毒、细菌、真菌及寄生虫外，营养不良、水质恶化等皆为致病诱因。

精油作为饲料添加剂可提高动物的免疫机能。部分植物复合提取物据抗氧化活性，例如麝香草精油及其主要成分——百里香酚和甲基异丙基苯-2，3-二醇，可有效清除自由基（如氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和维生素E）。据推测，植物源添加剂和鱼类免疫功能的正常发挥有较好的协同作用，可有效促进消化酶的活性提高，脂质代谢和脂肪的消化吸收。

植物提取物因其香味可影响养殖动物的采食习惯、促进唾液和消化液分泌从而提高采食量而最初用于饲料中。长期使用，植物提取物中的化学活性物质还可抗菌杀菌、抗氧化，保证动物肠道健康、提高自身免疫机能。与抗生素促生长剂不同，植物提取物被认定为安全、高效、稳定、可控的饲料添加剂。

植物提取物饲料添加剂的抗微生物活性已有较多研究和报道。该特性使其在化妆品和食品工业上已得到广泛认可和应用。众多研究报道发现，植物提取物(如肉桂属、麝香草属和止痢草／牛至植物提取物等)具有广泛的体外抗微生物活，并发现其抗微生物活性是基于植物精油的作用。在抗菌方面，芸香料灌木、肉桂／丁香、大蒜、止痢草／牛至和芥菜提取物抗菌能力最强，但除止痢草／牛至提取物添加剂开发成功外，其它提取物的开发还尚需时日。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有强效抑菌效果的复合植物提取物饲料添加剂，解决了抗生素等其他合成药物添加到饲料中存在毒副作用等诸多弊端，取得了良好的效果。

本发明的技术方案为提供一种复合植物提取物饲料添加剂，由柑橘精油、大蒜素、柑橘黄酮、松针粉、松花精油混合而成。

优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂由以下重量份比的原料组成：

松针粉150-200份；

柑橘精油10-15份；

大蒜素3-5份；

柑橘黄酮1-3份；

松花精油1-3份。

优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂由以下重量份比的原料组成：

松针粉180份；

柑橘精油12份；

大蒜素3.6份；

柑橘黄酮2.2份；

松花精油2.2份。

本发明的另一技术方案为提供一种复合植物提取物饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：将柑橘精油、大蒜素、柑橘黄酮、松针粉和松花精油进行混合得到复合植物提取物饲料添加剂。

优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法中，所述柑橘精油的制备方法为：柑橘皮干燥后粉碎成柑橘粉，柑橘粉与水按照固液比1:5添加至蒸馏器，添加质量分数为2.0%的NaCL、蒸馏时间60min时，蒸馏处所得为提纯柑橘精油。

优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法中，所述柑橘黄酮的制备方法为：柑橘皮粉末装入萃取池中，使用甲醇萃取技术提取，所述甲醇萃取技术提取柑橘皮中黄酮类化合物的工艺条件为：压力为10.3MPa，温度为70℃，萃取池的甲醇质量分数为80%，料液比为1：15，提取时间l0min，得提取液，经过滤渣滓过滤得甲醇柑橘黄酮提取物，经氢氧化钠提取，可得柑橘黄酮。

优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法中，所述松针粉制备方法为：松针药材用沸水提取两次，过滤，把两次的滤液合并，浓缩至浸膏状，所得浸膏放置于4℃冰箱静置48h后，除去下层沉淀物，取上清液，真空干燥24小时得松针粉。

优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法中，所述大蒜素提取方法为：将去皮蒜瓣捣碎制成蒜泥，大蒜破碎粒径为0.2mm，所述蒜泥在发酵温度为45℃，酶解时间为30min，酶解ph值为6.0条件下利用大蒜细胞破碎后产生的蒜氨酸酶酶解后，用乙醇浸提，离心，取上清液，在温度50℃、压力0.01MPa、转速75r／min的条件下，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得大蒜素。

本发明有益效果：本发明复合植物提取物饲料添加剂借鉴传统中草药理论研究和实践的基础上选出4种中草药5种提取物，并测定其体外抑菌活性，从中筛选出对嗜水气单胞菌有抑制作用的植物提物，制备成复方制剂，具有良好的体外抑菌活性，具有高效、安全无毒，长期使用无残留的特点。

附图说明

图1本实验采用挥发油提取蒸馏装置来提取橘皮精油的收率图；

图2为柑橘皮粉碎度对精油收率的影响；

图3为柑橘皮蒸馏时间对精油收率的影响；

图4为NaCl的添加量对精油收率的影响。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。

实施例1

（1）柑橘精油—蒸馏法

干燥橘皮——粉碎——水蒸气蒸馏——橘皮精油。

柑橘干燥后粉碎至40目橘皮粉，柑橘粉与水按照固液比1:5添加至蒸馏器，内添加NaCL2.0%、蒸馏时间60min时，蒸馏处所得为提纯橘皮精油。

（2）柑橘黄酮的提取

黄酮类化合物大多具有酚羟基，因此可用碱性水或碱性稀醇浸出，浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。

提取设备：试剂与设备：芦丁，无水甲醇，盐酸，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠等。电热恒温鼓风干燥箱，分光光度计，高速粉碎机，电子天平，加速溶剂萃取仪：压力10．3MPa，34mL萃取池。

提取工艺流程：橘皮粉末-装入萃取池中-甲醇萃取技术提取-提取液干燥-成品，橘皮经高速粉碎机粉碎粒度过30目筛。

甲醇萃取技术提取柑橘皮中黄酮类化合物的工艺条件为压力10.3MPa，温度是70℃（使用电热恒温鼓风干燥箱），加速溶剂萃取仪：压力10．3MPa，34mL萃取池，以甲醇浓度为80%，料液比为1：15，提取时间l0min。提取液，经过滤渣滓过滤得甲醇柑橘黄酮提取物。经氢氧化钠提取，可得柑橘黄酮提取物。

（3）松针粉

复方松针药材约(100g)用沸水提取两次，过滤，把两次的滤液合并，旋转蒸发仪浓缩至浸膏状，得浸膏约14g，放置于4℃冰箱静置48h后，除去下层沉淀物，取上清液，至真空干燥器中，真空干燥24小时。

（4）大蒜素提取

晾干大蒜头—（绞碎）—油水混合物—（蒸馏）—粗提取物—（分馏）—成品。

水蒸气蒸馏法主要得到的是大蒜素进一步降解的烯丙基硫化物，有机溶剂提取法所得产物以大蒜素为主。

将大蒜去皮，称取一定量的去皮蒜瓣，用组织捣碎机制成蒜泥，大蒜破碎粒径为0.2mm。亚铁离子浓度为10m0l/l，发酵温度为45℃，酶解时间为30min，酶解ph值为6.0条件下利用大蒜细胞破碎后产生的蒜氨酸酶酶解后，用乙醇浸提，3500r／min离心10rain，取上清液，在温度50℃、压力0.01MPa、转速75r／min的条件下，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，测定浓缩大蒜素溶液中大蒜素含量。酶解时间、萃取温度、料液比对大蒜素提取率影响最显著。优化所得的大蒜素提取最佳工艺为：酶解时间30min、酶解温度45℃、酶解pH6.0、料液比lg：4ml、萃取时间60min、萃取温度30℃，乙醇浓度95%。

柑橘精油、大蒜素、松针粉、松花黄酮、柑橘黄酮分别从柑橘皮、大蒜、松花、松针中提取。柑橘精油提取后呈现沸点高、热敏性、易氧化的特性；柑橘黄酮不但具有独特的芳香性、良好的水溶性。大蒜素性质：淡黄色油状液体。大蒜素，沸点80-85℃（0.2kPa），相对密度1.112（20/4℃），折光率1.561。溶于乙醇、氯仿或***。水中溶解度2.5%(质量)(10℃)，其水溶液pH值为6.5，静置时有油状物沉淀物形成。与乙醇，***及苯可互溶。对热碱不稳定，对酸稳定。由存在于百合科植物大蒜的鳞茎中，由存在的大蒜氨酸在大蒜酶作用下转化产生。也存在于葱的鳞茎中。具有强烈的大蒜臭，味辣。

将上述的柑橘精油、柑橘黄酮、松花黄酮及大蒜素按照比例及先后顺序，投放至温州发昊星机械设备制造有限公司生产的水粉混料泵THJ-f中，先后顺序按照其沸点的高低进行安排，由高到底，综合考虑其热敏活性。混合的顺序分别为：大蒜素、柑橘黄酮、松花黄酮、柑橘精油。混合比例为，松花粉1.8kg，柑橘精油0.12kg，柑橘黄酮0.022kg，松花黄酮0.022kg，大蒜素0.036kg。制作工艺参数参考福建正源饲料有限公司柑橘复合素制作工艺控制。

实施例2本发明复合植物提取物饲料添加剂体外抑菌效果

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)属于弧菌科、气单胞菌属，是嗜温、有动力的气单胞菌群，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，具有广泛的致病性，对水产动物l、两栖动物和哺乳动物均有致病性。在水产上，是鱼类最常见的致病菌，对淡水鱼感染称为细菌性败血症，发病率达到90%以上，死亡率高达65%以上。曾在上海、江苏、浙江、安徽、广东、广西、福建等20多个省、市、自治区广泛流行，受危害的鱼种类有鲢、鳙、鲮、鲤、鳜、黄鳝、草鱼、白鲳、加州鲈、虾、鳖等多种淡水养殖鱼类。植物提取物作为免疫增强剂和治疗药物在水产上的应用逐渐增多。

本发明借鉴传统中草药理论研究和实践的基础上选出4种中草药5种提取物，并测定其体外抑菌活性，从中筛选出对嗜水气单胞菌有抑制作用的植物提物，制备成复方制剂。

1.1试验材料

1.1.1供试菌株：嗜水气单胞菌IB101，JGlOl，4LNS301，CCH201，LNB10l，CG10l：由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心惠赠；BSK一10、TPS一30由浙江省淡水水产研究所提供。

1.1.2培养基：普通肉汤培养基为牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂20g，高压蒸汽灭菌。

1.1.3供试植物样品：柑橘皮、松针叶、松花粉、大蒜中提取物。柑橘黄酮、柑橘精油、松针叶提取松针粉、松花精油、大蒜素。（提取方法按照上文方式）

1.1.4仪器800型离心机：北京医学仪器厂；SW～CJ一2F超净工作台：苏州净化设备厂制造；电子天平：Sartorius Co，Germany公司制造；PW一30精密培养箱；UV一2100分光光度仪：尤尼柯上海仪器有限公司制造；高效液相色谱仪：美国Agilent公司制造。

1.2实验方法

1.2.1各植物提取物的制备：按实施例1方法制备。

1.2.2茵悬液的制备

将菌株融化，用接种针在固体培养基上划线，37℃培养24h后，挑取单个菌落，接种到液体培养基上振荡培养12～16h。采用麦氏比浊法将菌液用液体培养基稀释到合适浓度。实验中菌液浓度为10CFU／mL。

1.2.3抗茵活性的测定

1)滤纸方法(琼脂扩散法)：滤纸片(6mm)经灭菌后，分别浸入提取物，无菌条件下贴在涂有菌液的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，并做空白对照，37C培养24h后测抑菌圈直径(尽可能地使纸片的含药量一致)，每种提取物8次重复。

2)二倍稀释法：通过抑菌圈的测定筛选出有抑菌效果的植物提取物进行最小抑菌浓度(MinimumInhibitory Concentration，MIC)的测定。采用二倍稀释法。对植物提取物进行梯度稀释至0.006～12.5mg/mL的l2个2倍系列浓度。然后在盛有1.9mL肉汤培养基的试管中分别加入100L稀释后的药液，最后一管不加提取物作空白对照，最后加入细菌悬液，使细菌浓度达到l0CFU/mL。37℃培养24h，625nm测定吸光值，无菌生长的试管中的药物浓度即为该药物的最小抑菌浓度(MIC)。试验重复3次。

1.2.4正交t值法优化组合复方及剂量配比从抑菌活性试验中筛选出抑菌效果佳的提取物，利用正交t值法，以最小抑菌浓度为检测指标，对筛选出的提取物进行组方和剂量优化。

1)正交t值法优化组方原则：将筛选出来的提取物其中每种为一个因素，其代号随机选定，分别为A、B、C、D、E，每种提取物均有给药和不给药两个水平，设水平1为给药，水平2为不给药，结果见表1。各药在每组方中的用量采用正交试验中效果最优的剂量组合。试验选用正交t值表们进行试验安排，各组通过二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，每组3个重复，数据越小，抑菌效果越好。

表1复方5种成分因素水平分析表（单位：mg）

2)辅药交互作用的正交t值法：用正交表着重分析辅药彼此间的交互作用，以最小抑菌浓度(MIC)为检测指标，每组3个重复。

3)正交t值法优化剂量配比：各因素确定后，采用正交表进行剂量优化，以原用剂量为中剂量，适当增减，以最小抑菌浓度(MIC)为检测指标，每组3个重复。

1.2.5HPLC法测定组方有效成分

1)色谱条件：色谱柱为Diamonsil—C18柱(200mm×4．6mm)；流动相：0.05%甲醇水溶液，甲醇(B)。梯度洗脱：0.01～18.0min，90%～20%A，18.0～24.00min，20%～10%A，24.00～25.00min，10%～90%A；25.00～30.00min，90%～90%A；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；检测波长：280nm；进样量：5μl。

2)溶液的制备：分别精密称取柑橘精油、大蒜素、柑橘黄酮、松针粉、松花黄酮对照品1mg，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为100μg/mL的对照品混合溶液。称取样品50mg，置100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/ml的样品混合溶液。

2实验结果

2.1抑菌活性的测定

2.1.1滤纸方法(琼脂扩散法)5种植物提取物对嗜水气单胞菌的抑菌圈测定结果。在0.5g/mL的浓度下，柑橘精油、大蒜素抑菌作用最明显，柑橘黄酮、松针粉、松花黄酮提取物次之。

2.1.2最小抑菌浓度的测定不同植物提取物对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)测定结果见表2。柑橘精油、大蒜素的提取物抑菌作用明显，最小抑菌质量浓度为0.097～0.390mg/mL；松花精油、松针粉、柑橘黄酮，MIC为0.78～3.125mg/mL。

表2提取物对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度（mg/ml）

菌株	柑橘精油	大蒜素	松花黄酮	松针粉	柑橘黄酮
						IB101	0.195	0.195	1.560	3.125	1.56-3.125
JG101	0.195	0.097-0.195	0.780-1.560	1.560	1.56
						TPS-30	0.390	0.195	1.560	1.560	1.56
BSK-10	0.390	0.195	0.780	1.560	1.560
						ALNS301	0.195	0.195	0.780	1.56-3.125	1.56-3.125
CCH201	0.195-0.390	0.097-0.195	0.780-1.560	1.560	1.56
						LNB101	0.390	0.195	1.560	1.56-3.125	1.560

2.2正交t值法优化复合组方和剂量配比

2.2.1柑橘精油和大蒜素有明显的抑菌效果，故为主药。大蒜素、柑橘黄酮、松针粉、松花黄酮为辅药。

辅药交互作用分析后发现，大蒜素、松花黄酮(Ac)；松花黄酮、松针粉(CD)；松花黄酮、柑橘黄酮(CE)三组组合有协同作用。C药和任一种药都有协同作用，提取物间最佳剂量配比为（质量）：松针粉180份；柑橘精油12份；大蒜素3.6份；柑橘黄酮2.2份；松花精油2.2份松针粉150-200份，该组合最小抑菌浓度为78μg/mL，抑菌效果优于任何单因素水平。

实施例3柑橘皮、松针叶、花粉及大蒜等天然植物有效成分提取工艺优化

1、柑橘精油的提取方式及其优化

柑橘精油的提取方法：压榨法、蒸馏法、溶剂提取法、微波或超声波辅助提取及超临界CO₂萃取法等，压榨法适用于新鲜原料，且有机溶剂提取不仅将一部分色素、黄酮等物质同时萃取，且后续可能出现乳浊液。超临界CO₂萃取法运行成本高，设备昂贵。本发明综合考虑，使用蒸馏法对柑橘精油进行优化。

材料：原料成熟新鲜的柑橘，洗净，取外皮

设备：挥发油提取装置，常规水蒸气蒸馏装置。

试验步骤：干燥橘皮——粉碎——水蒸气蒸馏——橘皮精油

1.1精油单因素试验和正交试验，考察蒸馏方法、橘皮粉碎度、蒸馏时间、添加剂对精油收率的影响。

精油提取率=V×D/m×100%

V—精油体积；D—精油比重0.85；m—原料柑橘皮质量。

1.2结果与分析

1.2.1蒸馏方法对精油收率的影响

本实验采用水中蒸馏、常规水蒸气蒸馏和挥发油提取装置三种方法，以精油收率为指标，确定最优提取方法。

分别粉碎至10目的20g橘皮，按固液比1:5，加入圆底烧瓶中，蒸馏2h，计算三种蒸馏方法的得油率，结果如图1所示。

由图1可知，采用挥发油提取装置橘皮精油收率最高，且本装置将水蒸气蒸馏改为水蒸气回流，安装操作简单，降低了能源发生器中要进场加水的问题。因此，本实验采用挥发油提取蒸馏装置来提取橘皮精油。

1.2.2橘皮粉碎粒度对精油收率的影响

橘皮粒度的大小直接影响精油的收率，颗粒越小，精油从果皮内部扩散至表面的距离越短，越容易渗出，但颗粒过小，又容易结成一团，从而出油率降低。

将5份20g不同破碎度的分别与100ml水一起加至圆底烧瓶中，蒸馏2h，得油率如图2，如图2可知，橘皮的破碎度为30目时，精油收率最高。图2柑橘皮粉碎对精油收率的影响

1.2.3蒸馏时间对精油收率的影响

在上述确定的最佳条件下，用挥发油提取器提取柑橘皮精油，提取时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、计算精油得率。

由图3可见，当蒸馏的时间为0.5h时，精油收率为1.08%，蒸馏时间延长，精油收率明显增加，但超过1h后，精油收率变化1h，结合后面的优化试验在确定最佳蒸馏时间。

1.2.4添加剂种类对精油收率的影响

提取时加入一定量的添加剂可以改变果皮内外的渗透压，使精油更容易渗透出来。本实验中分别加入了1gNaCL、Na2SO4、（NH4）2SO4，其他条件不变，考察添加剂种类对柑橘皮精油提取的影响，试验结果见图4，图3为蒸馏时间对精油收率的影响图4NaCl的添加量对精油收率的影响

由图4可见，当圆底烧瓶中加入一定量的NaCL时精油得率最高，达到了2.01%。

1.2.5正交试验

综合上述试验结果，以挥发油提取装置进行精油提取，并加入NaCL提高出油率，在此基础上，考虑不同因素间的交互影响作用，采用正交表进行试验，最终确定橘皮精油的最佳提取条件，因素及水平安排见表3

表3实验因子及水平

试验结果表明，固液比1:5，橘皮精油的最佳提取条件A₃B₂C₂，即粉碎度40目、NaCL添加量2.0%、蒸馏时间60min时，精油得率最高，精油得率为2.19%。

2、柑橘皮中总黄酮的提取工艺优化

由于黄酮类化合物大多具有酚羟基，因此可用碱性水或碱性稀醇浸出，浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。低浓度的氢氧化钠水溶液浸出能力较大，且浸粘液水溶性杂质能生成钙盐沉淀，有利于浸出液的纯化。石灰水的缺点是浸出效果不如稀氢氧化钠水溶液，原因是有些黄酮类化合物能与钙形成不溶性物质。

橘皮中具有丰富的类黄酮物质，经研究发现柑橘类黄酮类物质具有抗氧化、抗肿瘤以及保护心脑血管等多种保健、医疗功能，具有广泛应用前景。随着罐头和果汁加工产业的发展，产生大量的柑橘皮，为柑橘总黄酮物质提取提供了丰富的原料。以醇为提取溶剂提取柑橘皮中的总黄酮，并通过单因素和正交试验，考察了提取液pH值、料液比、提取时问、提取温度对总黄酮得率的影响，确定了甲醇提取柑橘皮中总黄酮的最佳工艺。

2.1.材料与方法

2.1.1实验材料：柑桔，产地广东，剥下桔皮，洗净后，切成小块，60～C恒温干燥箱中烘干，然后用粉碎机粉碎制得粉末，备用。

2.1.2试剂与设备：芦丁，无水甲醇，盐酸，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠等。电热恒温鼓风干燥箱，分光光度计，高速粉碎机，电子天平，加速溶剂萃取仪(戴安ASE300)：压力10.3MPa，34mL萃取池。

2.1.3提取工艺流程：橘皮粉末一装入萃取池中一甲醇萃取技术提取一提取液干燥一成品。

2.1.4测定方法：

2.1.4.1芦丁标准溶液的配制准确称取充分干燥后的芦丁标准试剂0.0400g，用30％的甲醇溶解，并定容至l00mL，摇匀。即标准溶液的浓度为0.4g/L。准确吸芦丁标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分别置于25mL比色管中，补充30％的甲醇至5r～LL，加入5％NAN02溶液0.7mE，摇匀，放置6rain。加入10％A1(NO3)3溶液0．7mL，摇匀，放置6min。加入4％NaOH溶液5．Oral，用30％甲醇稀释至刻度，摇匀放置10min，用分光光度计测定5l0nm处测吸光度。以试剂空白为参比，作芦丁浓度一吸光度标准曲线，得回归方程。

2.1.4.2柑橘皮总黄酮的测定将各实验所得提取液用30％的甲醇定容于50raL容量瓶中，取上述提取液0.5mL移人25mL比色管中，按照芦丁标准曲线测定法测定吸光度，代人回归方程得出浓度，并计算出得率。

2.1.5单因素实验及正交实验：首先拟定提取剂、提取温度、时间、料液比进行单因素实验。在单因素实验成功的基础上确定正交实验工艺参数范围。通过正交实验确定最佳提取工艺条件。

2.2.结果与分析

2.2.1不同q1醇浓度对提取效果的影响。准确称取3.40g样品，分别使用20%、40%、、60%、80%、100%甲醇作为萃取剂，在60℃下萃取15min，提取液定容，测定含量。黄酮的得率随甲醇浓度的升高而升高，并在甲醇浓度为80%时达到最高值。

2.2.2温度对黄酮提取效果的影响。准确称取3.40g样品，使用80%甲醇作为萃取剂在30、50、70、90、100%下提取15main。黄酮的得率随温度的升高而增加，当温度超过70℃时黄酮的提取率随温度的升高略有下降，可能是因为高温下，提取所得黄酮易被破坏。因此选择温度在70℃为宜。

2.2.3提取时间对黄酮提取效果的影响。准确称取3.40g样品，使用80%甲醇作为萃取剂，在70℃下提取5、l0、l5、20、25main。随着提取时间的增加，黄酮得率逐渐增大，但10min后无明显差异，因此选择10min作为最佳提取时间。

2.2.4料液比对提取效果的影响。准确称取一定量样品，使料液比为l：5、1：10、1：15、1：20，使用80%甲醇作为萃取剂，在70℃下提取l0min。随料液比的增大，总黄酮得率增加，但从1：10～1：20的范围内增加不显著。考虑到溶剂用量成本，因此采用1：10～1：15为好。

2.2.5正交实验。实际操作受提取温度、提取时间、甲醇浓度、料液比4个因素交叉影响，为考察各因素影响，设计4因素3水平进行正交实验。影响黄酮提取率大小的主次顺序为甲醇浓度>提取温度>提取时间>料液比。4个因素的最佳组合是A₂B₂C₂D₃，即甲醇浓度为80％、提取温度是70℃、料液比为1：15、提取10min。

2.3结论

甲醇萃取技术提取柑橘皮中黄酮类化合物的最佳工艺条件为压力10.3MPa，甲醇浓度为80%，提取温度是70℃，料液比为1：15，提取时间l0min，提取次数为1次，黄酮提取率为1.41%。

3、松针叶活性物质提取

复方松针药材约(100g)用沸水提取两次，过滤，把两次的滤液合并，旋转蒸发仪浓缩至浸膏状，得浸膏约14g，放置于4℃冰箱静置48h后，除去下层沉淀物，取上清液，至真空干燥器中，真空干燥24小时(备用)。

4、大蒜中大蒜素的提取

水蒸气蒸馏法主要得到的是大蒜素进一步降解的烯丙基硫化物，有机溶剂提取法所得产物以大蒜素为主，超临界萃取法所得产物虽然也以大蒜素为主，但实验设备要求高。由此，本发明采用提取率高、设备简单、成本低的有机溶剂提取法，以乙醇为提取剂，采用正交设计法优化大蒜素提取工艺，以期提高大蒜中大蒜素提取率，为规模分离提取大蒜素提供技术参数。

材料

4.1.1实验原料

大蒜，湖北咸宁产。

4.1.2主要试剂

无水乙醇(上海南翔试剂厂)，DTNB(Sigma)，Hepes缓冲液(Sigma)、L一半胱氨酸(Sigma)。

4.1.3主要仪器

组织捣碎机(上海精密仪器仪表有限公司)，HH—L恒温水浴箱(国华电器有限公司)，TDL5型低速离心机(上海安亭仪器有限公司)，WFZ756PC型分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，RE2000B型2L旋转蒸发仪(西安超杰生物科技有限公司)。

方法

4.2.1提取工艺流程

将大蒜去皮，称取一定量的去皮蒜瓣，用组织捣碎机制成蒜泥。按设计的工艺参数，利用大蒜细胞破碎后产生的蒜氨酸酶酶解后，用乙醇浸提，3500r／min离心10rain，取上清液，在温度50℃、压力0.01MPa、转速75r／min的条件下，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，测定浓缩大蒜素溶液中大蒜素含量。

4.2.2实验设计

采用正交设计确定影响大蒜素提取的主要因素及各因素的合适范围，因素与水平见表4。正交实验设计及结果统计学分析由软件正交助手II处理。

表4大蒜提取影响因素正交实验设计表

4.2.3大蒜素的测定

分光光度法引：大蒜素提取率(‰)=大蒜素质量(g)／大蒜质量(g)X1000％。

4.3结果

正交设计结果表明，大蒜素最佳提取条件为：A1B2C1D3E2F1G1，即酶解时间30min、酶解温度45℃、酶解pH6、料液比1g：4ml、萃取时间60min、萃取温度30℃，乙醇浓度95％。由极差分析结果表明，各因素对实验结果影响程度依次为：A>D>F>E>B>G>C。对正交试验进行方差分析(表5)可知，七个因素中，A(酶解时间)、F(萃取温度)、D(料液比)对大蒜素提取率影响最显著，说明这三个因素即使较小变化也会对大蒜素提取率影响较大。其他因素对大蒜索提取率无显著影响。

表5正交实验方差分析

因素偏差	平方和	自由度	F比	F临界值	显著性
						A	1.947	2	973.5	19	P<0.05
B	0.012	2	6	19
						C	0.002	2	1	19
D	0.041	2	20.5	19	P<0.05
						E	0.035	2	17.5	19
F	0.042	2	21	19	P<0.05

G	0.007	2	3.5	19
						误差	0.000	2

为了确保提取工艺的重现性及可行性，按优选的工艺条件进行3次平行验证实验，结果大蒜素分别为：2.911‰、2.917‰、2.903‰，平均提取率为2.91‰，与正交试验不同条件的提取结果比较，提取率相对较高，优化的工艺条件可行性良好。结果表明，大蒜素提取工艺各因素对实验结果影响程度依次为：A>D>F>E>B>G>C，即酶解时间>料液比>萃取温度>萃取时间>酶解温度>乙醇浓度>酶解pH6，其中，酶解时间、萃取温度、料液比对大蒜素提取率影响最显著。优化所得的大蒜素提取最佳工艺为：酶解时间30min、酶解温度45℃、酶解pH6.0、料液比lg：4ml、萃取时间60min、萃取温度30℃，乙醇浓度95%。为了验证此优选方案的可行性，又重复3次，结果稳定，大蒜素平均提取率达到2.91‰。

实施例4本发明复合植物提取物饲料添加剂实际应用

1、本发明复合植物提取物饲料添加剂于对虾养殖中的应用效果

本实验选用一种商品名称为福乐兴的天然植物复合提取物，是以柑橘皮、松针叶、花粉、大蒜一定比例配伍浓缩干燥而成的一种复合添加剂；研究不同添加水平的天然植物复合提取物对凡纳滨对虾生长、饲料利用、体组成成分以及抗病力的影响，为获得对虾商业饲料中天然植物复合提取物的适宜添加量。

l.l饲料配制

以鱼粉、豆粕、花生粕和啤酒酵母为蛋白源，鱼油和豆油(1：1)为脂肪源，面粉为糖源，配制成5种等氮等能饲料(实验共设5个组C1、C2、C3、C4、C5，天然植物复合提取物的添加量分别为0、0.5％0、1.0％0、2.0％0和3.0‰饲料。各饲料原料粉碎过60目筛，微量成分采取逐级扩大法添加与大原料混合均匀后，用双螺杆制粒机挤压成1.0mm和1.2mm两种粒径的颗粒饲料，风干后放入冰箱中冷冻备用。

1.2饲养管理

实验挑选外观正常，体质健壮，尾均体重0.57g左右的凡纳滨对虾作为实验用虾。每个处理设三个重复，每个玻璃钢桶放养凡纳滨对虾30尾。玻璃钢桶水容量为0.3m。实验用虾先暂养7d后，称初始体重，然后平均分组。实验采用定量投喂，投喂率初期按10％，后期按8％。投饲时间分别为6：00、10：00、15：00、19：00、23：00，早晚的投喂量占13投喂量的60～70％。每周根据对虾生长状况，相应调节投饲量。称终末体重前24h停止投喂。实验全过程不问断充气增氧，每天换水一次。实验期间水温27.5±1.5℃，海水比重1.0124±0.002。养殖实验持续8周。

1.3样品采集及分析

实验结束时，称重计数，随机抽取5～8尾对虾用于全虾体成分分析，水分含量用105℃常压干燥法，灰分含量采用550℃高温炉灼烧法，粗脂肪含量用索氏抽提法测定，粗蛋白的测定采用微量凯氏定氮法。

增重率(％)=(终末体重一初始体重)×100／初始体重

成活率(％)=实验结束时虾尾数×100／实验开始时放虾尾数

饲料系数(FCR，％)=摄食量／(终末体重一初始体重)

蛋白质效率(PER，％)=(终末体重一初始体)×100／(饵料摄食量×蛋白质含量)

1.4实验数据的统计分析

采用“Microsoft Excel”软件对数据进行统计学分析，先对数据作单因素方差分析(ANOVA)，处理间若有显著差异，再作Duncan’S多重比较，P<0．05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2结果和讨论

2.1饲料中添加天然植物复合提取物对南美对虾生长及存活率的影响

实验结果中前4周对虾的增重率以添加0.2％组最高，饲料中未添加天然植物复合提取物组和添加0.3％组的增重率最低；8周的实验结果同前4周的结果相似，即随着饲料中天然植物复合提取物从0%增加到0.2%，对虾的增重率显著上升，然而过量添加天然植物复合提取物组(0.3%组)的增重率没有增加反而显著降低。

对虾的成活率前4周不受饲料中添加天然植物复合提取物的影响，然而8周的实验结果表明，随着饲料中天然植物复合提取物浓度的增加，对虾的成活率显著提高，未添加组和0.05%添加组的成活率显著低于0.2%以上添加组。

本实验的结果表明饲料中添加天然植物复合提取物具有显著促进对虾生长，提高成活率等作用。8周养殖成活率结果提高幅度较大，相交与空白对照，提高幅度为11.5%。

2.2饲料中添加天然植物复合提取物对对虾饲料利用的影响

饲料中添加不同水平的天然植物复合提取物对对虾饲料利用的影响结果见表6。表6的数据表明，随着饲料中天然植物复合提取物添加含量由0%增加0.2%时，饲料系数显著降低，蛋白质效率显著升高，其中添加0.2％天然植物复合提取物组的饲料系数最低，蛋白质效率最高；然而饲料中添加高水平天然植物复合提取物组(0.3%组)的饲料系数反而显著升高，蛋白质效率显著降低。

表6饲料中添加天然植物复合提取物对虾饲料利用的影响

组别	饲料系数	蛋白质效率
			C1	1.73±0.09	1.45±0.08
C2	1.68±0.19	1.49±0.17
			C3	1.58±0.17	1.59±0.17
C4	1.49±0.10	1.68±0.11
			C5	1.82±0.20	1.38±0.15

注：表中的值为平均数±标准差(n=3)；同一列中具不l司字母标记的值表示差异显著(P<0.05)

本实验的结果显示饲料中添加适量的天然植物复合提取物显著促进对虾饲料利用能力，饲料系数显著降低，降低原水平的86%，而蛋白质效率显著提高。

2.2复合植物提取物对南美白对虾的酶活性的影响。

每组取5—8尾对虾，用lmL注射器从心脏取血，置于Eppendorf管中，在4℃冰箱中静置24h后离心，取上清液备用。超氧化物歧化酶活力按邓碧玉等改良的连苯三酚自氧化法测定。酚氧化酶活力参照Ashida以L-dopa为底物比色的方法测定。溶菌酶活力的测定按王雷等将二次活化的溶壁微球菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基培养48h，取出后离心，收集菌体，再按Hultmark的方法改进，用0.1mol/L的磷酸钾盐缓冲液(pH=6.4)稀释至A=0.3，配成底物悬液供测试用，按该方法规定条件，溶菌酶活力(U/m1)=(A0一A)/A0。

表7饲料中添加天然植物复合提取物对白对虾非特异性免疫指标的影响

注：表中的值为平均数±标准差（n=3）；同一列中具不同字母标记的值表示差异显著（p<0.05）

南美白对虾血清中溶菌酶活力随着饲料中天然植物复合提取物添加浓度由0%提高到0.2%而显著上升，然而过高的添加水平并不能提高溶菌酶的活力，反而显著降低。当饲料中天然植物复合提取物由0%增加到0.1%，对虾血清中酚氧化酶活力显著升高；然而随着饲料中天然植物复合提取物由0.1%增加到0.2%时，酚氧化酶活力显著降低。饲料中添加天然植物复合提取物对血清超氧化物歧化酶活力的影响不显著，尽管添加天然植物复合提取物0.2%组的超氧化物歧化酶活力最高，然而方差分析结果表明，各组间差异不显著。南美白对虾血浆中血细胞总数未添加天然植物复合提取物组以及添加0.3%组显著低于0.05%、0.1%和.2%添加组，而添加0.05%、0.1%和0.2%组血细胞总数组间差异不显著。饲料中添加天然植物复合提取物具有显著提高对虾溶菌酶、酚氧化酶活力以及血细胞总数。

2、本发明复合植物提取物饲料添加剂于中华鳖养殖的应用

本实验中应用复合植物提取物，开展复合植物提取物3水平的梯度试验法。预混料中两个试验组复合植物提取物的添加水平分别为0.2%、0.4%，对照组为空白试验组。试验饲料在福建正源饲料有限公司内部水产实验室开展了饲喂试验及生产应用效果验证。

2.1试验地点与分组

试验在福建正源饲料有限公司内部水产实验室进行。选用健康、大小均匀的幼鳖120只，平均体重63试验分3组，A，B两组为试验组，C组为对照，每2盆放养幼鳖20只，每组设一重复。

2.2试验装置与时间

试验于直径0.5m的塑料桶中进行，水深30cm盆中加吊聚乙烯网片作隐蔽，另加砖块作为食台，大盆斜置于温控棚内，棚内气温35±3℃左右，从而保证盆中水温恒定在30±2。试验用水为地下水，经充分曝气后用石灰水消毒(30Hkg)，盆水ph7.5；定时充氧使溶氧保持在2.5mg/l以上，2-3d换水一次。试验时间从2013年2月28日至5月5日，各组幼鳖在大桶中饲养预试14d，待其摄食正常后开始试验。

2.3饲养管理

饲养管理要细致，每天根据幼鳖摄食、活动、防疫情况，做好日观察记录工作。上、下午各投喂一次饵料，投喂前吸去残饵，投饲量看水温和摄食情况而定。一般为幼鳖体重的3%-5%。

2.4试验饲料

在同一日粮配方、同一预混料的基础上添加不同复合植物提取物水平后，分别配制成全价试验用饲料，组成如表8，饲喂前加2％植物油，拌成团块状放在水上投喂。

表8试验饲料

2.5试验结果

2.5.1生长比较

饲养试验中，每两周各组进行一次生长测定，期间幼鳖生长测定5次，生长情况见表9。

表9生长结果

添加0.2%的A组和0.4%的B组，06%C组，饵料系数比0.6%组分别低0.150和0.446，饵料效率比C组分别高2.4％和10.9％同时B组和A组相比，B组饵料系数低0.296，饵料效率高85%这说明在饲料中增加复合植物提取物的添加量有利于提高饵料的利用率、降低饵料系数。显示饲料中复合植物提取物添加水平为0.2%和0.4%的两个试验组平均日增重比C组分别高0.09g和0.22g；日生长率比C组分别高0.16%和0.41%，试验组生长速度高于对照组。这说明增加复合植物提取物添加量有利于提高幼鳖的生长速度。从表10也可看出B组日增重比A组高0.13g，日生长率高0.25%；从生长曲线上可以明显看出，添加高水平复合植物提取物的生长速度比低水平的快。

表10生长结果比较

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.一种复合植物提取物饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将松针粉150-200份；柑橘精油10-15份；大蒜素3-5份；柑橘黄酮1-3份；松花精油1-3份；进行混合得到复合植物提取物饲料添加剂；

所述柑橘精油的制备方法为：柑橘皮干燥后粉碎成柑橘粉，柑橘粉与水按照固液比1:5添加至蒸馏器，添加质量分数为2.0％的NaCl、蒸馏时间60min，蒸馏处所得为提纯柑橘精油；

所述柑橘黄酮的制备方法为：柑橘皮粉末装入萃取池中，使用甲醇萃取技术提取，所述甲醇萃取技术提取柑橘皮中黄酮类化合物的工艺条件为：压力为10.3MPa，温度为70℃，萃取池的甲醇质量分数为80％，料液比为1：15，提取时间l0min，得提取液，经过滤渣滓过滤得甲醇柑橘黄酮提取物，经氢氧化钠提取，可得柑橘黄酮；

所述松针粉制备方法为：松针药材用沸水提取两次，过滤，把两次的滤液合并，浓缩至浸膏状，所得浸膏放置于4℃冰箱静置48h后，除去下层沉淀物，取上清液，真空干燥24小时得松针粉；

所述大蒜素提取方法为：将去皮蒜瓣捣碎制成蒜泥，大蒜破碎粒径为0.2mm，所述蒜泥在酶解温度为45℃，酶解时间为30min，酶解pH值为6.0条件下利用大蒜细胞破碎后产生的蒜氨酸酶酶解后，用乙醇浸提，离心，取上清液，在温度50℃、压力0.01MPa、转速75r/min的条件下，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得大蒜素。