CN103562719B - 生物体组织分析用探针及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过酶的分离,从生物体组织中高收率地得到具有高的生物活性的细胞或细胞群的方法及用于其的探针。具体而言,本发明涉及生物体组织的分析方法,其特征在于,对于与特定的生物体成分结合的2种以上的蛋白质,将分别含有所述生物体成分结合域的2种以上的探针用于经分离的生物体组织上,分析所述各探针对于生物体组织的结合量。
Description
技术领域
本发明涉及通过酶分离由生物体组织高收率地得到具有高的生物活性的细胞或细胞群的方法,以及用于该方法的探针。
背景技术
来自生物体组织的细胞和细胞簇的酶分离可用于包括移植该细胞或建立细胞系等各种目的,以及治疗、诊断和检查等广泛的用途。然而,为了解离生物体组织、分离其中含有的细胞或细胞集合体,有必要使细胞或细胞集合体游离至期望的程度,从而与细胞组织部分分离。从生物体组织分离细胞和细胞簇时,细胞间基质被胶原酶等蛋白质分解酶的混合物分解。
生物体组织由细胞和细胞间基质构成。细胞间基质是固定细胞的物质,有结构物和非结构物。前者有胶原纤维、弹性纤维、细网纤维等纤维,后者为填充在纤维之间的成分,为称作底物的非溶胶的凝胶状物质,有糖蛋白和蛋白多糖。细胞间基质的代表是称为胶原(collagen)的蛋白质,占生物体内总蛋白质重量的约1/3。胶原具有纤维结构,正式地称为胶原纤维。
组织大致分为上皮组织、支持组织、肌肉组织和神经组织4个类别。上皮组织是覆盖在身体表面的组织,细胞密度高,没有穿插细胞间基质。支持组织起着支持身体、脏器和细胞等的作用,包括***、软骨组织、骨组织、血液、淋巴。肌肉组织是以收缩运动为目的融合分化的细胞,细胞间基质所占的比例极低。
肌肉组织由肌肉细胞、***、血管和神经构成,但是主要的结构物是肌肉纤维。神经组织主要由神经内膜和神经束膜构成,任一种均含有较多的细胞间基质(胶原)。***是支持组织的一种,由脂肪组织和纤维性***(以胶原纤维和弹性纤维为构成成分)组成,大致分为疏水性***和坚韧性***。疏水性***是胶原不规则排列的纤维性***,分布于皮下组织、粘膜组织、神经、血管外膜、小叶间组织等。
根据生物物种、年龄、性别、组织、生活环境等,细胞间基质中胶原的含量情况不同。但是,在何种组织的何种状态的基质中以何种程度含有何种胶原仍不是十分明确。胶原的特征在于,构成蛋白质肽链的氨基酸具有如“-甘氨酸-氨基酸X-氨基酸Y”这样甘氨酸每3个残基重复一次的一级结构。据报道,人类的胶原蛋白质有30种以上,但是体内存在最丰富的是纤维性的I型胶原,非纤维性的IV型胶原的含量也很大,涉及通过分子间二硫键相互连接而形成网状结构(非专利文献1)。据报道,IV型胶原存在于胰岛和内分泌组织之间(非专利文献2、3)。
认为特定类型的胶原是否存在于目标基质中,理论上可通过使用针对各种类型胶原的抗体进行免疫染色来确定。然而,胶原的种类较多,且广泛地存在于多细胞动物中,因此难以制作抗体等成为瓶颈,其实现是困难的。
作为组织分解用的酶,来自溶组织梭菌的各种类型的粗胶原酶除了含有2种胶原酶之外,还含有各种蛋白酶(胶原分解活性和非特异性的蛋白质分解活性)和非蛋白酶成分(磷脂酶等)。通过这种粗胶原酶,各细胞和细胞群从生物体组织中酶法分离。
据报道,各细胞或细胞群从生物体组织上酶法分离的时候,对于所分离的细胞或细胞群的收率及其生物活性,2种胶原酶(ColG和ColH)起重要作用,其用量比例有较大的影响(非专利文献4)。在从胰脏组织中分离胰岛的情况中,也使用由溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)产生的2种胶原酶(非专利文献5、专利文献1和2)。本发明人现已确认,通过使2种胶原酶的用量比例最优化,可以分离大量的胰岛。
据报道,胶原酶根据其种类而具有不同的胶原结合域(非专利文献6)。到目前为止,制备了各种功能性蛋白质和胶原结合域的融合蛋白质用于靶向和药物输送***(DDS)。例如,可以列举在溶组织梭菌的胶原结合域中结合bFGF或EGF的胶原结合性细胞生长因子(非专利文献7)、源自牛血管性血友病因子的胶原结合十肽和TGF-β的融合蛋白质(非专利文献8和9)、在纤维连接蛋白的胶原结合域中结合功能性肽的缓释性细胞生长因子供给体(专利文献3)。如此,可制备与胶原结合域的融合蛋白质用于靶向和组织可视化目的,但不能用于生物体组织的分析和分离。
为了对特定的组织和细胞进行无损伤分离,必须使所述组织和细胞周围存在的细胞间基质分解。然而,在进行必要的细胞表面分解的同时,无损伤地仅将细胞间基质通过酶进行分解是不容易的。特别是根据人类脏器的情况、年龄、性别、生活习惯、病史等,通过蛋白质分解酶获得的分解性不同,因此不得不通过经验确定酶的种类和酶反应时间而进行分离。
在糖尿病患者中,移植从胰脏中分离的胰岛进行治疗(胰岛移植)。在胰岛移植中,必须分离存在于被称为胰岛的胰脏组织中的细胞团块,必须在不损伤胰岛的情况下分解胰脏组织,分离胰岛。然而,细胞间基质的状态根据动物种类、组织部位、个体年龄或性别、生长环境等而差别较大。特别是对于胶原,由老化导致的物性变化显著。尽管如此,对于不同状态的胰脏组织,根据规则适用一定用量比例的酶,仅改变分解时间,一边目测确认胰脏的分解程度,一边进行酶处理。因此,所得到胰岛的数量和质量根据医疗机构、医疗工作者、目标胰脏的状态而变。
如果可以由待分离的细胞外基质或脏器的蛋白质组成来正确且简便地知晓所使用的蛋白质分解酶的种类和用量,则可在高活性的状态下分离目标细胞等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1WO96/00283
专利文献2WO98/24889
专利文献3WO02/014505
非专利文献
非专利文献1Inoueetal.,JCellBiol,97,1524-1537(1983)
非专利文献2SJHughes,PMcShane,TransplantProceedings,37,3444-34445(2005)
非专利文献3SJHughes,AClark,PMcShane,Transplantation,81(3)423-426(2006)
非专利文献4DBrandhorstetal.,TransplantationProceedings,37(8),3450-3451(2005)
非专利文献5ELinetskyetal.,Diabetes,46,1120-1123(1997)
非专利文献6KWatanabe,ApplMicrobiolBiotechnol,63,520-526(2004)
非专利文献7NNishi,OMatsushita,KYuube,HMiyanaka,AOkabe,FWada,ProcNatlAcadSciUSA.;95(12):7018-7023(1998)
非专利文献8Tuanetal.,ConnectiveTissueReserch,34(1),1-9(1996)
非专利文献9Hanetal.,ProteinExpressionandPurification11,169-178(1997)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的是,提供从生物体组织快速且高效地分离具有高生物活性的细胞或细胞群的方法。具体而言,在不降低生物体组织中的生理活性物质、细胞或/和脏器的生理活性的情况下,高收率地获得目标细胞或细胞群。
解决问题的手段
本发明人制作了生物体组成分析用的探针,该探针使用具有2种酶的底物结合域(生物体成分结合域)和可视化蛋白质的融合蛋白质。并且,已发现,通过分析这种探针的结合量、预测酶对生物体组织的作用性,可确定最合适的酶的用量比例和作用时间等,可更高效地将目标细胞或细胞群在具有高生物活性的状态下分离。
即,本发明涉及生物体组织的分析方法,其特征在于,对于与特定的生物体成分结合的2种以上的蛋白质,将分别含有所述生物体成分结合域的2种以上的探针用于经分离的生物体组织上,并分析所述各探针对于生物体组织的结合量。
在本发明中所使用的探针被设计成可使用公知的分子成像技术可视化。即,通过荧光分子、发光分子、正电子核素和放射性同位素等可视化分子来标记探针。
作为可视化分子,可以列举GFP、EGFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、tdTomato、RFP等荧光分子和荧光素酶蛋白质等发光分子,但不限于此。荧光素酶蛋白质优选具有与天然存在的野生型荧光素酶不同的峰值波长和发光强度。
荧光分子和发光分子可单独使用,也可将荧光分子(能量接收蛋白质)和如荧光素酶的可自发光分子(能量产生蛋白质)结合使用。在这种情况下,二者优选通过合适的连接基团连接。
作为探针用的生物体成分结合域,可以列举蛋白质分解酶的胶原结合域、或纤维连接蛋白等的生物体内蛋白质的胶原结合域等。作为前者的具体实例,可以列举源自梭菌属(Clostridium)的胶原酶所具有的胶原结合域,例如,源自溶组织梭菌(Clostridiumhistryticum)的胶原酶G和胶原酶H的胶原结合域。
另外,探针用的胶原结合域在能够实现本发明的目的和效果的前提下,可为该域的一部分(部分序列),“胶原结合域”的表述也包括这种胶原结合域的一部分。
作为在本发明中使用的底物结合域的一个具体实例,所述源自溶组织梭菌的胶原酶G和胶原酶H的胶原结合域的氨基酸序列示于序列序号1和序列序号2中。
在可视化分子为蛋白质的情况下,生物体成分结合域和可视化分子(蛋白质)可制作成融合蛋白质。
探针包含1-100次、优选1-20次生物体成分结合域的序列重复。
在本发明的分析方法中,可以将2种以上的探针分别作用于生物体组织上,也可同时作用于生物体组织上。此外,各探针的结合量也可分别测定,也可同时测定。优选的是,将2种以上的探针用不同的可视化分子标记,使探针同时作用,并同时测定其结合量。
另外,本发明还提供利用本发明的分析方法从生物体组织分离细胞或细胞群的方法。本发明的分离方法的特征在于,使用所述分析方法分析生物体组织,基于其结果确定酶(源自探针中所含的底物结合域的酶)的用量比例,将该用量比例的酶作用于生物体组织,从而分离目标细胞或细胞群。
另外,本发明还提供由上述2种以上的探针组成的生物体组织分析用探针组、或包括该探针组和酶等的生物体组织分离用试剂盒。
发明效果
本发明中使用的探针含有生物体成分结合域,通过与生物体组织中存在的特定的酶结合部位等特异性结合,发出荧光或发光。通过观察由对应于各种酶的探针产生的荧光或发光等,可以分析生物体组织中的酶的亲和性或作用性。具体而言,将探针与目标组织的少量冰冻切片一起培养、染色。由组织切片上的蛋白质组成的色调及其荧光强度,分析与探针的结合情况,算出最适合分解的酶的用量比例和作用时间。
即,根据本发明,通过探针对待分离的细胞外基质或组织蛋白质的结合性,可正确且简便地知晓所使用的蛋白质分解酶的种类或用量。如此,可迅速且简便地将目标细胞或细胞群在维持高活性的状态下从生物体组织中分离。例如在胰岛移植中,可根据目标胰脏组织的状态处理酶,还可建立通常能实现大量优质胰岛分离的胰脏组织状态指标。
附图说明
图1(A)ColGCBD和(B)ColHCBD的组成
图2tdTomatoColHCBD的序列示意图
图3Ni-NTA洗脱部分的SDS-PAGE
图4阴离子交换色谱法洗脱部分的SDS-PAGE
图5tdTomatoColHCBD的激发、荧光光谱
图6荧光素酶基因和CBD基因的扩增所使用的引物的示意图
图7荧光素酶-胶原结合域融合蛋白质表达质粒
图8探针蛋白质的表达确认(SDS-PAGE)
图9荧光素酶发光确认(发光光谱和550nm的发光强度随时间的变化)
图10Ni-NTA琼脂糖柱洗脱部分的SDS-PAGE(M:蛋白质标记物、S:PGV_ColHCBD粗品、FT:直接流过部分、50~500mM:各浓度的咪唑洗脱部分(将第一个200mM咪唑洗脱部分作为纯化的酶溶液。))
图11与胰脏组织片的结合确认试验
图12根据EGFP-ColGCBD探针获得的猪胰脏切片的组成分析结果
图13在大鼠组织切片中GFPColGCBD和tdTomatoColHCBD的荧光亮度比(H/G:tdTomatoColHCBD相对于GFPColGCBD的荧光亮度比、W:Wister-Furth大鼠,L:Lweis大鼠,SD:SD大鼠)
图14胶原酶G和H的组成比的差异对胰岛的数量和质量的影响(A:收率、B:ATP/DNA、C:体外糖负荷测试、D:胰岛素/DNA)
本说明书包括作为本申请优先权基础的特愿2011-058080号说明书中记载的内容。
发明的实施方式
1.生物体组织的分析方法
本发明对于与特定的生物体成分结合的2种以上的蛋白质,通过使用分别含有所述生物体成分结合域的2种以上的探针,分析针对该探针的生物体组织的结合量(亲和性),将其结果应用于生物体组织的分解、细胞或细胞群的分离中。
在此,“与特定的生物体成分结合的2种以上的蛋白质”可以列举纤维连接蛋白或整联蛋白等的细胞间基质蛋白质、和蛋白质分解酶等酶。这些蛋白质具有与其配体或底物特异性结合的部位(域),在本说明书中,该部位记载为“生物体成分结合域”。
在从生物体组织分离细胞或细胞群的情况中,通常较多地使用多种酶。然而,各种酶的作用性(组织的敏感性)根据适用的生物体组织的部位或状态而差别较大。因此,为了在维持高生物活性的同时迅速且高效率地分离目标细胞或细胞群,希望能够预先确定最适合的酶的使用量、使用比例、作用时间等。本发明的探针可简便地确定这种最适合的酶使用量、使用比例、作用时间等。
在本发明中,作为目标的“生物体组织”没有特别的限制,广泛地包括哺乳类、鸟类、爬行类、鱼类等的多细胞动物的组织、肝脏、胰脏、肾脏、牙周组织、肝脏、胰脏、皮肤、软骨、骨、神经组织。此外,不仅包括从生物体分离的物质,还包括人工构筑的ES细胞组织、iPS细胞材料用的成纤维细胞组织等。
在本发明中,对于与特定的生物体成分结合的2种以上的蛋白质,使用分别含有所述生物体成分结合域(例如,不同的酶的底物结合部位)的“2种以上的探针”。用于探针的生物体成分结合域可根据分析目的进行合适的选择。
例如,如果在生物体组织的酶消化(分解)或细胞或细胞群的分离之前分析生物体组织,则将用于这种酶消化或细胞分离的蛋白质分解酶的底物结合域用于探针中。
作为在组织分解中所使用的蛋白质分解酶,例如可以列举胶原酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、植酸钙镁、嗜热蛋白酶等。作为胶原酶,具体地可以列举源自溶组织梭菌(Clostridiumhistryticum)的胶原酶G和胶原酶H、以及源自放线菌的胶原酶、源自产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的胶原酶等。对这些酶的底物结合部位的一级结构已经进行了较多的分析,通过使用这些信息,本领域技术人员可进行探针的设计。
与生物体组织结合的探针通过使用公知的分子成像技术而可视化,能够在不对组织造成损伤的情况下,简便地测定其结合量。根据所使用的成像技术,通过荧光分子、发光分子、和正电子核素等放射性同位素等适当的可视化分子对探针进行标记。关于探针的设计,将在下节中进行详细描述。
2种以上的探针可分别施用于生物体组织,也可同时施用。此外,其结合量的测定也是可分别进行,也可同时进行。但是,从测定的迅速简便的方面来看,优选将2种以上的探针用不同的可视化分子进行标记,同时施用于生物体组织,并同时测定其结合量。
在本发明中,将所述2种以上的探针施用于经分离的生物体组织中,分析该探针与生物体组织的结合量(亲和性),将其结果应用于生物体组织的分解、细胞或细胞群的分离中。例如,求出2种以上的探针与生物体组织的结合量比例,由该值确定用于该生物体组织的分解、细胞或细胞群的分离的酶的最适合量。探针的结合比与所使用的酶的用量比例具有相关性,结合比越高,酶的最适合用量比例也越高。但是,各种酶各自的单元数、效价(效力单位/mg)、最适温度、最适pH、作用时间不同,因此在这些因素和探针结合比的综合考虑下,来最终确定所使用的酶的用量比例。如果可求出本发明的探针结合比,本领域技术人员即可确定这种最适合用量比例。
2.生物体组织分析用探针组
本发明的探针组由2种以上的探针组成,各探针包括各自不同的生物体成分结合域(与特定的生物体成分结合的2种以上的蛋白质的该生物体成分结合域)、和选自包括荧光分子、发光分子、和正电子核素的放射性同位素的可视化分子。
根据分析的目的对酶的底物结合域进行合适的选择。如果在生物体组织的酶消化(分解)或细胞或细胞群的分离之前进行生物体组织的分析,则探针中使用这种酶消化或细胞分离中使用的蛋白质分解酶的底物结合域。
作为这种蛋白质分解酶,例如可以列举胶原酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、植酸钙镁、嗜热蛋白酶等。作为胶原酶,特别是可以列举源自溶组织梭菌(Clostridiumhistryticum)的胶原酶G和胶原酶H、以及源自放线菌的胶原酶、源自产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的胶原酶等。对这些酶的底物结合部位的一级结构已经进行了较多的分析,通过使用这些信息,本领域技术人员可进行探针的设计。作为一个实例,将源自溶组织梭菌(Clostridiumhistryticum)的胶原酶G和胶原酶H的氨基酸序列分别示于序列序号1和序列序号2中。
在探针中,优选包含1~100次、特别是1~20次底物结合域(例如,胶原结合域)或其一部分的重复。
作为可视化分子,可以使用用于分子成像技术中的荧光分子、发光分子和正电子核素。
作为荧光分子,例如可以使用GFP、EGFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、tdTomato、和RFP等荧光蛋白质、或Alexa350、二甲氨基香豆素、5/6-羧基-荧光素、Alexa488、ATTO488、DY-505、5/6-羧基荧光素、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、ATTO488、ATTO532、四甲基若丹明、Cy3、DY-505、DY-547、Alexa635、Alexa647、ATTO600、ATTO655、DY-632、Cy5、DY-647、Cy5.5等荧光标记物作为可视化分子。
作为发光分子,可以使用荧光素酶等发光酶。荧光素酶可以列举源自希根海萤、武装虾科(Hoplophoridae)、发光昆虫(萤火虫、发光蝗虫(ヒカリコメツキ)等)、发光蚯蚓、Latia、海香菇(ウミシイタケ)、多管水母属(发光水母)等各种发光生物的荧光素酶,但是也可以合适地使用具有与野生型荧光素酶不同的峰值波长和发光强度的改性荧光素酶。
GFP等荧光蛋白质为了产生荧光需要外部光源,但是荧光素酶可氧化荧光素而自发光。通过将这种荧光素酶与GFP结合,也可以开发在没有外部光源的情况下使GFP发光的技术,并应用这种技术(WO2004/22600、WO2004/052934)。
另外,关于可视化蛋白质,已知晓多种技术(WO01/46694、特表2006-518209号公告、特表2005-525111号公告、特开2008-283959号公告),也可以使用这些公知的技术。
作为放射性同位素,可以使用在利用PET的成像中使用的正电子核素等。作为正电子核素,例如可以列举15O、13N、11C、18F、62Cu、68Ga、82Rb等,可以使用PET探针中通用的公知的标记物。
在使用作为可视化分子的蛋白质分子的情况中,可以使生物体成分结合域(胶原结合域)与可视化分子形成融合蛋白质。融合蛋白质的制备方法在本领域中是公知的(上述NNishi,etal.,ProcNatlAcadSciUSA.;95(12):7018-7023(1998)、Tuanetal.,ConnectiveTissueReserch,34(1),1-9(1996)、Hanetal.,ProteinExpressionandPurification11,169-178),本领域技术人员根据这些公知技术,可以容易地制备融合蛋白质。
3.从生物体组织分离细胞或细胞群的方法
本发明还提供使用所述分析方法分析生物体组织,基于其分析结果确定所使用的酶的用量比例或作用时间,从而高效率地由生物体组织分离目标细胞或细胞群的方法。
探针的结合量暗示组织对酶的亲和性,因此由对各种酶的亲和性,可以根据目的预测酶的用量比例和作用时间等。
4.生物体组织分离用试剂盒
本发明还提供用于上述从生物体组织分离细胞或细胞群的方法的试剂盒。
本发明的试剂盒包括选自本发明的探针组、作为生物体组织分离中所使用的酶的、其底物结合域成为探针的构成要素的酶、缓冲液等本发明的生物体组织的分离方法所使用的试剂或仪器中的1种或2种以上作为组成要素。
实施例
以下,使用实施例更具体地说明本发明,但本发明不限于这些实施例。
[实施例1]制备使用EGFP的探针
[EGFP-ColGCBD探针的制备]
(1)EGFP-ColGCBD的构筑方法
首先,对于针对用EGFP标记的源自溶组织梭菌的胶原酶G的探针(EGFP-ColGCBD)的制备进行说明。
首先,基于FLAG序列合成2个低聚DNA:5'-TCGACGATTATAAAGATGATGATGATAAAT-3'(序列序号3)和5'-CTAGATTTATCATCATCATCTTTATAATCG-3'(序列序号4)。将各低聚DNA溶解于TE中以达到100μM,混合10μl的低聚DNA、3μl的10×T4多核苷酸激酶缓冲液(NipponGene公司制造)、0.3μl的0.1MATP、2μl的T4多核苷酸激酶(20U,NipponGene)、14.7μl的H2O,在37℃下保温1小时。从各反应液中取出10μl,进行混合。将混合的溶液在100℃下保持5分钟后,原样慢慢冷却至室温。将其作为***溶液1。
向10μl的pCold2(TAKARABio)中加入10μl的10×Tango缓冲液(Fermentas公司制造)、1μl的SalI(Fermentas)、1μl的XbaI(Fermentas)、28μl的H2O,在37℃下反应5小时。向反应结束后的反应液中加入150μl的TE,加入250μl的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)溶液,充分搅拌后,在室温下以16,000g离心5分钟,回收上清液。向回收的上清液中加入20μl3M乙酸钠溶液,加入450μl冷的乙醇。在冰上放置5分钟后,以16,000g在4℃下离心5分钟,回收沉淀。
将沉淀用冷的70%乙醇洗涤后、用40μl的H2O溶解。向其中加入5μl的10×BAP缓冲液(TOYOBO公司制造)、5μl的细菌碱性磷酸酶(TOYOBO),在65℃下反应1小时。将全部量反应液用于0.8%琼脂糖电泳中。电泳结束后,用溴乙锭溶液染色,确认条带的位置后,将其切出。从琼脂糖凝胶中的回收使用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒而进行。根据相同的方法,使用40μl的EB进行洗脱。
将得到的洗脱液作为载体溶液1。将9μl的载体溶液1和1μl的***溶液1、10μl的Ligationconvenience溶液(Nippongene)混合,在16℃下保温30分钟。使用该溶液转化大肠杆菌DH5α。将经转化的大肠杆菌接种到添加了通过0.22μm无菌过滤器灭菌的氨苄青霉素以使其在通过高压灭菌釜灭菌的2ml的LB培养基中的最终浓度为100μg/ml的培养基中,在37℃下培养过夜后,以10,000g离心1分钟,回收菌体。使用Viogene公司制造的miniplus质粒DNA提取试剂盒从经回收的菌体中回收质粒。用100μl的EB进行洗脱。向其中的10μl质粒溶液中混合2μl的10×Tango缓冲液、1μl的XbaI、7μl的H2O,在37℃下保持3小时。将反应液用于0.8%琼脂糖凝胶电泳、切出出现于4kbp附近的单独条带。使用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行回收。用50μl的EB进行洗脱。向10μl的洗脱液中加入10μl的Ligationconvenience溶液,在16℃下保持30分钟。
再次使用该溶液,转化大肠杆菌DH5α。将经转化的大肠杆菌接种到添加了通过0.22μm无菌过滤器灭菌的氨苄青霉素以使其在通过高压灭菌釜灭菌的2ml的LB培养基中的最终浓度为100μg/ml的培养基中,在37℃下培养过夜后,以10,000g离心1分钟,回收菌体。使用Viogene公司制造的miniplus质粒DNA提取试剂盒从经回收的菌体中回收质粒。用100μl的EB进行洗脱。向其中的10μl中混合3μl的10×K缓冲液(TAKARABio)、1μl的BamHI(TAKARABio)、1μl的EcoRI(TAKARABio)、15μl的H2O,在37℃下反应过夜。反应结束后,进行同等用量的苯酚/氯仿/异戊醇萃取,向得到的上层中加入3μl的3M乙酸钠,加入70μl冷的乙醇。在冰上放置5分钟后,以16,000g在4℃下离心5分钟,回收沉淀。将沉淀用冷的70%乙醇洗涤后,用40μl的H2O溶解。向其中加入5μl的10×BAP缓冲液(TOYOBO)、5μl的细菌碱性磷酸酶(TOYOBO),在65℃下反应1小时。将全部量的反应液通过0.8%琼脂糖电泳使用TAE缓冲液进行电泳,用溴乙锭溶液染色,确认条带的位置后,进行切出。从琼脂糖凝胶中的回收通过使用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行。根据相同的方法,使用30μl的EB进行洗脱。将该洗脱液作为载体溶液2。
另一方面,将0.5μl的100μM5'-AAAGAACGGATCCACAACAACACCTATAACTAAAG-3'(引物1:序列序号5)、和0.5μl的100μM5'-AAGCAGAGATGAATTCTTTATTTACCCTTAACTCATAG-3'(引物2:序列序号6)、1μl已经克隆的包含编码溶组织梭菌胶原酶G的基因全长的质粒、8μl的dNTP混合物(TAKARABio)、1.0μl的PrimeStarHS(TAKARABio)、20μl的5Mbetain、49μl的H2O混合,进行98℃、2min(第一阶段)、98℃、10sec(第二阶段)、55℃、5sec(第三阶段)、72℃、90sec(第四阶段),连续重复第二阶段至第四阶段35次。
将得到的PCR片段用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行纯化。用50μl的EB进行洗脱。向所得的洗脱液中的10μl中混合3μl的10×K缓冲液(TAKARABio)、1μl的BamHI(TAKARABio)、1μl的EcoRI(TAKARABio)、15μl的H2O,在37℃下反应过夜。将全部量的反应液通过0.8%琼脂糖电泳使用TAE缓冲液进行电泳,用溴乙锭溶液染色,确认条带的位置后,进行切出。从琼脂糖凝胶中的回收通过使用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行。根据相同的方法,使用30μl的EB进行洗脱。将该洗脱液作为***溶液2。
向5μl的载体溶液2和5μl的***溶液2中加入10μl的Ligationconvenience溶液,在16℃下反应30分钟。使用反应结束后的Ligation溶液转化大肠杆菌DH5α。将得到的转化株接种到添加了通过0.22μm无菌过滤器灭菌的氨苄青霉素以使其在通过高压灭菌釜灭菌的2ml的LB培养基中的最终浓度为100μg/ml的培养基中,在37℃下培养过夜后,以10,000g离心1分钟,回收菌体。使用Viogene公司制造的miniplus质粒DNA提取试剂盒从经回收的菌体中回收质粒。用100μl的EB进行洗脱。向其中的10μl中混合3μl的Tango缓冲液、1μl的SacI(Fermentas)、1μl的KpnI(Fermentas)、15μl的H2O,在37℃下反应过夜。反应结束后,进行同等用量的苯酚/氯仿/异戊醇萃取,向得到的上层中加入3μl的3M乙酸钠,加入70μl冷的乙醇。在冰上放置5分钟后,以16,000g在4℃下离心5分钟,回收沉淀。将沉淀用冷的70%乙醇洗涤后、用40μl的H2O溶解。向其中加入5μl的10×BAP缓冲液(TOYOBO)、5μl的细菌碱性磷酸酶(TOYOBO),在65℃下反应1小时。将全部量的反应液通过0.8%琼脂糖电泳使用TAE缓冲液进行电泳,用溴乙锭溶液染色,确认条带的位置后,进行其切出。从琼脂糖凝胶中的回收通过使用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行。根据相同的方法,使用30μl的EB进行洗脱。将该洗脱液作为载体溶液3。
将编码EGFP的基因作为模板,将5'-CGAAGGTGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCG-3'(引物3:序列序号7)、和3'-AGACTGCGGTACCGATCGATCTGAGTCCG-3'(引物4:序列序号8)作为引物、将20μl的5×PrimeStar缓冲液(TAKARABio)、1.0μl的pET-EGFP、0.5μl的100μM引物3、0.5μl的100μM引物4、8.0μl的dNTP混合物、1.0μl的PrimeStarHS、20μl的5Mbetain、49μl的H2O混合,进行98℃、2min(第一阶段)、98℃、10sec(第二阶段)、55℃、5sec(第三阶段)、72℃、90sec(第四阶段),连续重复第二阶段至第四阶段35次。
将得到的PCR片段用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行纯化。用50μl的EB进行洗脱。向所得的洗脱液中的10μl中混合3μl的Tango缓冲液、1μl的SacI(Fermentas)、1μl的KpnI(Fermentas)、15μl的H2O,在37℃下反应过夜。将全部量的反应液通过0.8%琼脂糖电泳使用TAE缓冲液进行电泳,用溴乙锭溶液染色,确认条带的位置后,进行切出。从琼脂糖凝胶中的回收通过使用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行。根据相同的方法,使用30μl的EB进行洗脱。将该洗脱液作为***溶液3。
向5μl的载体溶液3和5μl的***溶液3中加入10μl的Ligationconvenience溶液,在16℃下反应30分钟。使用反应结束后的Ligation溶液转化大肠杆菌DH5α。将得到的转化株接种到添加了通过0.22μm无菌过滤器灭菌的氨苄青霉素以使其在通过高压灭菌釜灭菌的2ml的LB培养基中的最终浓度为100μg/ml的培养基中,在37℃下培养过夜后,以10,000g离心1分钟,回收菌体。使用Viogene公司制造的miniplus质粒DNA提取试剂盒从经回收的菌体中回收质粒。用100μl的EB进行洗脱。使用所得到的洗脱液转化大肠杆菌BLR株(Novagen公司制造)。将所得到的转化株作为E.coliBLR/pCold2-EGFP-ColGCBD株。
(2)EGFP-ColGCBD的纯化
培养
将通过pCold2-EGFP-ColGCBD转化的大肠杆菌BLR株接种到添加了通过0.22μm无菌过滤器灭菌的氨苄青霉素以使其在通过高压灭菌釜灭菌的2ml的LB培养基中的最终浓度为100μg/ml的培养基中,在37℃下振荡培养过夜,将其作为预培养液。将预培养液接种到在500ml容积的带有挡板的锥形烧瓶中准备的170ml相同培养基中使得含量为1000分之1,在37℃下振荡培养直至OD660为0.6~1.0左右,添加通过0.22μm无菌过滤器灭菌的IPTG使得最终浓度为1mM,在15℃下振荡培养24小时。
回收
培养结束后,以10,000g离心5分钟来回收菌体。将回收的菌体悬浮于与培养液等量的pH为8.0的含有0.3MNaCl的50mM磷酸盐缓冲液中,再次以10,000g离心5分钟来回收菌体。再重复同样的操作两遍,洗涤菌体。将经洗涤的菌体悬浮于25ml同样的缓冲液中后,在200W的输出下在1分钟内,在冰上通过超声波破碎机破碎菌体。将破碎结束后的菌体以10,000g在4℃下离心10分钟,回收上清液。
纯化
将经菌体破碎的上清液用于CosmosilHis-accept(直径2.5×10cm)柱层析。用pH为8.0的含有0.3MNaCl的50mM磷酸盐缓冲液充分洗涤柱后,将pH为8.0的含有10mM咪唑且含有0.3MNaCl的50mM磷酸盐缓冲液等量施用至柱中。然后施用含有20mM咪唑的相同的缓冲液、含有30mM咪唑的相同的缓冲液、含有40mM咪唑的相同的缓冲液、含有50mM咪唑的相同的缓冲液、含有100mM咪唑的相同的缓冲液、含有500mM咪唑的相同的缓冲液,洗脱所吸附的蛋白质。通过使用SDS-PAGE和抗His6抗体(SantaCruz)的免疫印迹来确认各洗脱部分。其结果是,可在20-30mM咪唑洗脱部分中确认目标蛋白质,由此将其作为EGFP-ColGCBD蛋白质。图1(A)中示出ColGCBD,在序列表的序列序号9和10中示出EGFP-ColGCBD的碱基序列和氨基酸序列。
[实施例2]制备使用DsRed的探针
[DsRed-ColHCBD探针的制备]
(1)DsRed-ColHCBD的构筑方法
以下,对于针对用DsRed标记的源自溶组织梭菌的胶原酶H的探针(DsRed-ColHCBD)的制备进行说明。
基于C-myc序列合成2个低聚DNA:5'-TCGACGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAAGATCTGT-3'(序列序号11)和5'-CTAGACAGATCTTCTTCGCTAATCAGTTTCTGTTCG-3'(序列序号12)。将各低聚DNA溶解于TE中以达到100μM,混合10μl的低聚DNA、3μl的10×T4多核苷酸激酶缓冲液(NipponGene)、0.3μl的0.1MATP、2μl的T4多核苷酸激酶(20U,NipponGene)、14.7μl的H2O,在37℃下保温1小时。从各反应液中取出10μl,进行混合。将混合的溶液在100℃下保持5分钟后,原样慢慢冷却至室温。将其作为***溶液4。
向10μl的pCold2(TAKARABio)中加入10μl的10×Tango缓冲液(Fermentas公司制造)、1μl的SalI(Fermentas)、1μl的XbaI(Fermentas)、28μl的H2O,在37℃下反应5小时。向反应结束后的反应液中加入150μl的TE,加入250μl的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)溶液,充分搅拌后,在室温下以16,000g离心5分钟,回收上清液。向回收的上清液中加入20μl3M乙酸钠溶液,加入450μl冷的乙醇。在冰上放置5分钟后,以16,000g在4℃下离心5分钟,回收沉淀。
将沉淀用冷的70%乙醇洗涤后、用40μl的H2O溶解。向其中加入5μl的10×BAP缓冲液(TOYOBO公司制造)、5μl的细菌碱性磷酸酶(TOYOBO),在65℃下反应1小时。将全部量的反应液用于0.8%琼脂糖电泳中。电泳结束后,用溴乙锭溶液染色,确认条带的位置后,进行切出。从琼脂糖中的回收通过使用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行。根据相同的方法,使用40μl的EB进行洗脱。将得到的洗脱液作为载体溶液4。将9μl的载体溶液4和1μl的***溶液4、10μl的Ligationconvenience溶液(Nippongene)混合,在16℃下保温30分钟。
使用该溶液转化大肠杆菌DH5α。将经转化的大肠杆菌接种到添加了通过0.22μm无菌过滤器灭菌的氨苄青霉素以使其在通过高压灭菌釜灭菌的2ml的LB培养基中的最终浓度为100μg/ml的培养基中,在37℃下培养过夜后,以10,000g离心1分钟,回收菌体。使用Viogene公司制造的miniplus质粒DNA提取试剂盒从经回收的菌体中回收质粒。用100μl的EB进行洗脱。向其中的10μl质粒溶液中混合2μl的10×Tango缓冲液、1μl的XbaI、7μl的H2O,在37℃下保持3小时。将反应液用于0.8%琼脂糖凝胶电泳、切出出现于4kbp附近的单独条带。使用Viogene公司制造的凝聚/PCR纯化试剂盒进行回收。用50μl的EB进行洗脱。向10μl的洗脱液中加入10μl的Ligationconvenience溶液,在16℃下保持30分钟。再次使用该溶液,转化大肠杆菌DH5α。将经转化的大肠杆菌接种到添加了通过0.22μm无菌过滤器灭菌的氨苄青霉素以使其在通过高压灭菌釜灭菌的2ml的LB培养基中的最终浓度为100μg/ml的培养基中,在37℃下培养过夜后,以10,000g离心1分钟,回收菌体。使用Viogene公司制造的miniplus质粒DNA提取试剂盒从经回收的菌体中回收质粒。用100μl的EB进行洗脱。向其中的10μl中混合3μl的10×K缓冲液(TAKARABio)、1μl的BamHI(TAKARABio)、1μl的EcoRI(TAKARABio)、15μl的H2O,在37℃下反应过夜。反应结束后,进行同等用量的苯酚/氯仿/异戊醇萃取,向得到的上层中加入3μl的3M乙酸钠,加入70μl冷的乙醇。在冰上放置5分钟后,以16,000g在4℃下离心5分钟,回收沉淀。将沉淀用冷的70%乙醇洗涤后,用40μl的H2O溶解。向其中加入5μl的10×BAP缓冲液(TOYOBO)、5μl的细菌碱性磷酸酶(TOYOBO),在65℃下反应1小时。将全部量的反应液通过0.8%琼脂糖电泳使用TAE缓冲液进行电泳,用溴乙锭溶液染色,确认条带的位置后,进行切出。从琼脂糖凝胶中的回收通过使用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒而进行。根据相同的方法,使用30μl的EB进行洗脱。将该洗脱液作为载体溶液5。
另一方面,将0.5μl的100μM5'-GAATCTTCAGGATCCACTACTACTGCAGAAATAAAG-3'(引物5:序列序号13)、和0.5μl的100μM5'-AAGCAGAGATGAATTCTCTTCCTACTGAACCTTCTATATTAATTC-3'(引物6:序列序号14)、1μl已经克隆的包含编码溶组织梭菌胶原酶H的基因全长的质粒pCold2-ColH-His、8μl的dNTP混合物(TAKARABio)、1.0μl的PrimeStarHS(TAKARABio)、20μl的5Mbetain、49μl的H2O混合,进行98℃、2min(第一阶段)、98℃、10sec(第二阶段)、55℃、5sec(第三阶段)、72℃、90sec(第四阶段),连续重复第二阶段至第四阶段35次。
将得到的PCR片段用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行纯化。用50μl的EB进行洗脱。向所得的洗脱液中的10μl中混合3μl的10×K缓冲液(TAKARABio)、1μl的BamHI(TAKARABio)、1μl的EcoRI(TAKARABio)、15μl的H2O,在37℃下反应过夜。将全部量的反应液通过0.8%琼脂糖电泳使用TAE缓冲液进行电泳,用溴乙锭溶液染色,确认条带的位置后,进行切出。从琼脂糖凝胶中的回收通过使用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒而进行。根据相同的方法,使用30μl的EB进行洗脱。将该洗脱液作为***溶液5。
向5μl的载体溶液5和5μl的***溶液5中加入10μl的Ligationconvenience溶液,在16℃下反应30分钟。使用反应结束后的Ligation溶液转化大肠杆菌DH5α。将得到的转化株接种到添加了通过0.22μm无菌过滤器灭菌的氨苄青霉素以使其在通过高压灭菌釜灭菌的2ml的LB培养基中的最终浓度为100μg/ml的培养基中,在37℃下培养过夜后,以10,000g离心1分钟,回收菌体。使用Viogene公司制造的miniplus质粒DNA提取试剂盒从经回收的菌体中回收质粒。用100μl的EB进行洗脱。向其中的10μl中混合3μl的Tango缓冲液、1μl的SacI(Fermentas)、1μl的KpnI(Fermentas)、15μl的H2O,在37℃下反应过夜。反应结束后,进行同等用量的苯酚/氯仿/异戊醇萃取,向得到的上层中加入3μl的3M乙酸钠,加入70μl冷的乙醇。在冰上放置5分钟后,以16,000g在4℃下离心5分钟,回收沉淀。将沉淀用冷的70%乙醇洗涤后、用40μl的H2O溶解。向其中加入5μl的10×BAP缓冲液(TOYOBO公司制造)、5μl的细菌碱性磷酸酶(TOYOBO),在65℃下反应1小时。将全部量的反应液通过0.8%琼脂糖电泳使用TAE缓冲液进行电泳,用溴乙锭溶液染色,确认条带的位置后,进行切出。从琼脂糖凝胶中的回收通过使用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行。根据相同的方法,使用30μl的EB进行洗脱。将该洗脱液作为载体溶液6。
将pDsRed-monomer(Clontech公司制造)作为模板,将5'-GTACCGGTCGAGCTCATGGACAACACCGAGG-3'(引物7:序列序号15)、和3'-GTCGCGGCCGGTACCCTGGGAGCCGGAGTGGC-3'(引物8:序列序号16)作为引物、将20μl的5×PrimeStar缓冲液(TAKARABio)、1.0μl的pDsRed-monomer(Clontech公司制造)、0.5μl的100μM引物7、0.5μl的100μM引物8、8.0μl的dNTP混合物、1.0μl的PrimeStarHS、20μl的5Mbetain、49μl的H2O混合,进行98℃、2min(第一阶段)、98℃、10sec(第二阶段)、55℃、5sec(第三阶段)、72℃、90sec(第四阶段),连续重复第二阶段至第四阶段35次。
将得到的PCR片段用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行纯化。用50μl的EB进行洗脱。向所得的洗脱液中的10μl中混合3μl的Tango缓冲液、1μl的SacI(Fermentas)、1μl的KpnI(Fermentas)、15μl的H2O,在37℃下反应过夜。将全部量的反应液通过0.8%琼脂糖电泳使用TAE缓冲液进行电泳,用溴乙锭溶液染色,确认条带的位置后,进行切出。从琼脂糖凝胶中的回收通过使用Viogene公司制造的凝胶/PCR纯化试剂盒进行。根据相同的方法,使用30μl的EB进行洗脱。将该洗脱液作为***溶液6。
向5μl的载体溶液6和5μl的***溶液6中加入10μl的Ligationconvenience溶液,在16℃下反应30分钟。使用反应结束后的Ligation溶液转化大肠杆菌DH5α。将得到的转化株接种到添加了通过0.22μm无菌过滤器灭菌的氨苄青霉素以使其在通过高压灭菌釜灭菌的2ml的LB培养基中的最终浓度为100μg/ml的培养基中,在37℃下培养过夜后,以10,000g离心1分钟,回收菌体。使用Viogene公司制造的miniplus质粒DNA提取试剂盒从经回收的菌体中回收质粒。用100μl的EB进行洗脱。使用所得到的洗脱液转化大肠杆菌BLR(DE3)pLys株(Novagen公司制造)。将所得到的转化株作为E.coliBLR/pCold2-DsRed-ColHCBD株。
(2)DsRed-ColHCBD的纯化
培养
将通过pCold2-DsRed-ColHCBD转化的大肠杆菌BLR株接种到添加了通过0.25μm无菌过滤器灭菌的氨苄青霉素以使其在通过高压灭菌釜灭菌的2ml的LB培养基中的最终浓度为100μg/ml的培养基中,在37℃下振荡培养过夜,将其作为预培养液。将预培养液接种到在500ml容积的带有挡板的锥形烧瓶中准备的170ml相同培养基中使得含量为1000分之1,在37℃下振荡培养直至OD660为0.6~1.0左右,添加通过0.25μm无菌过滤器灭菌的IPTG使得最终浓度为1mM,在15℃下振荡培养24小时。
回收
培养结束后,以10,000g离心5分钟来回收菌体。将回收的菌体悬浮于与培养液等量的pH为8.0的含有0.3MNaCl的50mM磷酸盐缓冲液中,再次以10,000g离心5分钟来回收菌体。再重复同样的操作两遍,洗涤菌体。将经洗涤的菌体悬浮于25ml同样的缓冲液中后,在200W的输出下在1分钟内,在冰上通过超声波破碎机破碎菌体。将破碎结束后的菌体以10,000g在4℃下离心10分钟,回收上清液。
纯化
将经菌体破碎的上清液用于CosmosilHis-accept(直径2.5×10cm)柱层析。用pH为8.0的含有0.3MNaCl的50mM磷酸盐缓冲液充分洗涤柱后,将pH为8.0的含有10mM咪唑并含有0.3MNaCl的50mM磷酸盐缓冲液等量施用至柱中。然后施用含有20mM咪唑的相同的缓冲液、含有30mM咪唑的相同的缓冲液、含有40mM咪唑的相同的缓冲液、含有50mM咪唑的相同的缓冲液、含有100mM咪唑的相同的缓冲液、含有500mM咪唑的相同的缓冲液,洗脱所吸附的蛋白质。通过使用SDS-PAGE和抗His6抗体(SantaCruz)的免疫印迹来确认各洗脱部分。其结果是,可在20-30mM咪唑洗脱部分中确认目标蛋白质,由此将其作为DsRed-ColHCBD蛋白质。图1(B)中示出ColHCBD构造,序列表的序列序号17和18中示出DsRed-ColHCBD的碱基序列和氨基酸序列。
[实施例3]制备使用tdTomato的探针
(1)tdTomatoColHCBDDNA的制备和表达载体pColdII的***
tdTomato基因的模版DNA使用ptdTomato载体(Clontech公司)。在用于DNA扩增的PCR中,N末端的引物使用在tdTomato之前含有NdeI识别位点的序列34碱基(TomatoF)。C末端的引物使用在tdTomato之后具有代替终止密码子的BamHI识别位点的34bp(TomatoR)的互补链序列。各引物的序列在以下记载。
引物序列:
TomatoF:5’-CCGGTCGCCcatATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3’(序列序号19)
TomatoR:5’-AGAGTCGCGGCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCA-3’(序列序号20)
然后,将***了DsRed-ColHCBDDNA的pColdII用限制酶BamHI和XbaI处理,得到约1000bp的ColHCBDDNA片段。
将通过PCR制备的约1500bp的tdTomatoDNA用NdeI,BamHI进行处理,与ColHCBDDNA一起***用NdeI,XbaI处理过的表达载体pColdII中。通过菌落PCR和序列分析,确认构筑了所设计的质粒。另外,DNA序列分析委托OperonBiotechnologies公司。当将tdTomatoColHCBDDNA***pColdII时,表达为在N末端具有His-tag序列的蛋白质(图2)。也含有这些氨基酸序列的所设计的tdTomatoColHCBD为726残基(分子量82k)。
(2)表达菌的制备和蛋白质表达诱导
用通过上述方法构筑的tdTomatoColHCBD表达质粒转化大肠杆菌BLR。转化使用一般的热休克法。在含有100μg/ml的氨苄青霉素(Amp)的LB板上划线,在37℃下培养过夜。将已经生成的菌落在LB/Amp液体培养基中作次培养,在37℃下培养直到OD600达到0.5-0.7。将培养液在冰上冷却30分钟后,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)以使浓度为0.1mM,在15℃下继续培养24小时,诱导蛋白质的表达。
将24小时后的大肠杆菌培养液离心,回收菌体。将菌体用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次后,再次悬浮于PBS中,加入苯基甲烷磺酰氟(PMSF)以使浓度为0.1mM,一边用冰冷却一边通过超声波破碎菌体。将该菌体破碎液在12,000rpm下离心20分钟,将沉淀与上清液分离,通过SDS-PAGE来确认在可溶性部分中目标蛋白质的表达。向大肠杆菌的培养液中加入二甲基亚砜(DMSO),使其达到8%,在-80℃下冷冻保存。将其作为tdTomatoColHCBD表达用的冻结储用菌体。
(3)tdTomatoColHCBD的纯化
向用300mMNaCl/50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)平衡的Ni-NTA琼脂糖柱(φ2.0cmx5.0cm、柱容积15ml、QIAGEN公司)中,施用经平衡缓冲液将菌体破碎后的可溶性部分稀释3倍的溶液。用平衡缓冲液冲洗未吸附于载体的直接流过部分后,用含有50mM、200mM、500mM咪唑的缓冲液洗脱。进行各咪唑浓度部分的SDS-PAGE,为了确认在200mM咪唑洗脱部分中tdTomatoColHCBD被洗脱(图3),回收该部分,对50mMTris-HCl(pH8.0)进行透析。
将透析后的溶液施用于阴离子交换柱(HiTrapDEAEFF,C.V.=1ml、GEHealthCare公司),通过0-400mM的线性NaCl浓度梯度进行洗脱。通过SDS-PAGE从洗脱部分中回收存在tdTomatoColHCBD的部分(图4),使用Amicon30k(Millipore公司)通过超滤进行浓缩直至5mg/ml。将其作为纯化tdTomatoColHCBD。
(4)荧光光谱测量
tdTomato具有与DsRed相同的激发(554nm)、荧光(581nm)波长。tdTomatoColHCBD纯化酶溶液的激发、荧光光谱通过使用荧光分光光度计F-2500(日立高新技术公司)而测量(图5)。从光谱确认,没有发生由于表达为与CDB的融合蛋白质而导致的荧光波长移位或淬灭。另外,与使用DsRed的情况相比较,确认发出更强的荧光。
[实施例4]制备使用荧光素酶的探针
[PGV_ColGCBD和PGV-ColHCBD(荧光素酶-胶原结合域融合蛋白质)探针的制备方法]
(1)PGV_ColGCBD的构筑方法
1)荧光素酶-胶原结合域融合蛋白质DNA的制备、向表达载体pColdI中的***
荧光素酶基因的模版DNA使用Pica基因对照载体(PGV_对照)的荧光素酶编码区域(PGV)的序列。在用于DNA扩增的PCR中,N末端的引物使用在PGV之前含有NdeI识别位点(CATATG)的序列27碱基(PGVctrl_Nterm)。C末端的引物使用在PGV之后具有BamHI识别位点(GGATCC)代替终止密码子的30bp(PGV_CF_r)的互补链序列。
胶原酶(Col)G、H的胶原结合域(CBD)使用ColG、H的全长DNA***pColdIII中的质粒作为模版DNA。用于DNA扩增的PCR使用在CBD的N末端中加入BamHI识别位点的35碱基(ColG_Nterm,ColH_Nterm)的DNA作为N末端的引物。C末端的引物分别使用在ColGCBD之后依次加入Strep-tag的氨基酸序列、XbaI识别位点(TCTAGA)的序列(ColG_CtermStrep_comp)、和在ColHCBD之后依次加入FLAG-tag的氨基酸序列、XbaI识别位点的序列(ColH_CtermFLAG_comp)的互补链49碱基的DNA(图6)。
将通过PCR制备的约1,700bp的PGVDNA用NdeI,BamHI进行处理,将约1,000bp的CBDDNA用BamHI,XbaI进行处理,***用NdeI,XbaI处理的表达载体pColdI中(图7)。
通过菌落PCR和序列分析,确认构筑了所设计的质粒。另外,DNA序列分析委托OperonBiotechnologies公司完成。当DNA***pColdI时,表达为在N末端具有His-tag和FactorXa的识别序列的蛋白质。也含有这些氨基酸序列的所设计的融合蛋白质的大小为,PGVColGCBD为911残基(分子量101k),PGVColHCBD为883残基(分子量98k)。
2)表达菌的制备和蛋白质表达诱导
用***PGV和ColGCBD或ColHCBD的DNA的表达质粒转化大肠杆菌Rosetta2(DE3)。转化使用一般的热休克法。通过该转化观察到荧光素酶-胶原结合域融合蛋白质表达诱导。
在含有100μg/ml的氨苄青霉素(Amp)和34μg/ml的氯霉素(Cm)的LB板上划线,在37℃下培养过夜。将已经长成的菌落在LB/Amp/Cm液体培养基中作次培养,在37℃下培养直到OD600达到0.5-0.7。将培养液在冰上冷却30分钟后,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)以使浓度为0.1mM,在15℃下继续培养48小时,诱导蛋白质的表达。
将48小时后的大肠杆菌培养液离心,回收菌体。将菌体用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次后,再次悬浮于PBS中,加入苯基甲烷磺酰氟(PMSF)达到0.1mM,由此在最大强度下、以2秒间隔脉冲、在15分钟条件下进行超声波破碎。将该菌体破碎液在12,000rpm下离心20分钟,将沉淀与上清液分离进行SDS-PAGE,来确认蛋白质表达。SDS-PAGE的结果是,确认了被认为是PGV_ColGCBD(101k)和PGV_ColHCBD(98k)的大小的蛋白质条带(图8)。该条带也可通过使用抗His-tag抗体的免疫印迹法检测出。向可确认表达目标蛋白质的大肠杆菌的培养液中加入二甲基亚砜(DMSO)达到8%,在-80℃下冷冻保存。将其作为PGV_ColGCBD或PGV_ColHCBD的冻结储用菌体。
3)荧光素酶活性的确认
确认在转化株的菌体破碎后的上清液(粗品)中,存在具有荧光素酶活性的蛋白质。在本发明中所使用的荧光素酶显示出在550nm处具有最大值的发光光谱。将50mMTris-HCl(pH8.0)与粗品混合后,加入底物溶液(Tripluc荧光素酶检测试剂,东洋纺),立即随时间测定550nm的发光。荧光素酶的发光在加入底物溶液之后立即显示出最大值,其后不断衰减。测定发光的衰减直至达到几乎恒定的时间,其后还测定发光光谱(图9)。在作为与CBD的融合蛋白质表达时,也示出了与单独的PGV相同的发光。在刚破碎后得到的粗品中,观察到550nm强的发光。在-80℃冷冻保存的粗品中,发光渐渐变弱,但是确认与在4℃或-20℃下保存的粗品相比并没有失活。
(2)纯化方法
向用300mMNaCl/50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)平衡的Ni-NTA琼脂糖柱(直径2.0cmx5.0cm、柱容积15ml、QIAGEN公司)中,施用经平衡缓冲液将菌体破碎后的粗品稀释10倍的溶液。用平衡缓冲液冲洗未吸附于载体的直接流过部分后,用含有50mM、200mM、500mM咪唑的缓冲液洗脱。通过SDS-PAGE确认各咪唑浓度部分,200mM咪唑洗脱部分作为纯化PGV_ColGCBD或PGV_ColHCBD(图10)。
[实施例5]与胰脏组织的结合确认
将悬浮于100μl的50mMTris-HCl/5mMCaCl2(pH7.5)中的猪的胰脏组织片与100μl纯化酶溶液混合,在37℃下培养30分钟后,进行离心并将沉淀与上清液(sup.1)分离。将得到的沉淀悬浮于50mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)中,在室温下培养20分钟后,进行离心并将沉淀与上清液(sup.2)分离。进行所得到的沉淀和上清液的SDS-PAGE,确认tdTomatoColHCBD与胰脏组织的结合(图11)。
SDS-PAGE的结果是,在沉淀中观察到tdTomatoColHCBD条带,确认了与胰脏组织的结合。与胰脏组织结合的tdTomatoColHCBD分布于沉淀中,其他未结合的部分分布于sup.1中。另外,在sup.2中没有检测出条带,因此确认tdTomatoColHCBD即使在酸性pH的条件下,也与胶原纤维结合。
[实施例6]使用探针的生物体组织成分分析法
[生物体组成成分的测定方法]
说明本发明的生物体组成成分的测定方法。
(1)通过EGFP-ColGCBD和DsRED-ColH进行的生物体组成成分的测定方法
从去血死亡后的猪上取出胰脏,将切成5mm2的胰脏片段包埋于OCT化合物(SakuraFinetek公司制造)中,用液氮冷冻。其后,在低温恒温器CM3050S(ライカ公司制造)中,切片成厚度为8μm,粘接于显微镜用标本(松浪硝子工业有限公司制造)上。浸于用不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲溶液(PBS(-))调整至10%的***溶液(WAKO公司制造)中,在室温下培养10分钟,其后干燥30分钟。向玻璃制的池中加入PBS(-),在其中在室温下培养5分钟。将显微镜用标本留在润湿箱中以便无需注意干燥,在切片上浸泡200μlEGFP-ColGCBD溶液,在37℃下培养1小时。培养后,在PBS(-)中洗涤5分钟。将显微镜用标本用加入洗涤瓶中的PBS(-)冲洗,用VECTORSHELD(Vector公司制造)密封。其后,用荧光显微镜BIOLEVOBZ9000(キーエンス公司制造)观察,进行拍照。
(2)测定结果
结果示于图12中。与阴性对照相比,用EGFP-ColGCBD染色的组织良好地染色了组织存在的区域。
[实施例7]组织切片的测定方法
(1)观察方法
将固定有在-80℃下保存的大鼠胰脏组织切片的显微镜用标本在室温下浸泡于5mMCaCl2/TBS中10分钟,用Milli-Q洗涤。作为用于抑制非特异性结合的阻断,滴加100μl2%肌红蛋白(Myb),在37℃下预培养30分钟,用Milli-Q洗涤。将40μl蛋白质(GFP对照,GFPColGCBD,tdTomato对照,tdTomatoColHCBD)溶液和40μl2%Myb混合后,滴加在组织切片上,在37℃下培养30分钟。各蛋白质溶液的浓度调整为GFP对照10mg/ml、GFPColGCBD10mg/ml、tdTomato对照5mg/ml、tdTomatoColHCBD5mg/ml。
在室温下浸于5mMCaCl2/TBS10分钟,用Milli-Q洗涤。重复该过程2遍后,使用荧光显微镜BIOREVOBZ-9000(キーエンス公司)以200倍倍率进行观察,选择几个合适的区域、以0.5秒的曝光时间拍摄照片。
使用显微镜自带软件的测量功能,将所拍摄照片的全部亮度直方图化。在GFP对照和GFPColGCBD中只提取了绿色荧光的亮度,在tdTomato对照和tdTomatoColHCBD中只提取了红色荧光的亮度。
由该直方图,算出GFP对照和GFPColGCBD、tdTomato对照和tdTomatoColHCBD的亮度平均值的差值(delta平均亮度),对每个***进行总结。已显示出,所算出的delta平均亮度的数值越大,CBD与组织的结合越多,显示出与对照的荧光强度的差别明显。对该delta平均亮度进行比较,确认了根据各***、周龄,ColGCBD和ColHCBD对胰脏组织结合的差异。
(2)大鼠胰岛分离法
基于美国国家卫生研究所发行的《实验室动物护理和使用指南(1996年修订版)》(“GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals”)进行动物试验。使用体重239-268g的雄性Lewis大鼠(Slc、Japan)、体重255-301g的雄性SD大鼠(Slc、Japan)、体重197-231g的雄性Wistar-Furth大鼠(Slc、Japan)。
在取出胰脏前,比胆总管更中性的蛋白酶嗜热菌蛋白酶(0.322mg)不发生变化而将重组型的高纯度产品的ColG(5.46mg)和ColH(2.02mg)设定为酶含量标准比例(H/G比=0.37),设定相对于其10倍的组(ColG(4.96mg),ColH(18.34mg),嗜热菌蛋白酶(0.322mg),(H/G比=3.70)、1/10倍的组(ColG(5.51mg),ColH(0.20mg),嗜热菌蛋白酶(0.322mg),(H/G比=0.04)、ColG完全不含的组、ColH完全不含的组,注入冷的Hanks’平衡盐溶液(HBSS),使胰脏扩张。在加入10mL的HBSS后,在37℃下通过14分钟的温水浴使胰脏消化。进行使用连续Histopaque-1119(SigmaDiagnostics,St.Louis,MO,USA)和LymphoprepTM(NycomedPharmaAS,Oslo,Norway)的浓度梯度离心,收集胰岛存在的层。在通过胰岛分离操作所得到的组织中进行二苯基硫卡巴腙(Wako,Osaka,Japan)染色,识别胰岛和外分泌腺或导管等非胰岛组织,在显微镜的直接观察下计量各自的收率。分离胰岛的收率用胰岛当量(IEQ)表示(1IEQ根据国际标准定义为,相当于1个直径150μm的胰岛的大小)。
(3)实施结果
1)各种大鼠组织切片中GFPColGCBD和tdTomatoColHCBD的荧光亮度测定结果
各种大鼠中ColG和ColH的2种探针的荧光亮度及其比例记载于图13和表1中。
表1
2)各种大鼠中的胰岛分离结果
ColG和ColH的2种探针的荧光亮度的比H/G值在0.85以上的情况下,必须在相对于ColG的ColH的添加量(即ColH/G比)的最佳值下使用,但是在H/G值在0.8以下的情况下,ColH/G比的影响较小,发现即使不添加ColG也不会对胰岛收率产生大的影响,根据该数值,改变在各鼠种中在胰岛分离中使用的ColH和ColG的含量比,在胰岛分离实验中测定胰岛收率,其结果示于表2中。
表2
如表2所示,即使在完全不含ColG的条件下,也可在所有种类中进行胰岛分离,但是与之相对,在完全不含ColH的条件下,在所有种类中胰脏没有完全消化。其次,ColH/G的比对胰岛分离结果产生的影响判定为,在将H/G比设定为1/10的情况中,仅Wistar组的分离胰岛的收率显著降低(标准比的54.6%,p=0.009)。另外,在完全不含ColG的情况中,确保了为Wistar(75.5%)、SD(67.3%)、Lewis(54.2%)的顺序的分离胰岛收率,需要ColH的底物表达显示出Wistar>SD>Lewis的倾向。
如此,算出ColH和ColG的最适合使用量比,表明通过最适合地使用ColG和ColH的使用量,可高收率地分离胰岛。
[参考例]胶原酶的比例(ColH/ColG)对胰岛分离产生的影响
将大鼠的胰岛分离中所使用的2种胶原酶的比例(ColH/ColG)改为0、0.05、0.1、0.2、0.4,进行胰岛分离。其结果是,在示出收率和品质的ATP/DNA、体外糖负荷试验和胰岛素/DNA实验中可以确认,胶原酶的比例在0.1至0.2的范围内时,可高收率地分离高品质的胰岛。
在图14中示出了结果。A示出了收率。B的ATP/DNA为将胰岛自身所具有的能荷(ATP)用胰岛大小(DNA)校正的值。C的体外糖负荷试验,示出胰岛针对葡萄糖的胰岛素释放能力,反映胰岛的预备机能。D的胰岛素/DNA为将胰岛自身所具有的胰岛素量用胰岛大小(DNA)校正的值,但如果试剂等对胰岛具有毒性,则通常能够观察到发生胰岛脱颗粒,由此布置为胰岛的毒性试验中的一种。
迄今已报道,作为胰岛分离用酶的组成,溶组织梭菌产生的2种胶原酶(ColG和ColH)和1种中性金属蛋白酶是最适合的(糖尿病(Diabetes):46:1120:1997)。上述结果表明,2种胶原酶类型(ColG和ColH)的组成比例是决定胰岛分离的收率和品质的重要因素。
最适合胶原酶比例在大鼠以外的动物、猪、人中、甚至在相同的物种中也不相同,成为胰岛分离的成功率低的一个因素。因此,如果使用本发明的探针,在分离胰岛前预先测定所使用的胶原酶的最适合比例,则可算出待使用的胶原酶的使用量,在最适合比例下进行胰岛分离,从而可高收率地获得高品质的胰岛。
工业应用的可能性
根据本发明,由待分离的细胞外基质或脏器的蛋白质组成,可以正确且简便地知晓所使用的蛋白质分解酶的种类和用量,可在高活性的状态下分离目标细胞等。因此,本发明可用于包括胰岛移植等脏器移植、通过细胞移植的再生医学、细胞株的建立的治疗、诊断和检查等广泛用途。
本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请以其本身的形式作为参考引入本说明书中。
序列表文本
序列序号3:低聚DNA
序列序号4:低聚DNA
序列序号5:ColGCBD用的正向引物(引物1)
序列序号6:ColGCBD用的反向引物(引物2)
序列序号7:EGFP用的正向引物(引物3)
序列序号8:EGFP用的反向引物(引物4)
序列序号9:EGFP-ColGCBD
序列序号10:EGFP-ColGCBD
序列序号11:低聚DNA
序列序号12:低聚DNA
序列序号13:ColHCBD用的正向引物(引物5)
序列序号14:ColHCBD用的反向引物(引物6)
序列序号15:DsRed用的正向引物(引物7)
序列序号16:DsRed用的反向引物(引物8)序
序列序号17:DsRed-ColHCBD
序列序号18:DsRed-ColHCBD
序列序号19:tdTomato基因扩增用的正向引物(TomatoF)
序列序号20:tdTomato基因扩增用的反向引物(TomatoR)
Claims (16)
1.生物体组织的分析方法,其特征在于,对于与生物体成分结合的2种以上的蛋白质,将分别含有所述生物体成分结合域的2种以上的探针用于经分离的生物体组织上,分析所述各探针对于生物体组织的结合量,
其中生物体成分结合域为酶或酶的一部分。
2.权利要求1记载的方法,其特征在于,通过选自荧光分子、发光分子、和包括正电子核素的放射性同位素的可视化分子来标记探针。
3.权利要求2记载的方法,其中作为可视化分子包括选自GFP、EGFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、tdTomato、和RFP的荧光分子、和/或荧光素酶蛋白质。
4.权利要求2记载的方法,其中生物体成分结合域和可视化分子构成融合蛋白质。
5.权利要求1记载的方法,其中生物体成分结合域为蛋白质分解酶的胶原结合域。
6.权利要求1记载的方法,其特征在于,2种以上的探针分别或同时地作用于生物体组织上,以及分别或同时地测定各探针的结合量。
7.权利要求1记载的方法,其特征在于,2种以上的探针同时地作用于生物体组织上,并同时地测定各探针的结合量。
8.一种从生物体组织分离细胞或细胞群的方法,其特征在于,使用权利要求1-7任一项记载的方法分析生物体组织,基于所述分析结果确定酶的用量比例,将该用量比例的酶施用于生物体组织,从而分离细胞或细胞群。
9.探针组,其为由对于与生物体成分结合的2种以上的蛋白质、分别含有所述生物体成分结合域的2种以上的探针组成的生物体组织分析用探针组,其特征在于,各探针含有选自各自不同的荧光分子、发光分子、和包括正电子核素的放射性同位素的可视化分子,
其中生物体成分结合域为酶或酶的一部分。
10.权利要求9记载的探针组,作为可视化分子包括选自GFP、EGFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、tdTomato、和RFP的荧光蛋白质和/或荧光素酶蛋白质。
11.权利要求10记载的探针组,其中所述荧光素酶蛋白质具有与野生型荧光素酶不同的峰值波长和发光强度。
12.权利要求9记载的探针组,其中生物体成分结合域和可视化分子构成融合蛋白质。
13.权利要求9记载的探针组,其中生物体成分结合域为蛋白质分解酶的胶原结合域。
14.权利要求13记载的探针组,其中胶原结合域为源自梭菌属(Clostridium)的胶原酶的胶原结合域。
15.权利要求14记载的探针组,其中胶原结合域为源自溶组织梭菌(Clostridiumhistryticum)的胶原酶G和胶原酶H的胶原结合域。
16.权利要求15记载的探针组,其中胶原结合域为含有序列序号1所示的氨基酸序列、序列序号2所示的氨基酸序列、或序列序号1或序列序号2的部分序列的胶原结合域。
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