CN103550792B

CN103550792B - 检测线粒体细胞色素c的双功能纳米探针及其制备方法

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Publication number: CN103550792B
Application number: CN201310517991.6A
Authority: CN
Inventors: 张薇薇; 许乙凯
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-10-28
Filing date: 2013-10-28
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2033-10-28
Also published as: CN103550792A

Abstract

本发明涉及检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针及其制备方法。其中，制备方法包括：取线粒体细胞色素C的配体，在其两端分别标记上荧光素和醛基，再向其中加入磁小体，并孵育过夜，后除去未反应物，再向其中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺和甲氧基-羧基化-聚乙二醇，并孵育过夜，后除去未反应物，得到检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针。探针为利用上述方法制得的探针。本发明提供的检测线粒体细胞色素C的探针及其制备方法，生物相容性好，制得的检测线粒体细胞色素C的探针分散性好。

Description

检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及磁共振成像领域，具体而言，涉及检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针及其制备方法。

背景技术

检测细胞的技术包括很多种，例如磁共振成像。磁共振成像是利用磁共振原理，通过外加梯度磁场检测所发射出的电磁波，据此可以绘制成物体内部的结构图像。其所用的探针大多数含有超顺磁性的物质，目前这些探针所用的超顺磁性物质通常为：人工合成的Fe₃O₄纳米颗粒。由于这种人工合成的Fe₃O₄纳米颗粒的生物相容性差，因此将含上述纳米颗粒的探针植入生物体后，会使生物体产生较大的排异反应。

发明内容

本发明的目的在于提供检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针及其制备方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的制备方法，包括下列步骤：

步骤A：取线粒体细胞色素C的配体，在其两端分别标记上荧光素和醛基，得到第一产物；

步骤B：将第一产物与磁小体混合，并孵育过夜，后除去未反应物，得到第二产物；

步骤C：向第二产物中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺和甲氧基-羧基化-聚乙二醇，并孵育过夜，后除去未反应物，得到检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针。

在本发明的实施例中还提供了检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针，其采用上述方法制备而成。

本发明上述实施例的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针及其制备方法，至少可以达到以下技术效果：

生物相容性好：该制备方法所用的铁磁性物质为磁小体，磁小体是趋磁细菌细胞内合成的磁性纳米粒子，成分为Fe₃O₄，其由生物膜包被，由于生物膜与生物体相容，因此被生物膜包被的磁小体与生物体的相容性较好，进而降低了生物体对利用磁小体制得的探针的排异反应。此外，由于每一种趋磁细菌所合成的磁小体大小和形态是均一的，因此制得的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针分散性好。此外，利用磁小体制备的探针具有优良的T₂缩短效应，经检测其水质子R₂驰豫效率为1062.264（mmol^-1·L·s^-1）。另外，上述方法得到的探针中还偶联了聚乙二醇（PEG），而PEG具有较好的两亲性，可以进一步提高探针的生物相容性，且可以延长探针在生物体内的代谢时间。

附图说明

图1示出了本发明实施例中第一产物的结构示意图；

图2示出了本发明实施例中磁小体的结构示意图；

图3示出了本发明实施例中第二产物的结构示意图；

图4示出了本发明实施例中检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的结构示意图；

图5示出了本发明实施例一的一个化学反应原理示意图；

图6示出了本发明实施例一的另一个化学反应原理示意图；

图7示出了本发明试验例中磁小体的电子显微镜图；

图8示出了本发明试验例中得到的终产物PEG-cBMP的电子显微镜图；

图9示出了本发明试验例中细胞核荧光染色后的显微镜图；

图10示出了本发明试验例中细胞浆荧光染色后的显微镜图；

图11示出了本发明试验例中吞噬PEG-cBMP颗粒的胞浆荧光染色后的显微镜图；

图12示出了本发明试验例中细胞核和细胞浆荧光染色图融合后的显微镜图；

图13示出了本发明试验例中PEG-cBMP中铁浓度与MDA-MB-231细胞磁共振成像下横向弛豫时间倒数的线性关系图；

图14示出来了本发明试验例中PEG-cBMP靶向MDA-MB-231细胞线粒体的超薄电子显微镜图；

图15示出来了本发明试验例中PEG-cBMP靶向MDA-MB-231细胞线粒体的普鲁士蓝光学显微镜图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

下文中的“探针”是指本发明的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针。

实施例一

该实施例提供了检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的制备方法，包括下列步骤：

步骤101：取线粒体细胞色素C的配体，并在其两端分别标记上荧光素和醛基，得到第一产物；

步骤102：将第一产物与磁小体混合，并孵育过夜，后除去未反应物，得到第二产物；

步骤103：向第二产物中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺和甲氧基-羧基化-聚乙二醇，并孵育过夜，后除去未反应物，得到检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针。

上述方法的反应原理为：

在制备探针之前，已通过表征得知，磁小体是一种具有脂性包膜的铁磁性链状排列的纳米颗粒，且其包膜上具有羟基（—OH）、酰胺基（C=O）、烷基（C—H，C—H₂）、氨基（N—H）、酰胺键（C—N）等多种活性基团。

利用上述磁小体的性质，通过步骤101，先在线粒体细胞色素C的配体的两端分别标记上荧光素和醛基，标记上的醛基用来与磁小体的包膜上的羟基反应，从而通过步骤102，荧光素、线粒体细胞色素C的配体与磁小体连接在一起，形成第二产物。最后，在步骤C中，向第二产物中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和甲氧基-羧基化-聚乙二醇（H₃C-O-PEG-COOH），孵育过夜，该过程中发生化学反应，使PEG连接在磁小体的包膜上，最终制得了本发明的探针。

为更清楚地说明上述反应原理，本发明还提供了两个化学反应的示意图，步骤102的反应过程如图5所示，步骤103的反应过程如图6所示。其中，图1是第一产物的结构示意图，图2是磁小体的结构示意图，图3是第二产物的结构示意图。图4是本发明的探针的结构示意图。

采用以上方法得到的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针至少可以达到以下技术效果。

特异性：探针中含有线粒体细胞色素C的配体，该配体可特异性结合线粒体细胞色素C，因此得到的探针可以特异性检测线粒体细胞色素C。

生物相容性好：该制备方法所用的铁磁性物质为磁小体，磁小体是趋磁细菌细胞内合成的磁性纳米粒子，成分为Fe₃O₄，其由生物膜包被，由于生物膜与生物体相容，因此被生物膜包被的磁小体与生物体的相容性较好，进而降低了生物体对利用磁小体制得的探针的排异反应。此外，由于每种趋磁细菌所合成的磁小体大小和形态是均一的，因此制得的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针分散性好。此外，利用磁小体制备的探针用作磁共振对比剂，具有优良的T₂缩短效应，经检测其水质子R₂驰豫效率为1062.264（mmol^-1·L·s^-1）。另外，上述方法得到的探针中还偶联了聚乙二醇（PEG），而PEG具有较好的两亲性，可以进一步提高探针的生物相容性，且可以延长探针在生物体内的代谢时间。

双重检测功能：上述方法得到的探针中既含有荧光素，因而可以使探针发射荧光，又含有铁磁性物质—磁小体，因而使探针具有铁磁性。因此，将上述探针植入生物体后，既可以利用荧光检测仪检测，也可以利用核磁共振仪检测。并且还可以利用该双重检测功能验证探针是否进入靶标细胞内。其中，当靶标细胞深藏于组织内部时，需要较高能量的激发光源才能检测到探针发射的荧光，而此时会产生很强的背景噪音，因此采用本发明的探针检测时，通常采用荧光检测仪验证探针是否进入靶标细胞内，再采用核磁共振仪定量检测线粒体细胞色素C的相关数据。

上述方法中，线粒体细胞色素C的配体可采用多种核苷酸序列，只要满足与线粒体细胞色素C互补的条件。例如可优先采用如下的序列：5’-CCG TGT CTG GGG CCG ACC GGC GCA TTG GGT ACG TTG TTG C-3’，其与线粒体细胞色素C有较高的互补性。另外，步骤101可采用现有的方法进行标记，例如：修饰基团醛基直接在配体的5'端用单体合成，与引物碱基的-OH连接。荧光素在合成时，是用3'AMN-CPG先合成；然后在随后的纯化进行时，再接相应的酯，该修饰只能在碱基T进行。CPG，即可控微孔玻璃珠，是3’端固相载体，3'AMN是3'氨基末端。

此外，上述方法中的荧光素也可采用多种荧光素，例如艾利克斯荧光素647（Alexa Flour 647），具有远红外波长特征。

实施例二

步骤201：取线粒体细胞色素C的配体，并在其两端分别标记上荧光素和醛基，得到第一产物；

步骤202：将第一产物与磁小体以3:7（质量比例）混合，再孵育过夜，后用磁铁吸附混合物，得到吸附物，再将吸附物漂洗，得到第二产物；其中，孵育的条件为：在避光条件下每隔50-200s超声20s，超声的功率为20-80w。

步骤203：向第二产物中加入EDC、NHS和H₃C-O-PEG-COOH，再孵育过夜，后用磁铁吸附混合物，得到吸附物，再将吸附物漂洗，得到检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针；其中，孵育的条件为：在避光条件下每隔50-200s超声20s，超声的功率为20-80w，EDC、NHS、H₃C-O-PEG-COOH、第二产物中的磁小体的质量比例为：3:3:3:1。

该实施例的方法相比实施例一，优化了以下条件：

各反应物的配比，采用该配比得到的产物率更高，且探针的靶向性和检测灵敏度更高。其中，在步骤203中，描述配比时，第二产物中的磁小体是指通过步骤202的反应连接在第二产物上的磁小体。

孵育条件，该方法中的孵育条件可以缩短反应时间。

纯化，通过磁铁吸附和除杂可以去除未反应物及其它杂质，进而提高了产物的纯度。

实施例三

该实施例提供了一种检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针，该探针可采用上文的任意方法制备而成。

此外，为了更进一步说明本发明的技术效果，以下还提供了具体的试验例。

在该试验例中，为描述方便，将本发明检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针简称为“PEG-cBMP”。

试验方法：

将本发明的探针与乳腺癌细胞株MDA-MB-231混合，孵育，再通过激光共聚焦显微镜（CLSM）和电镜观察，观察本发明的探针对细胞的线粒体靶向性。再进行磁共振成像，观察本发明的探针对MDA-MB-231的影响。

试验结果：

磁小体修饰前后的结构变化

在电子显微镜下（60.0K倍）观察磁小体，其结构如图7所示，可以看出纯化磁小体颗粒的包膜较薄，厚约4nm。在修饰之后得到的探针（检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针）如图8（60.0K倍的电子显微镜图）观察所示，可知经过线粒体细胞色素C的配体、荧光素和PEG改性修饰后得到的探针的包膜明显增厚，约10nm。

靶向性

经过PEG-cBMP(λ_激发/λ_发射=650/665)孵育的MDA-MB-231细胞，再依次经线粒体绿色荧光探针Mito-tracker green(λ_激发/λ_发射=490/516)及核染料Hoechst 33342(λ_激发/λ_发射=360/460)孵育后，立即进行CLSM观察。结果如图9-12所示：可以看到细胞核呈明显的蓝色荧光（核染料Hoechst33342发射的荧光）（图9），细胞浆呈绿色荧光（图10），吞噬PEG-cBMP颗粒的胞浆内可见到分散的点状红色荧光（图11），图像融合后我们可以看到部分绿色与红色重叠区域呈黄色荧光（图12）。通过多次试验观察，发现PEG-cBMP对线粒体的标记率为100%。

PEG-cBMP水质子弛豫效率的测定及磁共振（MR）图像获取

通常情况下，表征铁磁性化合物的质子弛豫增强能力用弛豫效率Ri来衡量，其计算方程式如下：

(1/T_i)_obsd=(1/T_i)_d+R_i×[M]，i=1，2。

其中1/T₁和1/T₂分别为溶剂的纵向和横向弛豫率，[M]为铁磁性物质的浓度，(1/T_i)_obsd和(1/T_i)_d分别为有和无铁磁性物质存在时观察到的水质子弛豫率。实际上，通常用R₂值（单位浓度的水质子弛豫率，单位为mM^-1s^-1）来衡量铁磁性物质弛豫水质子的效率。因此，我们用翻转－恢复脉冲序列测得不同磁小体浓度下的T₂值（用偶极梯度法消除水的阻尼效应），用1/T₂对[Fe]作图，然后用非线性最小平方拟合得到的斜率即为衡量磁性物质弛豫水质子效率的指标R₂值。样本数据见表1。

表1不同浓度下PEG-cBMP的T₂值

样本编号	Fe浓度(mM)	T₂值(ms)	1/T₂(s^-1)
				1	0.01055	83.42	11.99

2	0.00528	228.30	4.38
				3	0.00264	828.50	1.21
4	0.00106	332.23	3.01
				5	0.00011	6835.27	0.15

为了探测该分子的水质子弛豫能力，我们用3.0T临床MR扫描仪对不同浓度的样品做了T₂加权成像（T₂WI）梯度回波序列GRE(gradient recalled echo)回波时间（TE）/重复时间（TR）=9/1000ms；视野（FOV）=64mm；矩阵（matrix）=128×128；层厚（THK）=1mm)。测得不同[Fe]浓度下的T₂值，用1/T₂对[Fe]作图，然后用线性最小平方拟合得到的斜率即为衡量磁性物质弛豫水质子效率的重要指标R₂值。数据由统计软件SPSS13.0处理，PEG-cBMP浓度与MDA-MB-231细胞信号的关系采用线性回归（Linear Regression）分析。得到的工作曲线如图13所示，线性方程为：1/T₂=-0.024+1062.264X（R₂=0.906，F=28.935，P=0.013），其中X是Fe的浓度。因T₂弛豫率定义为含铁浓度与1/T₂直线方程的斜率，故可得PEG-cBMP的R₂驰豫率为1062.264（mmol^-1·L·s^-1），表明PEG-cBMP确实是一种高效的MRI造影剂，即灵敏度高。

图14示出来了PEG-cBMP靶向MDA-MB-231细胞线粒体的超薄电子显微镜图；由图可知：细胞胞质中存在数量不等的、电子密度高的PEG-cBMP颗粒，呈小团状聚集或散在点状分布，主要位于线粒体内部，并且线粒体吞噬PEG-cBMP颗粒较多时，线粒体形态变膨胀，线粒体嵴变松散，数量减少。

图15示出来了PEG-cBMP靶向MDA-MB-231细胞线粒体的普鲁士蓝光学显微镜图；由图可知：标记了PEG-cBMP的 MDA-MB-231经普鲁士蓝染色后，在显微镜下观察，几乎所有细胞胞浆内均可见蓝染颗粒，而未标记细胞的胞浆内未见蓝染颗粒。

上文的试验结果证明：PEG-cBMP既具有精确的靶向性，还具有较高的灵敏度。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

步骤B：将所述第一产物与磁小体混合，并孵育过夜，后除去未反应物，得到第二产物；

步骤C：向所述第二产物中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺和甲氧基-羧基化-聚乙二醇，并孵育过夜，后除去未反应物，得到所述检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针；

其中，所述线粒体细胞色素C的配体为：5’-CCG TGT CTGGGG CCG ACC GGC GCA TTG GGT ACG TTG TTG C-3’。

2.根据权利要求1所述的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，孵育的条件为：

在避光条件下每隔50-200s超声20s，超声的功率为20-80w。

3.根据权利要求1所述的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤C中，孵育的条件为：

在避光条件下每隔50-200s超声20s，超声的功率为20-80w。

4.根据权利要求1所述的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，所述第一产物与磁小体的质量比例为：

3:7。

5.根据权利要求1所述的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤C中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和甲氧基-羧基化-聚乙二醇、第二产物中的磁小体的质量比例为：

3:3:3:1。

6.根据权利要求1所述的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，除去未反应物的方法为：

用磁铁吸附混合物，得到吸附物，再漂洗吸附物，得到所述第二产物。

7.根据权利要求1所述的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤C中，除去未反应物的方法为：

用磁铁吸附混合物，得到吸附物，再漂洗吸附物，得到所述检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针。

8.根据权利要求1所述的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的制备方法，其特征在于，所述荧光素为：艾利克斯荧光素647。

9.检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针，其特征在于，所述检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针为：利用权利要求1-8任一项所述的检测线粒体细胞色素C的双功能纳米探针的制备方法得到。