CN103529160A - Uplc-ms/ms法测定人血浆中西莫替尼的浓度 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆中西莫替尼的浓度。本发明提供了检测血浆中西莫替尼浓度的方法，其中通过UPLC-MS/MS法对血浆中西莫替尼的浓度进行分析。本发明的方法优选采用甲醇蛋白沉淀法进行样本前处理，以盐酸厄洛替尼为内标，采用ZORBAX SB-C8色谱柱作为分析柱，电喷雾离子化(ESI+)串联质谱检测。本发明方法的样本的提取回收率大于90％，未见基质效应。本发明方法的特异性、反复冻融稳定性、长期冻存稳定性和稀释效应均进行了验证，并且已经成功应用于给予盐酸西莫替尼片治疗患者的血药浓度检测。
Description
技术领域
本发明涉及对血浆中西莫替尼的浓度进行分析的方法。在本发明的方法中，采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)对血浆中西莫替尼的浓度进行分析，实现了对血浆中西莫替尼浓度的快速、灵敏、特异的分析。
背景技术
肺癌是目前全球肿瘤相关死亡的主要原因，每年大约有1.4百万人死于肺癌[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌总比例的85％[2]，其中腺癌是主要的病理学分型。绝大多数的NSCLC仍以化学治疗为主，并且有效[3]。
表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)，是一种酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase，RTK)，在NSCLC的细胞分化、增殖、血管生成以及凋亡中发挥重要作用。EGFR突变在15％白种人[4]，39.5％(593/1503)韩国人[5]，26％(15/58)日本人[6]以及47.6％(89/187)中国人中表达，提示EGFR突变率在亚洲人群中要高于西方人群。携带EGFR突变的患者在EGFR TKI类药物如吉非替尼和厄洛替尼治疗中获益更大[4，7]，并且不良反应较轻。EGFR TKI治疗的长期无进展生存(prolonged progression free survival，PFS)和疾病控制率均高于传统一线铂类治疗[8，9]。随着人们对EGFR在促进血管生成作用的理解，近年来开发了多种EGFR TKIs。
目前，一共有三个小分子TKI获得FDA的批准用于肿瘤治疗，包括厄洛替尼、吉非替尼和拉帕替尼[10]，其中厄洛替尼和吉非替尼用于NSCLC的治疗。盐酸埃克替尼，是由浙江贝达药业自主研发的一种小分子TKI[11]，于2011年获得中国食品药品监督管理局批准用于NSCLC的治疗。目前埃克替尼的临床试验正在开展中[12-14]。
盐酸西莫替尼，N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[2-(5，8-二氧杂-10-氮杂二螺[2.0.4.3]十一烷)乙氧基]喹唑啉-4-胺盐酸盐(图1)，是一种新的小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，该分子由AdvenchenLaboratories LLC(Northridge，USA)合成。临床前研究表明西莫替尼在抑制人上皮细胞系A431中的作用相当于或优于阳性对照药物盐酸厄洛替尼，并且能显著抑制A431肿瘤模型(未发表结果)。大鼠和比格犬对西莫替尼耐受良好，无可见有害反应作用剂量分别为20mg/kg和6mg/kg，未见突变形成和畸变毒性(未发表结果)。在一项最近的耐受性单剂量给药临床研究中，中国健康志愿者对盐酸西莫替尼也表现较好的耐受性，最高安全给药剂量达500mg(未发表数据)。基于以上临床前数据和临床研究，盐酸西莫替尼片在晚期NSCLC患者中连续给药安全性、耐受性、药动学Ib期临床试验已经于2013年1月在中国医学科学院肿瘤医院展开(ClinicalTrials.gov identifier：NCT01772732)。
关于人血浆中一代TKIs的浓度的检测方法，目前已有报道[15-21]，近年也有同时检测多个TKI类药物的方法学报道[22-26]。现有技术的研究结果表明，当以蛋白沉淀法对TKI药物如埃克替尼进行前处理时，存在很大的基质效应，且回收率低(26.5％)，即使采用液液萃取(liquid-liquidextraction，LLE)的方法，也需要多次稀释才能消除基质效应。[27]。文献[29，30]的检测方法分析血浆样本中厄洛替尼的浓度，其定量下限分别为80ng/mL[29]和50ng/mL[30]，单个样本的检测时间分别为15min[29]和12min[30]。文献[20]采用己烷和乙酸乙酯液液萃取的方式对厄洛替尼血浆样本进行前处理，其萃取回收率为仅79-88％，定量下限为10ng/mL，单个样本的检测时间为6min。亦有文献采用LLE法检测血浆中苏尼替尼[19]，厄洛替尼[20]和埃克替尼[27]的浓度。液液萃取的前处理方式操作繁琐耗时，并不能满足临床药代动力学中大样本的检测。96孔板固相萃取9种TKI药物最近也有报道，但该方法非常昂贵而且程序复杂[25]。目前，还没有相关文献报道生物样本中西莫替尼浓度检测的方法学。
由于临床药代动力学检测时样本量常常很大，因此需要一种快速、灵敏、特异、样品需要量少的定量分析方法。
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发明内容
本发明建立了快速、灵敏的超高效液相色谱串联质谱(ultra highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)技术检测人血浆中西莫替尼的浓度。
与现有技术教导的相反，本发明的研究结果显示在本发明的条件下能够采用蛋白沉淀法进行样本前处理，并且获得令人惊讶的高回收率，从而可以避免繁琐耗时的液液萃取过程。在本发明中，可以通过例如甲醇或乙腈进行蛋白沉淀处理。优选地，在本发明的条件下可以采用甲醇进行蛋白沉淀。本发明的结果显示甲醇蛋白沉淀可以获得高于乙腈的提取回收率，提取率能够高达90％，并且能够避免基质效应。考虑到现有文献报道蛋白沉淀法处理类似TKI药物存在很大的基质效应和不可接受的低回收率(26.5％)，以及现有文献采用萃取法对类似药物的回收率也仅79-88％，本发明获得了完全出乎意料的优异效果。并且，本发明采用蛋白沉淀作为前处理的方法简便、快捷，所用血浆样本量可以为30μl-100μl，例如35μl-90μl，40μl-80μl，45μl-70μl，50μl-60μl，这显著低于文献报道的样品量，因此特别适用于临床试验中较少的血浆样本体积分析的目的。尽管蛋白沉淀法是优选的，本发明的方法也可以采用液液萃取法进行前处理。本发明人对液液萃取如叔丁基甲醚处理进行了研究，结果显示可以获得和甲醇蛋白沉淀较为一致的结果。
为了获得更好的峰型和色谱分离，本发明深入研究了不同的pH值范围较广的常用C18反相色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(50mm×4.6mm and50mm×2.1mm，3.5μm，Agilent)、Acquity UPLC BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm，Waters)和Acquity BEH Shield RP18(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters)，但是这些色谱柱存在严重的拖尾，并且残留严重。在本发明的条件下，令人惊讶地发现色谱柱ZORBAX SB-C8(100mm×2.1mm，3.5μm，Agilent)，在等梯度条件下，西莫替尼峰型对称，适合用于本发明。因此，在本发明的条件下，ZORBAX SB-C8或性质类似的色谱柱是优选的，这样的色谱柱是本领域已知的。本发明进一步研究的结果表明优选采用甲酸-甲酸铵与甲醇为流动相。更优选地，当甲醇与甲酸-甲酸铵溶液比例为80：20(v：v)时，对西莫替尼分离的峰型最佳，其中西莫替尼的出峰时间为1.8min，厄洛替尼的出峰时间为1.9min。并且甲醇与乙腈相比具有更高的信噪比(signal-to-noise，S/N)。
在本发明的方法中可以包括埃克替尼或厄洛替尼为内标候选物。本研究结果表明优选以厄洛替尼作为内标，其对西莫替尼无干扰。
本发明的研究确定西莫替尼的线性范围为1-1000ng/mL，结果表明在该范围内线性较好。r2均大于0.995。
因此，本发明提供了检测血浆中西莫替尼浓度的方法，其中通过超高效液相色谱串联质谱对血浆中西莫替尼的浓度进行分析。
在本发明的优选实施方案中，在所述超高效液相色谱串联质谱对血浆中西莫替尼的浓度进行分析前，可以通过蛋白沉淀法对血浆样品进行前处理。
在本发明的优选实施方案中，蛋白沉淀法可以通过甲醇或乙腈进行，优选通过甲醇进行。
在本发明的优选实施方案中，在超高效液相色谱串联质谱对血浆中西莫替尼的浓度进行分析前，可以通过液液萃取法对血浆样品进行前处理。
在本发明的优选实施方案中，液液萃取法可以通过叔丁基甲醚进行。本发明的方法可以采用较低的样品体积进行。在本发明的条件下，令人吃惊地发现较低的样品完全能够满足分析需要。本发明的方法已经证明在本发明的条件下显著低于文献报道的血浆样本体积如30μl-100μl，例如35μl-90μl，40μl-80μl，45μl-70μl，50μl-60μl的体积即能够满足分析需要，因此特别适合于临床试验中较少的血浆样本体积分析的目的。
在本发明的优选实施方案中，超高效液相色谱串联质谱可以采用ZORBAX SB-C8色谱柱或性质类似的色谱柱进行，这样的色谱柱是本领域已知的。
在本发明的优选实施方案中，超高效液相色谱串联质谱采用A：甲酸水-甲酸铵，B：甲醇为流动相。尤其优选的流动相中A：B的体积比为20/80。
在本发明的优选实施方案中，超高效液相色谱串联质谱包括内标，优选盐酸厄洛替尼。
本发明建立了建立了快速、灵敏的UPLC-MS/MS技术检测哺乳动物包括大鼠、小鼠、人血浆中西莫替尼的浓度。在本发明的优选实施方案中，可以采用甲醇蛋白沉淀法进行样本前处理，以盐酸厄洛替尼为内标。在本发明的优选实施方案中，可以采用ZORBAX SB-C8色谱柱(2.1mm×100mm，3.5μm)或性质类似的色谱柱作为分析柱，电喷雾离子化(ESI+)串联质谱检测。优选的流动相为甲酸-甲酸铵、甲醇(20/80，v/v)，流速为0.2mL/min。
本发明的方法实现了单个样本的分析时间仅为4min，样本的提取回收率大于90％，并且未见明显的基质效应。西莫替尼在1～1000ng/mL范围内线性关系良好；日内、日间精密度(RSD)均小于10.4％。
本发明方法的特异性、反复冻融稳定性、长期冻存稳定性和稀释效应均进行了验证。本发明的方法已经成功应用于给予盐酸西莫替尼片治疗患者的血药浓度检测。
附图说明
图1：西莫替尼(左)和内标(右)的分子结构和二级质谱图。
图2：西莫替尼(左)和内标厄洛替尼(右)特征性色谱图：双空白(Double-blank)，空白(Blank sample)，低定量下限(LLOQ)和受试者第一天给药后0.5h血浆样本(浓度为11ng/mL)。
图3：西莫替尼标准曲线。
图4：受试者西莫替尼第一天单次给药(100mg)、第8-10天和第15天多次给药(100mg/天)的血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
1.方法与结果
1.1.药品与试剂
西莫替尼标准品由江苏先声制药有限公司提供(纯度99.8％)，内标厄洛替尼标准品由江苏先声制药有限公司提供(纯度99.3％)。色谱纯甲醇购自Fisher公司，甲酸和甲酸铵购自Sigma公司，实验用水为超纯水。
1.2.设备和分析条件
1.2.1色谱条件：
流动相：A：0.1％甲酸水，10mM甲酸铵B：甲醇
流速：0.2mL/min
进样量：2μL
柱温：25℃
进样器内温度：5℃
流动相梯度设置：
1.2.2质谱条件：
电喷雾离子化源(ESI)，MRM多离子反应检测，正离子模式，喷雾电压5500v，温度450℃，GAS1流速为25mL/min，GAS2流速为30mL/min，CUR为15mL/min，DP、EP及CXP值分别为135V、7V、35V。在ESI离子化方式下，西莫替尼主要生成[M+H]+准分子离子峰，为m/z501.2，主要碎片离子为m/z182.2，CE为35(图1)。盐酸厄洛替尼主要生成的[M+H]+准分子离子峰，为m/z394.1，主要碎片离子为m/z278.1，CE为35(图1)。图1显示西莫替尼(左)和内标(右)的分子结构和二级质谱图。
1.3.标准溶液和内标工作液制备
血浆测定用西莫替尼标准溶液的配制：取西莫替尼对照品适量，精密称定，以甲醇为溶剂溶解，定量配制成西莫替尼浓度为1mg/mL的标准溶液储备液，再以甲醇定量稀释至10、30、100、300、1000、3000、10000ng/mL的标准曲线工作溶液，及20、400、8000ng/mL的质控溶液。
盐酸厄洛替尼(内标)溶液的配制：取盐酸厄洛替尼对照品适量，精密称定，以甲醇为溶剂溶解，定量配制成盐酸厄洛替尼浓度为1mg/mL的标准溶液储备液，再以甲醇定量稀释至50ng/mL的标准工作溶液。
以上溶液均置于-20℃保存备用。
1.4.血浆样品处理
精密量取血浆样品50μL，置1.5mL的Ep管中，精密加入内标标准工作溶液20μL，涡旋混匀10s，加入甲醇400μL，涡旋10s，于12000rpm离心10min，吸取50μL上清液于进样瓶内，取2μL进行LC-MS/MS分析。
1.5.方法验证
参照FDA生物样本检测指导原则[28]，方法学验证包括方法的灵敏度、特异性、标准曲线与线性范围、精密度与准确度、样品稳定性、提取回收率、基质效应、稀释效应、方法学质控等方面。
1.5.1.特异性和灵敏度
分别取6个不同受试者的空白血浆50μL，除不加内标外，按“1.4血浆样品处理”项下依法操作，进行LC-MS/MS分析，获得空白血浆样品色谱图(图2)。
分别取6个不同受试者的空白血浆45μL，加入10ng/mL的西莫替尼标准溶液5μL，按“血浆样品的处理”依法操作，进行LC-MS/MS分析，获得空白血浆样品+西莫替尼+内标对照品色谱图(图2)。
图2显示西莫替尼(左)和内标厄洛替尼(右)特征性色谱图：双空白(Double-blank)，空白(Blank sample)，低定量下限(LLOQ)和受试者第一天给药后0.5h血浆样本(浓度为11ng/mL)。
1.5.2.精密度和准确度
配制血浆西莫替尼浓度为2ng/mL，40ng/mL，800ng/mL的低、中、高3个浓度的样品，每个浓度制备6份，作为一批精密度和准确度样品，按“2.4血浆样品的处理”项下操作，一天配制一批精密度和准确度样品，不同3天，测定三批精密度和准确度样品，记录色谱图，计算药物峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，代入当天的标准曲线求得实测浓度，计算批内和批间精密度和准确度。精密度和准确度分别用RSD％和RE％表示，其绝对值小于15％为合格，低质控点小于20％为合格。结果见表1。
表1.西莫替尼精密度和准确度
1.5.3.标准曲线和低定量下限
取空白血浆45μL，分别加入西莫替尼标准溶液5μL，配制成相当于血浆中西莫替尼浓度为1ng/mL，3ng/mL，10ng/mL，30ng/mL，100ng/mL，300ng/mL以及1000ng/mL的血浆样品，按“1.4血浆样品的处理”项下自“精密加入内标溶液20μL”起同样操作，记录色谱图；以西莫替尼浓度与内标浓度比值(X)为横坐标，西莫替尼与内标物的峰面积比值f为纵坐标，用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。结果(图3)表明西莫替尼在1～1000ng/mL浓度范围内线性关系良好。
同法制备六组定量下限样品，根据当天标准曲线求得实测浓度，每天制备一批次，连续3天检测。
图3显示了西莫替尼标准曲线。
1.5.4.残留效应
残留效应验证为在高浓度样本检测后以空白样本进样，分析西莫替尼和内标出峰时间处仪器的响应值。在高浓度西莫替尼后进样空白血浆样品，在西莫替尼出峰处有峰面积相当于30-40％LLOQs的峰出现，表明存在一定的残留，再进空白样品时，该峰峰面积为LLOQ的15％。因此在高浓度样本进样后需进空白样品以降低残留效应。
1.5.5.提取回收率和基质效应
组1：精密吸取空白血浆45μL，置1.5ml的Ep管中，加甲醇400μL，涡旋1min，于12000rpm离心10min，吸取全部上清液于另一Ep管中，精密加入浓度分别为20ng/mL，400ng/mL，8000ng/mL的西莫替尼标准工作液5μL，精密加入内标溶液20μL，涡旋混匀后，于12000rpm离心5min，取2μL进行LC-MS/MS分析。每个浓度各制备6份，记录色谱图，记录各浓度西莫替尼和内标的峰面积。
组2：按“血浆样品标准曲线”测定方法配制成血浆西莫替尼浓度为2ng/mL，40ng/mL，800ng/mL的低、中、高三种不同浓度的血浆样本各6份，按上述“2.4血浆样品处理方法”同样操作，进行LC-MS/MS分析，记录色谱图，记录各浓度西莫替尼和内标的峰面积。
组3：在Ep管中精密加入浓度为20ng/mL，400ng/mL，8000ng/mL的标准溶液5μL，精密加入内标溶液20μL，加入水45μL和甲醇400μL，涡旋混匀，每个浓度样本各制备三份，取上清液2μL进行LC-MS/MS分析。记录色谱图，记录各浓度西莫替尼和内标的峰面积。
结果见表2，表明西莫替尼的提取回收率在不同浓度均大于90％，且未见基质效应，内标提取回收率和基质效应与西莫替尼一致。
表2.西莫替尼和内标的提取回收率和基质效应(n＝6)
1.5.7稳定性
稳定性考核覆盖整个样本的检测过程，设置低、中、高(2.00，40.0和800ng/mL)三个浓度，每一个浓度重复五个样本，考察血浆样本的室温12h稳定性、-80℃两个月稳定性、三次反复冻融稳定性、萃取后样本在进样器内稳定性以及储备液长期稳定性。结果见表3。
表3.西莫替尼稳定性(n＝5，均值(％偏差))
1.5.8.稀释效应
十倍稀释：制备西莫替尼浓度为1000ng/mL的血浆样品，用空白血浆稀释五倍后，取50μL含药血浆，按“2.4血浆样本的处理”项下自“精密加入内标溶液20μL”起同法操作，处理完毕后进样分析，每个浓度制备6个样本。随行标准曲线和质控计算实测浓度。
2.药代动力学应用
筛选既往接受过一个或以上含铂标准化疗方案后无效或复发，或无标准治疗方案的局部晚期和/或转移性NSCLC患者，给予盐酸西莫替尼片，每日2次(健康受试者单次给药的t1/2为6.08-16.01h)，连续28天。给药剂量为100mg。受试者于d1给药前(0.05h)及给药后1h、2h、3h、6h、9h、12h、24h及d8、d15、d22早晨给药前(0.05h)以及d28给药前(0.05h)及给药后1h、2h、3h、6h、9h、12h，各采集肘静脉血2ml。血样采集后置于事先已经贴好标签的试管内，在10分钟内离心(3000rpm，10min)分离血浆，血浆转移至EP管中置-80℃冰箱保存。单次给药和多次给药的药代动力学参数由软件WinNolin6.3以非房室模型计算获得，图4显示了该受试者口服西莫替尼片后的药时曲线。
图4显示了受试者西莫替尼第一天单次给药(100mg)、第8-10天和第15天多次给药(100mg/天)的血药浓度-时间曲线。
Claims (10)
1.检测血浆中西莫替尼浓度的方法，其中通过超高效液相色谱串联质谱对血浆中西莫替尼的浓度进行分析。
2.权利要求1所述的方法，其中在所述超高效液相色谱串联质谱对血浆中西莫替尼的浓度进行分析前，通过蛋白沉淀法对血浆样品进行前处理。
3.权利要求2所述的方法，其中所述蛋白沉淀法通过甲醇或乙腈进行，优选通过甲醇进行。
4.权利要求1所述的方法，其中在所述超高效液相色谱串联质谱对血浆中西莫替尼的浓度进行分析前，通过液液萃取法对血浆样品进行前处理。
5.权利要求4所述的方法，其中所述液液萃取法通过叔丁基甲醚进行。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中用于分析的血浆样品的体积为30μl-100μl，例如35μl-90μl，40μl-80μl，45μl-70μl，50μl-60μl。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述超高效液相色谱串联质谱采用ZORBAX SB-C8色谱柱进行。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述超高效液相色谱串联质谱采用A：甲酸水-甲酸铵，B：甲醇为流动相。
9.权利要求8所述的方法，其中A：B的体积比为20/80。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述超高效液相色谱串联质谱包括内标，优选盐酸厄洛替尼。
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