CN103535559A - 一种仔猪专用合生素饲料添加剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种合生素饲料添加剂，其包括益生菌株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ZLP001；保藏号为：CGMCC No.7370）和低聚果糖。本发明将益生菌株植物乳杆菌和低聚果糖相结合且筛选出最优化的重量比，即可发挥两种添加剂最佳的协同配伍效果，产生的作用高于两种添加剂单独使用时的效果。可以在家畜养殖产业领域广泛推广应用，具有良好的市场效应和社会效应。

Description

一种仔猪专用合生素饲料添加剂及应用

技术领域

本发明涉及畜禽养殖领域，具体涉及一种用于提高畜禽生产性能的饲料添加剂。

背景技术

仔猪在断奶后由于食物的突然转换，环境的变化、以及自身消化***和免疫***不成熟等多重影响，极易产生断奶应激，往往导致仔猪食欲降低、增重减缓甚至减重、腹泻发病、生长严重受阻等。因此，在仔猪断奶后应积极采取各种措施减少应激反应的发生，增强仔猪的肠道功能和免疫机能，提高仔猪日粮的采食量和消化率，减少仔猪腹泻、生长受阻等疾病的发生，以保证其正常生长。

很长一段时间以来，都是通过在饲粮中添加抗生素来预防和解决仔猪断奶应激的问题。随着抗生素抗药性及药物残留等问题的发现，研究者开始积极探索抗生素的替代品，力图找到一种无毒副作用、无污染、无残留、安全的新型饲料添加剂。乳酸菌制剂作为新型饲料添加剂在微生态制剂中是效果较好的一类，近年来受到广泛关注。大量研究已证实这类微生物添加剂具有良好的生物学功能，在动物生产中应用，可以抑制肠道病原菌的繁殖，从而防止动物腹泻，增加营养物质利用率，提高其生产性能。但是，这些益生作用显著的菌株在通过动物胃肠道前消化道时易被酸性环境破坏，有着到达后肠段菌数少，有效存活率低，定植力弱的不足，而且饲料加工、运输过程，以及保存方式等对其存活率也有很大程度的影响。因此，限制了乳酸菌类益生菌制剂益生作用的高效发挥。

有研究表明化学益生素寡糖虽本身不具有营养作用，不被动物消化道吸收利用，但其到达消化道肠段后能被其中的有益微生物选择性地利用，从而促进肠道有益菌群的增殖，起到改善宿主健康，提高生产性能的作用。已有许多研究将寡糖作为乳酸菌的增殖促进剂来配合使用，借以提高乳酸菌在肠道内的存活率及定植能力，从而进一步提升乳酸菌的益生效果。

然而，简单地将有益菌与寡糖进行组合尽管在某种程度上可提高有益菌的存活率及增殖能力，但由于未考虑益生菌与寡糖的双向选择性而使其配伍效果的作用不能最大程度发挥，因此不具备广泛的适用性和高效性。而且到目前为止，尚无适合断奶仔猪使用的改善仔猪健康状况，提高生产性能的益生菌寡糖合生素专用产品。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术不足提供一种合生素饲料添加剂。

本发明的另一目的在于提供上述合生素饲料添加剂在提高禽畜生产性能等方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种合生素饲料添加剂，其包括植物乳杆菌和低聚果糖。

上述饲料添加剂，以植物乳杆菌按10⁹CFU/g计与低聚果糖重量比为1:1.25～1:5，优选植物乳杆菌和低聚果糖重量比为1:2.5。在饲料添加剂中，植物乳杆菌一般以冻干粉的方式加入，冻干粉中植物乳杆菌的含量一般为10⁹CFU/g左右。

本发明包括含有上述的合生素饲料添加剂的预混料或饲料。所述饲料添加剂在饲料的含量以0.5%～1%为宜，优选为0.7%。在上述饲料中，优选植物乳杆菌的含量为10⁶CFU/g饲粮，低聚果糖的含量为0.5%。

合生素饲料添加剂可有效降低家畜腹泻率、明显提高家畜日增重和饲料利用率，可用于提高禽畜生产性能。在应用时，可将所述饲料添加剂直接添加到畜禽饲料中，或将所述饲料添加剂与载体混合制成预混剂，或与其它饲料添加剂或饲料原料混合制成预混料、浓缩料形式饲喂畜禽。

本发明通过将植物乳杆菌与甘露寡糖、低聚异麦芽糖、低聚果糖、壳寡糖、木寡糖、大豆低聚糖、棉子低聚糖、菊粉等不同种类的寡糖配伍组合进行筛选，通过研究寡糖对植物乳杆菌增殖、产酸能力、代谢产物和抑菌特性的影响，结果发现，将植物乳酸杆菌和低聚果糖进行组合，可明显促进植物乳杆菌的增殖，该组合的效果显著优于其他组合。

设空白对照、植物乳杆菌对照和不同梯度的植物乳杆菌与寡糖配伍组合比例（1:1.25；1:2.5；1:3.75；1:5）进行试验，研究表明，该植物乳杆菌与低聚果糖在断奶仔猪日粮中的配伍比例为1:2.5时，断奶仔猪表现最好的生产性能。仔猪日粮中植物乳杆菌与寡糖配伍比例为1:2.5时，仔猪日增重达到397.7g/d，料重比为1.75，腹泻指数为0.60。干物质、粗蛋白、钙和磷的消化率分别为86.74%，85.85%，68.81%和55.32%。粪中乳酸菌的数量为9.20×10⁸CFU/g，大肠杆菌的数量为1.46×10⁶CFU/g。血液生化指标显示其尿素氮水平为4.15mmol/L，白蛋白水平为26.47g/L，免疫球蛋白水平为315.2μg/mL，超氧化物歧化酶活性为179.50U/L。

本发明中所用植物乳杆菌系自主分离的一株高性能的益生菌。该菌株已于2013年3月27日保藏于微生物菌种保藏中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101），分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）ZLP001，保藏号为CGMCCNo.7370。进而本发明还包括含有所述菌株的饲料添加剂、饲料等等。

本发明在改善禽畜生产性能上具有如下优点：

1、本发明添加剂组合物的原料成份分别来自健康动物肠道和天然植物，相比于抗生素类添加剂，它们无毒副作用、无残留、无污染，是能够提高畜禽生产性能和产品品质、抑制胃肠道有害菌繁殖、增强机体抗病力和免疫力的绿色饲料添加剂。

2、本发明添加剂使用方法简便，只需将两种绿色饲料添加剂按一定比例配合混匀，添加入禽畜日粮中即可发挥两种添加剂的协同配伍效果，产生的作用高于两种添加剂单独使用时的效果。

3、本合生素有望替代禽畜饲料中的抗生素类添加剂，改进禽畜饲粮品质，避免抗生素残留和耐药性的发生。本合生素产品可提高禽畜日增重，降低料肉比，减轻腹泻的发生；能增强日粮养分的消化率和机体抗应激能力和免疫能力。本发明能明显提高禽畜生产性能，且有利于食品安全。

说明书附图

图1为低聚果糖作为碳源植物乳杆菌生长曲线。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100mL中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。

实施例1  植物乳杆菌ZLP001

健康仔猪肠道中分离出的一株耐酸、耐胆盐、抑菌性好的高性能益生菌。该菌在pH为3.0的酸性环境中存活率为90.49%；在0.3%的胆盐中存活率为87.02%；对大肠杆菌、沙门氏菌和金色葡萄球菌均表现为中度敏感。经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定，其为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），将其命名为ZLP001，该菌株已于2013年3月27日保藏于微生物菌种保藏中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101），分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZLP001，保藏号为CGMCCNo.7370。实验表明该菌株生长繁殖快，且耐酸耐胆盐能力强，同时具有明显的抑制有害菌的作用。已成功研究采用冻干法将分离到的植物乳杆菌制成可以直接饲喂动物的微生态制剂。且饲喂断奶仔猪研究得出，植物乳杆菌制剂的添加可降低仔猪腹泻率、提高仔猪日增重和饲料利用率。

实施例2  体外培养实验

1.材料

益生菌：植物乳杆菌ZLP001；寡糖：甘露寡糖，低聚异麦芽糖，低聚果糖，壳寡糖，木寡糖，大豆低聚糖，棉子低聚糖，菊粉。

2.方法与结果

2.1试验设计

分别以甘露寡糖，低聚异麦芽糖，低聚果糖，壳寡糖，木寡糖，大豆低聚糖，棉子低聚糖，菊粉做碳源添加到植物乳杆菌培养基中，筛选出植物乳杆菌生长表现最好的寡糖。

2.2试验方法

活化：将植物乳杆菌冻存菌液以1%接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h备用（活菌数相当于10⁹CFU/mL）。抑菌试验指示菌（大肠埃希菌、猪霍乱沙门菌、金黄色葡萄球菌）种子菌液以1%接种量分别接种于营养肉汤培养基中，37℃恒温培养18h备用（活菌数相当于10⁹CFU/mL）。

增殖试验：以不同种类的寡糖代替葡萄糖作为MRS培养基的碳源，添加浓度分别为1%，3%，5%，7%（m/V），进行植物乳杆菌ZLP001的体外培养，温度为37℃。分别于培养后的0、3、6、9、12和24h测定发酵液pH值、OD600nm值和乳酸生成量，并于24h测定活菌数。

生长曲线：按1%的接种量，将活化好的菌液接种到已灭菌的以1%低聚果糖为碳源的MRS液体培养基中，采用Bioscreen全自动生长曲线分析仪（谓载国际集团（香港）有限公司）连续测定48h。测定条件为37℃，每隔1h测定一次菌液OD600nm。

抑菌试验：在灭菌平板中，注入10mL2%灭菌琼脂，冷凝后，放入已灭菌的牛津杯，再将含有1%已活化并稀释至10⁶指示菌的营养琼脂培养基20mL注入平板，冷凝后取出牛津杯。孔中注入200μL已用葡萄糖和不同寡糖分别培养的植物乳杆菌发酵液，无糖培养基作为空白对照。平板放置在4℃扩散4h，37℃培养10h后，测量抑菌圈直径。

指标的测定：

---OD600的测定：于接种后0，3，6，9，12，24h取发酵液用UV-4802型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）测OD600值，以未接种的培养基作为空白对照调零。

---pH值的测定：于接种后0，3，6，9，12，24h使用pH213型酸度计（北京哈纳公司）测定发酵液的pH值。

---乳酸浓度的测定：乳酸浓度的测定参照张龙翔等（1997）的方法进行。分别取发酵0，3，6，9，12，24小时后的发酵液于-20℃保存，比色法测定乳酸浓度。

---平板计数：取一定时间的发酵液，采用10倍梯度倍比稀释法对其进行稀释，用MRS培养基以平板涂布法对植物乳杆菌进行计数。平板于37℃培养48小时计数。

2.3试验结果

低聚糖筛选试验结果表明，相比于其它低聚糖，植物乳杆菌对低聚果糖的利用效果最佳。表现为当低聚果糖的添加量为3%时，植物乳杆菌培养24小时，发酵液OD值为1.847，pH可降到4.14，乳酸生成量达到69.86mmol/L，活菌数可达2.07×10⁹CFU/g，上述指标均显著优于添加其他种类的寡糖。发酵液对大肠杆菌、沙门氏菌和金色葡萄球菌均具有明显的抑菌圈，说明能够抑制病原菌的生长。从其生长曲线可以看出，低聚果糖作为碳源时，植物乳杆菌4小时进入对数期，18小时进入生长稳定期，24小时达到生长最高峰，且稳定期较长（见图1）。

表1不同低聚糖发酵24h时OD值比较

注：同列肩标不同字母表示差异显著（P<0.05）。×表示未测得有效数值。下同。

表2不同低聚糖发酵24h时pH值比较

表3不同低聚糖发酵24h时活菌数比较（logCFU/mL）

表4不同低聚糖发酵24h时乳酸生成量比较（mmol/L）

表5不同低聚糖作为碳源植物乳杆菌抑菌特性比较

实施例3 饲养试验

1.材料

1.1益生菌和寡糖试验所选菌种为本研究室筛选保藏并经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZLP001，具有较强的耐酸、耐胆盐和抗菌活性，其冻干菌粉制剂中有效活菌总数为10⁹CFU/g。试验所用寡糖为低聚果糖，纯度95%。

1.2动物选择试验动物为30日龄“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪。试验在北京市房山区某猪场开展。

2.方法与结果

2.1试验设计及试验日粮

选用84头（30±2）日龄平均体重为7.19±0.45kg的“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪，按性别、体重和窝源基本一致的原则随机分为4组，每组3个重复，每个重复7头猪。具体分组及各组饲粮分别为：试验1组为对照组，饲喂基础日粮；试验2组、3组、4组分别在基础日粮基础上添加0.2％益生菌、0.2％益生菌+0.5％寡糖、0.5％寡糖。试验设计见表6。

表6试验设计

基础饲粮参照美国NRC（1998）及***饲养标准（2004）保育猪营养需要配制，为粉状饲料，其日粮组成及营养水平见表7。

表7基础饲粮组成及营养水平

4%预混料为每公斤全价料提供：VA,10000IU;VD3,2700IU;VE,28mg;VK3,2mg/kg;VB1,2mg/kg;VB2,5mg;VB6,2.5mg;VB12,0.04mg;烟酸,30mg;泛酸,12mg;叶酸,1mg;生物素,0.5mg;铜,160mg;铁,130mg;锰,20mg;锌,130mg;碘,0.50mg;硒,0.30mg。

2.2饲养管理

本次试验试验期为30天。试验猪舍为水泥地面，保育猪采用网床圈养，自由采食，以鸭嘴式饮水器提供充足清洁饮水。平均舍温控制在22～24℃。免疫消毒程序按该阶段猪常规方法进行。试验由专人负责，严格按照试验要求进行管理。试验预试期3d，正试期为28d。试验开始和试验结束进行个体空腹称重，每周记录饲料消耗情况，计算日增重、采食量和料肉比。试验期间每日观察猪群生长情况，记录猪群腹泻和疾病发生情况。于试验结果前一天前腔静脉采血，测定仔猪的各项免疫指标。试验最后一天采集各重复典型粪便样品，用于测定粪便中乳酸菌和大肠杆菌的数量。

2.3结果与分析

2.3.1植物乳杆菌与低聚果糖配伍对断奶仔猪生产性能的影响

由表8可以看出，试验期内断奶仔猪饲粮中添加乳酸菌、乳酸菌+寡糖和寡糖对仔猪平均日采食量影响不显著（P>0.05）。不同组仔猪的平均日增重饲喂乳酸菌+寡糖组显著高于对照组（P<0.05），饲喂乳酸菌和寡糖的仔猪平均日增重分别比对照组提高6.03%和6.28%，但差异不显著（P>0.05）。整个试验期饲喂乳酸菌和乳酸菌+寡糖的仔猪料重比显著低于对照组（P<0.05），单独添加寡糖的仔猪料重比与对照组差异不显著（P>0.05）。

表8乳酸菌与寡糖配伍对仔猪生产性能的影响

注：试验1组为对照组，饲喂不含抗生素的基础日粮；试验2组为基础日粮+0.2%植物乳杆菌；试验3组为基础日粮+0.2%植物乳杆菌+0.5%低聚果糖；试验4组为基础日粮+0.5%低聚果糖。同行肩标不同字母表示组间差异显著（P<0.05）。下表同。

2.3.2植物乳杆菌与低聚果糖配伍对断奶仔猪粪便微生物菌群的影响

仔猪断奶后受各种应激影响，肠道乳酸菌数量减少，而肠杆菌的数量增加。当肠道正常微生物区系紊乱后，肠道菌成为潜在病原菌影响仔猪健康。本研究中与对照组相比，饲粮中添加乳酸菌、乳酸菌+寡糖和寡糖对仔猪粪便乳酸菌和大肠杆菌的数量产生了显著性影响（P<0.05）。添加乳酸菌+寡糖的仔猪粪中乳酸菌数量显著高于对照组和单独添加寡糖的组。添加乳酸菌和乳酸菌+寡糖的仔猪粪中大肠杆菌的数量显著低于对照组。

表9乳酸菌与寡糖配伍对仔猪肠道微生物的影响(logCFU/g)

2.3.3植物乳杆菌与低聚果糖配伍对断奶仔猪血清指标的影响

血液生化指标是反映动物体内物质代谢和某些组织器官机能变化的重要指标，也可反映动物体内营养物质的沉积情况。表10为乳酸菌与寡糖及其配伍对断奶仔猪血清生化指标的影响。整个试验期内，添加乳酸菌+寡糖与单独添加寡糖的仔猪血清中总蛋白含量显著高于对照组（P<0.05），而单独添加乳酸菌组与对照组没有显著差异。添加乳酸菌、寡糖及其配伍的仔猪血清中球蛋白的含量和白蛋白/球蛋白均与对照组存在显著差异（P<0.05）。血清中肌酐含量添加乳酸菌和乳酸菌+寡糖的仔猪显著高于对照组，单独添加寡糖的组与对照组差异不显著。其他血清生化指标，如白蛋白、尿素氮、胆固醇及甘油三酯不同处理间均差异不显著（P>0.05）。

表10植物乳杆菌与寡糖配伍对断奶仔猪血液生化指标的影响

2.3.4植物乳杆菌与低聚果糖配伍对断奶仔猪免疫指标的影响

乳酸菌与寡糖及其配伍对断奶仔猪血清免疫指标的影响见表11。γ干扰素是一种重要的免疫相关细胞因子，是判断机体免疫功能的重要指标。添加乳酸菌+寡糖的仔猪血清中γ干扰素(IFN-γ)的水平显著高于对照组（P<0.05），而单独添加组与对照组差异不显著。结合珠蛋白（Hp）是一种存在于血清中的急性期蛋白，被认为是评价动物机体是否健康的主要指标。试验期内，结合珠蛋白的水平各处理组间差异不显著（P>0.05）但可以看到添加乳酸菌和寡糖的组有着降低猪结合珠蛋白水平的趋势（P=0.0684,<0.1）。血清免疫球蛋白是体液免疫***的主要成分。本研究中，猪血清中免疫球蛋白A和免疫球蛋白A的含量各处理组间差异不显著（P>0.05），但免疫球蛋白G可以看到，各添加组含量均显著高于对照组（P<0.05）。

表11植物乳杆菌与寡糖配伍对断奶仔猪血液免疫指标的影响

以上试验结果表明，本发明对于提高仔猪生产性能，改善仔猪肠道菌群和增强仔猪健康状况具有显著的作用，且效果优于乳酸菌和寡糖单独使用时。

Claims (10)

1.一种合生素饲料添加剂，其包括植物乳杆菌和低聚果糖。

2.如权利要求1所述的合生素饲料添加剂，其特征在于，所述的植物乳杆菌为植物乳杆菌ZLP001，保藏号为CGMCCNo.7370。

3.如权利要求1或2所述的合生素饲料添加剂，其特征在于，所述植物乳杆菌按10⁹CFU/g计与低聚果糖重量比为1:1.25～1:5。

4.如权利要求3所述的合生素饲料添加剂，其特征在于，所述的植物乳杆菌和低聚果糖重量比为1:2.5。

5.含有权利要求1～4所述的合生素饲料添加剂的饲料。

6.根据权利要求5所述的饲料，其特征在于，所述合生素饲料添加剂的含量为0.5%～1%。

7.权利要求1～4任一项所述的合生素饲料添加剂在提高禽畜生产性能方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述饲料添加剂直接添加到畜禽饲料中，或将所述饲料添加剂与载体混合制成预混剂，或与其它饲料添加剂或饲料原料混合制成预混料、浓缩料形式饲喂畜禽。

9.植物乳杆菌ZLP001，其保藏号为CGMCCNo.7370。

10.含有权利要求9所述的饲料添加剂或饲料。

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