CN103554225B

CN103554225B - 一组人工合成的抗菌肽及其应用

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Publication number: CN103554225B
Application number: CN201310512916.0A
Authority: CN
Inventors: 俞超; 邓玮
Original assignee: QINGDAO KANGLAND BIOTECH Co Ltd
Current assignee: QINGDAO KANGLAND BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2013-10-25
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2033-10-25
Also published as: CN103554225A

Abstract

本发明涉及一种包含氨基酸序列VVKLY-cha-LPRP的抗菌肽，所述抗菌肽选自下述序列中的任一个氨基酸序列：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2。本发明的有益效果是:本发明所述的抗菌肽，具有高效广谱抑菌作用，低毒性。可作为抗生素替代品使用。

Description

一组人工合成的抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及分子微生物学领域，特别涉及一组人工合成的抗菌肽及其应用。

背景技术

抗菌肽（antimicrobial peptides）由20-60个氨基酸残基构成，分子量在2000-7000左右，是古老而广泛存在于生物界中的一种活性多肽。1972年，Boman在北美天蚕的血淋巴中发现了具有抗菌作用的多肽，这类抗菌肽被命名为天蚕素(Cecropins)。后来，人们发现抗菌肽是生物非特异性免疫的重要组成部分,细菌、真菌、原虫、植物、动物、乃至人类都能产生抗菌肽。依据不同的蛋白质序列组成和结构特点，抗菌肽可分为：α-螺旋型（α-helix），β-折叠型(β-sheet)，富含脯氨酸类(pro-rich)，环化类（loop）。已发现的抗菌肽作用机理包含桶板模型、环形孔模型，地毯模型等。抗菌肽的抗菌作用机制与传统抗生素不同。传统抗生素针对的是病原体的受体，作用靶点单一，抗生素靶点的改变会令抗生素失效。病原微生物的基因突变常能改变抗生素的靶点，产生耐药菌株。抗菌肽是一类多靶点的药物，目前发现的作用机理有破坏细胞膜、抑制生物大分子的合成、抑制胞内酶活性等，病原微生物难以获得抗药性，因为需要改变的靶点太多了。抗菌肽多靶点的作用机制，极大减少耐药菌株产生。抗菌肽抗菌谱广，具有抗多重耐药菌，真菌的作用，部分抗菌肽还具有抗病毒和肿瘤细胞的功能。随着人们对抗菌肽的研究进一步深入，新的抗菌肽类药物上市销售，更多的抗菌肽类药物进入临床实验阶段。其中，已上市的抗菌肽类药物包括广谱抗菌药物达托霉素、抗HIV药物T-20等。其中礼来公司研发的达托霉素于2003年上市，年销售额达4亿美元，罗氏公司开发的抗HIV药物T-20也达到了2.5亿美元。还有更多的抗菌肽类药物处于III期临床研究阶段。这显示了抗菌肽在药物开发领域的巨大潜力。

目前，人们对α-螺旋型的抗菌肽的机理研究较为透彻。α-螺旋型抗菌肽作用于病原微生物的细胞膜：带正电荷的α-螺旋型抗菌肽，吸附在带负电荷的细菌表面，***并裂解细菌胞膜，起到快速杀菌的作用。有多种假说用于解释α-螺旋型抗菌肽对细胞膜的破坏或增透过程,包括地毯模型(carpet model)，木桶-桶板模型(barrel-stavemodel)和曲面-孔模型(toroidal-pore model)。1992年，Y Pouny提出了地毯模型，他认为，多肽首先结合于细菌细胞膜，如同地毯覆盖一样平铺于细菌细胞膜的表面，干扰了细胞膜磷脂的有序排列，使细胞膜不稳定，改变膜流动性。抗菌肽浓度超过临界点时，细菌细胞膜将崩解。地毯模型认为：抗菌肽在作用过程中一直与膜磷脂的头部相互接触；抗菌肽分子没有***到质膜疏水核心；细胞膜以分解的方式被溶解破坏掉。G Ehrenstein于1977年提出了桶-板模型：开始抗菌肽与细胞膜表面平行，然后垂直于膜表面，以类似木桶侧板的方式定位。抗菌肽肽的疏水区与膜的疏水核心相结合，而多肽的亲水区域彼此相向，形成一个亲水孔道。K Matsuzaki在1995年提出了曲面-孔道模型：抗菌肽以垂直于膜表面的角度***膜内形成孔道。多肽的亲水域与磷脂头部结合，多肽的疏水域与膜磷脂的疏水核心结合。由多肽分子和磷脂分子共同组成一个孔道结构，造成细菌胞内物质泄漏而死亡。2003年，KJ Hallock研究抗菌肽Magainin的作用机制，结果支持了曲面-孔道模型。

多年来，抗菌肽的构效研究，一直是抗菌肽研究的热点之一。人们通过调整天然抗菌肽的结构，来达到提高活性，减低毒性的目的。然而，设计的结果仍不尽如人意。事实上，抗菌肽仍没有一个通过临床实验的药物能够上市销售。

目前比较流行的设计思路，过分聚焦于抗菌肽的某些理化性质，如碱性，螺旋度等方面；却很少围绕天然抗菌肽的核心序列进行设计。而围绕“核心”的设计思路在抗生素的改造工作中大获成功。现在临床使用的抗生素如大环内酯类，头孢类，氟喹诺酮类，均围绕核心基团经逐步设计修饰得到。在这一过程中，药物活性也逐步提高，机理日渐明晰。如氟喹诺酮类抗生素，最新一代比之最初，活性已提高千倍。有鉴于此，我们将能结合细菌胞内保守的分子伴侣如Dnak，GroE等相关蛋白的，以富含疏水性氨基酸的序列作为核心序列，以α-螺旋序列或脯氨酸螺旋等序列对该核心序列进行组合与修饰，从而得到新的高活性，低毒性的抗菌肽。α-螺旋型抗菌肽作用靶点是病原微生物的细胞膜。α-螺旋型抗菌肽带正电荷，能与带负电荷的细菌表面吸附，***并裂解细菌细胞膜。起到快速杀菌的作用。然而α-螺旋型抗菌肽与膜的作用十分复杂，其作用机理尚存争议，目前尚难以定量地设计得到高活性，低毒性，足以作为药物使用的α-螺旋型抗菌肽。富含脯氨酸类的抗菌肽apidaecin,droscin、pyrrhocoricin具有明显的开发价值：它们的机理独特，对革兰氏阴性菌杀伤力强，且副作用极小。此类多肽的作用靶点是细菌胞内的保守的分子伴侣蛋白如Dnak,从而影响细菌蛋白的正确折叠。通过结合α-螺旋型抗菌肽干扰细菌细胞膜，加强细菌通透性，以及富含脯氨酸型抗菌肽的渗透革兰氏阴性菌细胞膜、结合胞内大分子的特性，得到高活性、低毒性的新抗菌肽。设计两亲性α-螺旋型序列，富含脯氨酸型抗菌肽靶向细菌内保守蛋白大分子。将其组合构建诸如：核心序列-螺旋或螺旋-核心序列的抗菌肽。这样新的人工序列，结合α-螺旋型抗菌肽加强细菌通透性作用的特性，以及靶向胞内分子伴侣蛋白的抗菌肽干扰细菌蛋白正确折叠从而影响其行使正常的生物功能而起到杀菌作用，得到高活性的新型抗菌肽。新的抗菌肽依靠α-螺旋型序列与脯氨酸螺旋的的增透作用，有效解决了脯氨酸型抗菌肽穿膜效率低的问题；而核心序列中的脯氨酸铰链结构能减少抗菌肽的螺旋度，从而减少抗菌肽的毒性。我们构建了多条抗菌肽，经过试验发现该专利中所述的2条序列，抑菌活性明显，且其中有多肽与抗生素水平相当，杀菌作用迅速，毒性低，非常有望开发成新一代的绿色环保的抗菌药物。

β-环己基丙氨酸，即β-cyclohexyl-alanine，简写为Cha。β-环己基丙氨酸分子量171.24，分子式C₉H₁₇NO₂，为非天然氨基酸的一种。核心序列中采用Cha，有助于提高核心序列与生物大分子的结合力，从而提高多肽的抗菌能力。

β-环己基丙氨酸化学式：

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供兼具α-螺旋型抗菌肽高活性，与富含脯氨酸型抗菌肽低毒性的一组抗菌肽。

本发明采用如下技术方案：

一种包含氨基酸序列VVKLY-cha-LPRP的抗菌肽，所述抗菌肽选自下述序列中的任一个氨基酸序列：

SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2。

一种如上所述的抗菌肽的应用，所述抗菌肽具有抑制细菌的作用。

如上所述抗菌肽具有抑制***和革兰氏阴性细菌的作用。

一种如上所述的抗菌肽的应用，用于制备抗菌剂。

一种如上所述的抗菌肽的应用，用于制备饲料添加剂。

一种如上所述的抗菌肽的应用，用于制备化妆品添加剂。

一种如上所述的抗菌肽的应用，用于制备食品添加剂。

一种如上所述的抗菌肽的应用，用于制备保健品添加剂。

本发明的有益效果是:

本发明所述的抗菌肽，具有高效广谱抑菌作用，低毒性。可作为抗生素替代品使用。

附图说明：

图1为抗菌肽NO1的质谱图；

图2为抗菌肽NO2的质谱图；

图3为抗菌肽N01、N02与氨苄西林对大肠杆菌的杀菌速度对比柱状图；

图4为抗菌肽N01、N02与氨苄西林对金黄色葡萄球菌的杀菌速度对比柱状图。

具体实施方式

下面集合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

实施例1

目前线性α-螺旋型抗菌肽靶点位于细菌细胞膜，存在毒性偏高，活性不足的问题；而富脯氨酸型抗菌肽靶点为细菌胞内保守生物大分子，毒性虽低，但活性亦较低。鉴于上述两类抗菌肽作用靶点不同，存在互补的作用。我们设计了一段全新的，能结合细菌胞内保守的大分子，如Dnak，GroE的多肽序列VVKLY--cha--LPRP，作为核心序列。而后用常见的α-螺旋序列与脯氨酸螺旋序列，对该核心序列进行组合与修饰，从而得到新的、结构为核心序列-螺旋的抗菌肽。

形如核心序列-螺旋的抗菌肽为新的人工序列，结合螺旋结构抗菌肽加强细菌通透性作用的特性，以及核心序列结合细菌胞内大分子，干扰细菌蛋白合成的作用。其中，VVKLY--cha--LPRP的VVKLY--cha--L序列，可结合细菌胞内大分子，如Dnak，GroE等；而PRP是脯氨酸铰链结构，可减少抗菌肽的螺旋度，增加多肽序列的柔性，从而减低其毒性。

新的抗菌肽依靠α-螺旋型序列或脯氨酸螺旋的增透作用，有效解决了脯氨酸型抗菌肽穿膜效率低下的问题，而核心序列中的脯氨酸铰链结构能减少抗菌肽的螺旋度，从而减少抗菌肽的毒性。经过试验，我们构建了以下2条序列，抑菌活性明显，与抗生素水平相当，且杀菌作用迅速，毒性低。

本实施例中共有2个抗菌肽，如下所示：

NO1：

SEQ ID NO.1：Lys Val Val Lys Leu Tyr Cha Leu Pro Arg Pro Arg Pro ProArg Arg Ile Tyr Asp Arg；分子量：2574.0

NO2：

SEQ ID NO.2：Lys Val Val Lys Leu Tyr Cha Leu Pro Arg Pro Arg Val HisArg Leu Leu Arg Lys；分子量：2423.9

实施例2

将实施例1所述的2条抗菌肽用多肽合成仪进行合成，选用固相有机合成，合成方向从C端到N端逐一进行，采用Fmoc保护合成法，具体步骤如下：

称取Fmoc树脂0.1mmol，装柱，再按照抗菌肽的氨基酸序列，从C端至N端，将氨基酸置于多肽合成仪中。于室温20℃，首先用20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺（DMF）溶液将Fmoc脱保护，再用DMF溶液进行清洗。将Fmoc的游离氨基酸溶解，活化并上柱循环偶合反应，DMF溶液清洗。重复活化、缩合，脱保护、洗涤这一系列过程直至多肽合成结束。

取下反应后的树脂，加裂解液（88%三氟乙酸，5%苯酚，5%水，2%异丙基硅烷），室温反应3h，过滤，收集滤液，加入***沉淀，4000转/10分钟离心收集沉淀，干燥。

抗菌肽的纯化：

将干燥后的抗菌肽，加入0.1%三氟乙酸溶解，反向柱分离（洗脱液为20%-80%乙腈的0.1%三氟乙酸，梯度洗脱），收集洗脱峰。经鉴定，合成多肽纯度达90%。

质谱鉴定：将上述得到的多肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图（图1、图2）中显示的分子量与实施例1中的理论分子量一致。

实施例3

抗菌肽的杀菌活性检测

以下实施例中所用的菌种大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，藤黄微球菌购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；铜绿假单胞菌购自广州市微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌O78，鸡白痢沙门氏菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

采用CLSI介绍的微量肉汤法，以抗生素氨苄西林，阿米卡星，氯霉素，卡那霉素为对照。以固相合成法合成了2条多肽，测定了多肽的杀菌活性。

取甘油菌种，在LB平板上划线，37℃培养过夜，挑取单克隆接种于LB液体培养基内，37℃，120rpm摇菌过夜。将菌液稀释至cfu=1*10⁶/ml，备用。将多肽或抗生素在96孔细胞培养板上倍比稀释，每孔50ul，每孔加入50ul菌液。此时多肽或抗生素梯度为：256ug/ml，128ug/ml，64ug/ml，32ug/ml，16ug/ml，8ug/ml，4ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml，0.25ug/ml，0ug/ml；每孔菌液终浓度为：cfu=5*10⁵/ml。将96孔细胞培养板加盖置于恒温培养箱内37℃孵育16h。

表1抗菌肽和抗生素的最小抑菌浓度（MIC，单位ug/ml）

表中用最小抑菌浓度值（MIC）表征抗菌肽的抗菌能力，MIC值愈小则说明抗菌能力愈强。由上表可见，本发明抗菌肽的抗菌能力强，特别是抗菌肽N02，超过了一般的抗菌肽，达到了常用抗生素的水平。提示核心序列起效。从效果看，抗菌肽N01与N02作为抗生素替代药物应用。

实施例4

抗菌肽的杀菌动力学检测

对杀菌能力强的抗菌肽，我们以抗生素氨苄西林为对照，检测其杀菌动力学曲线，分析其杀菌速度。

抗菌肽的杀菌动力学以金黄色葡萄球菌CMCC26003与大肠杆菌CMCC44102检测，将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌培养至对数期，而后稀释至CFU=1.5*10⁷/ml，而后加入抗菌肽N01与N02，以氨苄西林为对照，使之浓度为120ug/ml，每小时取菌液100ul分别稀释10³、10⁴、10⁵倍后，各取50ul，涂板，置于37℃恒温培养箱中静置培养16h，计数。培养板上的细菌在30-300之间视为有效。按有效培养板的稀释倍数，分别乘以2*10³或2*10⁴或2*10⁵，得到细菌的CFU/ml，计算细菌存活率。细菌存活率计算方法如下：存活率=（实验组每小时菌量（CFU/ml）/实验组初始菌量（CFU/ml））*100%。

结果如表2和表3（图3、图4）所示

表2抗菌肽N01、N02与氨苄西林对大肠杆菌CMCC44102的杀菌速度对比

名称	0h存活率	1h存活率	2h存活率	3h存活率
					N01	100%	3%	2%	0%
N02	100%	1%	0%	0%
					氨苄西林	100%	30%	18%	16%

表3抗菌肽N01、N02与氨苄西林对金黄色葡萄球菌CMCC26003的杀菌速度对比

	0h存活率	1h存活率	2h存活率	3h存活率
					N01	100%	9%	4%	0.75%
N02	100%	2%	0%	0%
					氨苄西林	100%	15%	14%	12%

实验结果表明，在相同的浓度条件下（均为120ug/ml），抗菌肽N01、N02对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的杀菌速度大大超过抗生素氨苄西林，且抗菌肽N02速度快于N01。对大肠杆菌CMCC44102的杀菌曲线结果可见，抗菌肽N01在1h能杀菌97%，抗菌肽N02能杀菌99%，而氨苄西林仅能杀70%。在3h时，抗菌肽N01与N02均能杀菌100%，而氨苄西林能杀菌84%。对金黄色葡萄球菌CMCC26003的杀菌曲线结果可见，抗菌肽N01在1h能杀菌91%，抗菌肽N02能杀菌98%，而氨苄西林仅能杀85%。在3h时，抗菌肽N01杀菌99.25%，N02杀菌100%，而氨苄西林杀菌88%。杀菌动力学的结果说明，抗菌肽N01和N02与抗生素氨苄西林相比，杀菌更快，更彻底，有望作为抗生素替代药物使用。

实施例5

抗菌肽的体外溶血活性检测

抗菌肽的体外溶血活性检测方法如下：用AA肉鸡静脉采血2ml，加20倍阿氏液抗凝，1000rpm，10min离心，弃上清。红细胞沉淀以20倍生理盐水清洗，再1000rpm，10min离心，重复清洗3次。而后1000rpm，10min离心，收集红细胞沉淀，以pH=7.4的PBS溶液重悬，配置成8%的鸡红细胞悬液。取1000ul8%的鸡红细胞悬液于无菌的尖底离心管中，加入等量的抗菌肽溶液，37℃孵育1小时，1000rpm离心10分钟，吸取1000ul上清液加入比色皿中，414nm测OD值。阴性对照用PBS，阳性对照用1%的Triton X-100，计算溶血率。

溶血活性=（多肽OD414-Triton X-100OD414）/（PBS OD414-TritonX-100OD414）*100%，实验结果如表4：

表4抗菌肽溶血率

表中抗菌肽的溶血率值越小，则代表抗菌肽的安全性越高。从实

验结果看，增加的脯氨酸铰链PRP确实起到了减低溶血率的作用：实验中使用的抗菌肽浓度（100ug/ml、200ug/ml、500ug/ml）明显大于其抗菌活性，说明抗菌肽能够安全的在体内使用，而不会产生副作用。

Claims

1.一种包含氨基酸序列VVKLY-cha-LPRP的抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽选自下述序列中的任一个氨基酸序列：

SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2。

2.如权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽具有抑制细菌的作用。

3.如权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽具有抑制***和革兰氏阴性细菌的作用。

4.如权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽用于制备抗菌剂。