CN103550265B - 一种茯苓皮有效成分的提取方法及其提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茯苓皮有效成分的提取方法,包括:将茯苓皮用盐酸冲洗,水洗至中性,晾干;将茯苓皮用乙醇回流提取,提取液回收乙醇至干;将干物质用水溶解,加入正丁醇和乙酸乙酯的混合物萃取,有机相回收溶剂至干,得粗品;粗品用乙醇溶解,配成溶液,所得溶液上中性氧化铝层析柱,然后用乙醇和乙酸乙酯的混合物进行洗脱,收集洗脱液;向洗脱液中加入活性炭,过滤,滤液浓缩、静置、过滤、干燥,得有效成分。本发明提取方法稳定、提取效率高,大大提高了提取物的收率和有效成分的含量,所得提取物中3β-羟基-羊毛甾7,9(11),24-三烯-21-酸和去氢依布里酸含量较大,提取物具有降血糖、降血脂的作用,具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种茯苓皮中有效成分的提取方法及所得提取物,具体涉及一种3β-羟基-羊毛甾7,9(11),24-三烯-21-酸和去氢依布里酸含量较大的茯苓皮有效成分的提取方法及所得提取物,属于中药提取技术领域。
背景技术
茯苓为多孔菌科真菌 Poria cocos( Schw.) Wolf的干燥菌核的外皮,异名“苓皮”(《四川中药志》),性味“甘淡,平”,功用“利水,消肿”,主治“水肿、腹胀”。茯苓皮主要化学成分有茯苓多糖、三萜、树胶、蛋白质、甾醇和脂肪酸等,现代研究结果表明茯苓中三萜类化学成分具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等活性。
目前,国内外对茯苓中有效成分的提取有一定研究,已从中提取了三萜类化合物、总皂苷、茯苓多糖、黄酮类化合物等有效成分。相对的,从茯苓皮中提取有效成分的研究较少,茯苓皮中含有比较丰富的三萜类化合物,专利201210168614.1公开了一种茯苓皮提取物及其在制备利尿作用药物中的应用,方案是:茯苓皮用乙醇渗漉、然后用乙酸乙酯萃取、然后上硅胶柱用石油醚-乙酸乙酯洗脱、浓缩得提取物。所得提取物具有保钠排钾的作用,可用于利尿。专利201210235819.7公开了一种茯苓皮提取物及其在治疗慢性肾衰竭药物中的应用,方案为:将茯苓皮用乙醇提取、然后用乙酸乙酯萃取,得提取物。提取物对慢性肾衰竭有一定疗效。
因茯苓皮中含有多种有效成份,因此采用不同的方法所得的有效成分及其含量不尽相同,所表现出来的治疗作用也不尽相同。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足,提供了一种茯苓皮有效成分的提取方法,该方法所得有效成分中3β-羟基-羊毛甾7,9(11),24-三烯-21-酸和去氢依布里酸含量较大,收率较高。
本发明还提供了采用上述方法所得的茯苓皮提取物。
本发明技术方案如下:
一种茯苓皮有效成分的提取方法,其特征是,包括以下步骤:
(1)将茯苓皮用1.0-2.0wt%的盐酸冲洗,然后用水冲洗至中性,晾干;
(2)将步骤(1)处理过的茯苓皮用70-95体积%的乙醇溶液回流提取2次,合并提取液,提取液回收乙醇至干;
(3)将步骤(2)的干物质用水溶解,加入正丁醇和乙酸乙酯的混合物萃取,有机相回收溶剂至干,得粗品;
(4)粗品用乙醇溶解,配成溶液,所得溶液上中性氧化铝层析柱,然后用乙醇和乙酸乙酯的混合物进行洗脱,收集洗脱液;
(5)向洗脱液中加入活性炭,加热至沸腾并保持30min,趁热过滤,用乙醇洗涤活性炭,合并滤液及洗液,浓缩至原体积的1/3,静置沉淀、过滤、干燥,得有效成分。
上述步骤(2)中,茯苓皮与乙醇溶液的用量关系为1:5-20(g/ml)。
上述步骤(2)中,每次提取时间为0.5-3.5h。
上述步骤(2)中,优选用70体积 %的乙醇提取茯苓皮,茯苓皮与乙醇溶液的用量关系为1:10(g/ml),每次提取时间为0.5 h。
上述步骤(3)中,正丁醇:乙酸乙酯的体积比为5-10:1.5,优选7:1.5。
上述步骤(3)中,水:正丁醇和乙酸乙酯的混合物的体积比为1:1.5-2。
上述步骤(4)中,粗品用其100-120质量倍的乙醇溶解,配成溶液。
上述步骤(4)中,中性氧化铝的质量为粗品的15-20倍。
上述步骤(4)中,乙醇和乙酸乙酯的体积比为2:3-7,优选为2:5。
上述步骤(4)中,乙醇和乙酸乙酯的混合物的用量为氧化铝的1.5-3倍,优选为2倍。
上述步骤(5)中,活性炭用量为粗品质量的2-3%。
采用上述方法获得的茯苓皮提取物也应受到保护,提取物中有效成分主要为3β-羟基-羊毛甾7,9(11),24-三烯-21-酸和去氢依布里酸,两者含量在50%以上。
本发明提取方法稳定、提取效率高,大大提高了提取物的收率和有效成分的含量,所得提取物中3β-羟基-羊毛甾7,9(11),24-三烯-21-酸和去氢依布里酸含量较大,提取物具有降血糖、降血脂的作用,具有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1茯苓皮提取物的色谱图。
图2为 3β-羟基-羊毛甾7,9(11),24-三烯-21-酸的色谱图。
图3 为去氢依布里酸的色谱图。
具体实施方式
下面对本发明进行进一步的阐述。
实施例1
茯苓皮提取方法如下:
1、取5kg茯苓皮,用1.5wt%的盐酸冲洗一次,然后用水将酸冲洗干净,至中性后晾干;
2、将晾干后的5kg茯苓皮用70体积%的乙醇溶液回流提取2次,乙醇溶液的用量为50L,每次提取时间为0.5 h,合并提取液,减压回收乙醇至干,得干物质;
3、将步骤2的干物质用500ml的水溶散,然后加入750ml正丁醇和乙酸乙酯的混合物(正丁醇:乙酸乙酯体积比=7:1.5)进行萃取,取有机相,回收溶剂至干,得粗品203g;
4、粗品用20.5L乙醇溶解,配成溶液,取粗品18质量倍的中性氧化铝,装层析柱,将上述粗品溶液加入层析柱中,使溶液通过层析柱,然后用两体积倍氧化铝的乙醇和乙酸乙酯(乙醇:乙酸乙酯体积比=2:5)的混合物进行洗脱,收集洗脱液;
5、向洗脱液中加入6.1g的活性炭,加热至沸腾,保持微沸30分钟,趁热过滤,用乙醇洗涤活性炭,合并滤液及洗液,浓缩至原体积的1/3,静置沉淀、过滤、60℃干燥,得茯苓皮提取物150g。计算提取物收率=提取物质量/茯苓皮质量=150/5000=3%。
对提取物中羟基-羊毛甾7,9(11),24-三烯-21-酸和去氢依布里酸的含量进行测定,方法如下:
1、仪器及试药:Waters 高效液相色谱***,Water600泵,996二极管阵列检测器,M32色谱工作站,Lichrospher-C18 柱,200×4.6mm,5μ(江苏汉邦科技有限公司产品)。
2、药物:乙腈(色谱纯级),3β-羟基-羊毛甾7,9(11),24-三烯-21-酸和去氢依布里酸(山东省中药新型制剂中心制备,含量均达98.0%以上)。
3、检测条件:流动相:乙腈:0.5%乙酸水(80:20),检测波长242nm。
4、对照品溶液的制备
精密称取3β-羟基-7,9(11),24-三烯-21-酸对照品,置10 mL容量瓶中,甲醇稀释至刻度,制成228 μg·mL-1的对照品溶液;精密称取去氢依布里酸对照品,置10 mL容量瓶中,甲醇稀释至刻度,制成130 μg·mL-1的对照品溶液。
5、供试品溶液的制备
取茯苓皮提取物约40 mg,精密称定,置100 mL容量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,用0.45 μm的微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。
6、测定方法
精密吸取上述对照品溶液及供试品溶液各10μL,分别注入液相色谱仪中,得到提取物和对照品的色谱图1-3。
根据峰面积计算, 3β-羟基-羊毛甾7,9(11),24-三烯-21-酸含量为30.61%,去氢依布里酸含量为32.52%,两种物质共计63.23%。
实施例2
茯苓皮提取方法如下:
1、取5kg茯苓皮,用1.0wt%的盐酸冲洗一次,然后用水将酸冲洗干净,至中性后晾干;
2、将晾干后的5kg茯苓皮用80体积%的乙醇溶液回流提取2次,乙醇溶液的用量为75L,每次提取时间为2h,合并提取液,减压回收乙醇至干,得干物质;
3、将步骤2的干物质用500ml的水溶散,然后加入1000ml正丁醇和乙酸乙酯的混合物(正丁醇:乙酸乙酯体积比=5:1.5)进行萃取,取有机相,回收溶剂至干,得粗品186g;
4、粗品用19L乙醇溶解,配成溶液,取粗品15质量倍的中性氧化铝,装层析柱,将上述粗品溶液加入层析柱中,使溶液通过层析柱,然后用1.5体积倍氧化铝的乙醇和乙酸乙酯(乙醇:乙酸乙酯体积比=2:3)的混合物进行洗脱,收集洗脱液;
5、向洗脱液中加入3.8g的活性炭,加热至沸腾,保持微沸30分钟,趁热过滤,用乙醇洗涤活性炭,合并滤液及洗液,浓缩至原体积的1/3,静置沉淀、过滤、60℃干燥,得茯苓皮提取物123g。
采用高效液相色谱法测得提取物中3β-羟基-羊毛甾7,9(11)和24-三烯-21-酸含量共计55.24%。
实施例3
茯苓皮提取方法如下:
1、取5kg茯苓皮,用2.0wt%的盐酸冲洗一次,然后用水将酸冲洗干净,至中性后晾干;
2、将晾干后的5kg茯苓皮用95体积%的乙醇溶液回流提取2次,乙醇溶液的用量为25L,每次提取时间为3h,合并提取液,减压回收乙醇至干,得干物质;
3、将步骤2的干物质用500ml的水溶散,然后加入800ml正丁醇和乙酸乙酯的混合物(正丁醇:乙酸乙酯体积比=10:1.5)进行萃取,取有机相,回收溶剂至干,得粗品183g;
4、粗品用22L乙醇溶解,配成溶液,取粗品20质量倍的中性氧化铝,装层析柱,将上述粗品溶液加入层析柱中,使溶液通过层析柱,然后用3体积倍氧化铝的乙醇和乙酸乙酯(乙醇:乙酸乙酯体积比=7:5)的混合物进行洗脱,收集洗脱液;
5、向洗脱液中加入5.5g的活性炭,加热至沸腾,保持微沸30分钟,趁热过滤,用乙醇洗涤活性炭,合并滤液及洗液,浓缩至原体积的1/3,静置沉淀、过滤、60℃干燥,得茯苓皮提取物122g。
采用高效液相色谱法测得提取物中3β-羟基-羊毛甾7,9(11)和24-三烯-21-酸含量共计53.57%。
下面以实施例1所得提取物为例,对提取物降血糖、降血脂作用进行研究。
、实验动物
健康雄性昆明种小鼠,体重24~26g;清洁级Wistar大鼠,体重180~220g。
、仪器与试剂
总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒:北京北化精细化学有限责任公司临床试剂分厂生产。
四氧嘧啶:香港FARCO 公司生产。
血糖测定仪:英国宝灵曼公司生产。
半自动生化分析仪:上海第三分析仪器厂生产
3、实验方法
3.1对糖尿病小鼠血糖的影响
3.1.1糖尿病模型小鼠:采用尾静脉注射四氧嘧啶(动物禁食24h后给药,剂量为45mg/kgbw)的方法建立糖尿病动物模型。将尾静脉注射四氧嘧啶7d后空腹(禁食3h)血糖值大于10mmol/L的小鼠作为本试验的糖尿病模型小鼠。
3.1.2试验剂量与动物分组:根据糖尿病模型小鼠的血糖值将其随机分为四组,其中1个模型对照组,3个提取物剂量组 (剂量分别为1.5、2.5、3.5g/kgbw)。每组均12只小鼠。
3.1.3空腹血糖的测定:上述各剂量组动物连续给予提取物30d(模型对照组给蒸馏水)后,眼内眦取血测全血空腹血糖值(禁食3h)。
对实验性高血脂大鼠血脂的影响
3.2.1采用大鼠脂代谢紊乱模型法进行试验。以基础饲料喂饲大鼠观察5d后,空腹取尾血,酶法测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),根据TC水平将动物随机分为4组:高脂对照组,三个提取物组(剂量分别为1.5、2.5、3.5g/kgbw)。提取物用蒸馏水按所需浓度配制。自正式试验开始, 各组动物换用高脂饲料,提取物组灌胃给予不同剂量的提取物, 高脂对照组灌胃给予同体积的蒸馏水, 灌胃量按1.0ml/100gbw 计算,每日一次,连续40d后,空腹取尾血测定上述各项血脂指标。
3.2.2动物饲料
基础饲料:正常颗粒饲料。
高脂饲料(wt%):基础饲料79%,胆固醇1%,猪油10%,新鲜蛋黄液10%。
、数据处理
采用t检验和方差分析进行统计学处理。
、结果与分析
5.1提取物对糖尿病模型小鼠空腹血糖的影响
各组糖尿病模型小鼠在接触提取物前(即试验前)的平均空腹血糖值均无明显差别(p>0.05);而在连续经口给予提取物30d(模型对照组给蒸馏水)后(即试验后),其平均空腹血糖值及平均空腹血糖降低值均发生了一定的变化。结果见表1。
由表1可以看出, 本发明低、中、高剂量组小鼠试验后的空腹血糖值均低于模型对照组,且中剂最组表现差异极显著;试验前后血糖降低值同样是中剂量组升高明显。该试验结果说明本发明提取物对糖尿病模型小鼠的空腹血糖具有一定的改善作用。
提取物对大鼠血脂的影响
本发明提取物对大鼠血脂的影响结果见表2。
由表2可以看出,各组大鼠在接触提取物前(即试验前),各项血脂指标组间均无明显差异。而在给大鼠灌胃上述不同剂量的本发明提取物(模型对照组给蒸馏水)40d后(即试验后),模型对照组的血清TC、TG均表现明显升高,说明高脂血症动物模型复制成功;同时,低、中、高剂量组的血清TC的升高受到了明显的抑制,HDL-C的升高较模型对照组比较差异显著。本试验结果表明,本发明提取物能明显地抵抗高脂饲料对大鼠血清TC的升高作用,该作用有可能是通过升高动物的HDL-C而清除掉体内的部分TC而完成的。这说明本发明提取物对大鼠高脂血症的形成有一定的预防作用。
Claims (10)
1.一种茯苓皮有效成分的提取方法,其特征是,包括以下步骤:
(1)将茯苓皮用1.0-2.0wt%的盐酸冲洗,然后用水冲洗至中性,晾干;
(2)将步骤(1)处理过的茯苓皮用70-95体积%的乙醇溶液回流提取2次,合并提取液,提取液回收乙醇至干;
(3)将步骤(2)的干物质用水溶解,加入正丁醇和乙酸乙酯的混合物萃取,有机相回收溶剂至干,得粗品;
(4)粗品用乙醇溶解,配成溶液,所得溶液上中性氧化铝层析柱,然后用乙醇和乙酸乙酯的混合物进行洗脱,收集洗脱液;
(5)向洗脱液中加入活性炭,加热至沸腾并保持30min,趁热过滤,用乙醇洗涤活性炭,合并滤液及洗液,浓缩至原体积的1/3,静置沉淀、过滤、干燥,得有效成分,所得有效成分中主要包括3β-羟基-羊毛甾7,9(11),24-三烯-21-酸和去氢依布里酸;
步骤(3)中,正丁醇:乙酸乙酯的体积比为5-10:1.5,水:正丁醇和乙酸乙酯的混合物的体积比为1:1.5-2;
步骤(4)中,乙醇和乙酸乙酯的体积比为2:3-7,乙醇和乙酸乙酯的混合物的用量为氧化铝的1.5-3倍。
2.根据权利要求1所述的提取方法,其特征是:步骤(2)中,茯苓皮与乙醇溶液的用量关系为1g:5-20ml。
3.根据权利要求1所述的提取方法,其特征是:步骤(2)中,每次提取时间为0.5-3.5h。
4.根据权利要求1所述的提取方法,其特征是:步骤(2)中,用70体积 %的乙醇提取茯苓皮,茯苓皮与乙醇溶液的用量关系为1g:10ml,每次提取时间为0.5 h。
5.根据权利要求1所述的提取方法,其特征是:步骤(3)中,正丁醇:乙酸乙酯的体积比为7:1.5。
6.根据权利要求1所述的提取方法,其特征是:步骤(4)中,粗品用其100-120质量倍的乙醇溶解,配成溶液;中性氧化铝的质量为粗品的15-20倍。
7.根据权利要求1所述的提取方法,其特征是:步骤(4)中,乙醇和乙酸乙酯的体积比为2:5;乙醇和乙酸乙酯的混合物的用量为氧化铝的2倍。
8.根据权利要求1所述的提取方法,其特征是:步骤(5)中,活性炭用量为粗品质量的2-3%。
9.根据权利要求1所述的提取方法,其特征是:所得有效成分中主要包括3β-羟基-羊毛甾7,9(11),24-三烯-21-酸和去氢依布里酸,两者含量在50%以上。
10.采用权利要求1-9中任一项所述的茯苓皮有效成分的提取方法提取所得的茯苓皮提取物。
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