CN103525868B - 哺乳动物细胞高效表达载体的构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及哺乳动物细胞高效表达载体pSNEO，该载体是基于新霉素抗性筛选基因NEO通过联合弱化筛选基因表达和增强目的基因表达的策略构建而成。其中，筛选基因的弱化包括两方面，在启动子中引入缺失突变实现筛选基因的转录弱化，然后在筛选基因翻译起始位点前引入发夹结构序列以实现筛选基因的翻译弱化。目的基因的表达增强是在目的基因表达框的多克隆位点与PolyA加尾信号之间加入转录调控元件WPRE序列。本发明构建的pSNEO载体可以方便快速的完成目的基因的稳定高表达细胞株的构建，为大分子重组蛋白的制备提供了新的工具。

Description

哺乳动物细胞高效表达载体的构建及应用

技术领域

本发明涉及生物制药基因工程表达技术，具体涉及一种哺乳动物细胞高效表达载体的构建及应用。

背景技术

哺乳动物细胞高效表达***及高表达工程细胞株的获得是基因工程药物研究和生产的瓶颈，而表达载体和宿主细胞是哺乳动物细胞表达***的两个基本组成部分。目前用于制备基因工程药物的表达***包括以大肠杆菌为宿主的原核表达***和以酵母、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞为宿主的真核表达***。

CHO表达***是目前应用最广泛的真核表达***之一，是为数不多的可进行高密度悬浮培养的动物细胞之一。CHO细胞表达的外源基因产物与天然蛋白在结构、糖基化类型和方式上几乎相同，且能正确组装成多亚基蛋白，并可大规模、高密度培养。但是该细胞系在表达外源基因时存在着培养成本高、周期长、表达量低等问题。因此，建立哺乳动物细胞高效表达***包括高表达载体构建、高表达工程细胞株的获得、生物反应器无血清高密度培养工艺以及目标蛋白的分离纯化工艺，是生物制药工业研究和生产的关键技术。本发明就哺乳动物细胞高表达载体的构建做了进一步研究。

目的基因在哺乳动物细胞中的表达受整合目的基因的染色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、翻译和翻译后加工修饰的效率影响。构建一个高表达的哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位点的优化、转录与翻译效率的提高以及目的基因的拷贝数的增加等方面综合考虑。

一、整合位点的优化。目的基因在CHO细胞染色体上整合位点的状态对于目的基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中的稳定性起着决定性作用，只有那些整合位点处于染色体活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因。其方法主要有：（1）利用选择基因的弱化表达提高转基因表达水平；（2）利用核基质附着区提高转基因表达水平；（3）利用位点特异性重组提高目的基因表达水平。二、增加目的基因拷贝数。单拷贝或低拷贝目的基因，无论表达载体调控元件如何优化、整合的染色***点多么合适，其外源基因表达量都是有限的，因此通过增加目的基因拷贝数来获得高表达重组药物的CHO工程细胞株是基因工程药物研究不可或缺的重要环节。三、转录水平的提高。启动子及其相应的增强子、转录终止信号及多聚腺苷酸加尾信号对转录水平的高低及mRNA的稳定性有很大影响，其中强启动子、增强子是提高转录水平的关键因素。四、提高翻译水平。翻译水平的调控（如mRNA寿命，mRNA的翻译起始效率）和翻译产物加工修饰的效率也对目的基因的表达产生重要影响。Poly A的存在不但能影响mRNA稳定性，而且也能部分引起“翻译增强子”的作用，提高mRNA翻译水平。

为了获得高表达细胞株，一般都是通过将携带目的基因及筛选基因的真核表达载体转染进细胞后随机整合到基因组中实现目的基因的稳定表达，通过筛选基因的筛选，得到稳定的转染子。

常用的真核筛选基因有NEO基因、GS基因等。NEO基因是一种常用的获得稳定表达细胞株的筛选基因，编码氨基糖苷磷酸转移酶，可以将G418转变成无毒形式。G418 是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞等原核和真核等细胞都有毒性，是稳定转染最常用的选择试剂。当NEO基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动NEO基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。

在细胞中表达水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现。由于在特定的细胞内，反式作用因子是固定的，不可改变的，因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。为了得到高表达细胞株，借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达目的基因。必须的顺式作用元件包括：真核启动子、增强子、加尾信号序列等，此外还包括一些特定的5′端非翻译区或3′端非翻译区。尤其是mRNA5′端非翻译区的发夹(hairpin)结构是一类非常重要然而又常常受到忽视的顺式作用元件。如果mRNA的翻译起始密码子ATG附近存在稳定的发卡结构，从而影响到翻译起始效率，尤其是那些非常稳定的发卡的存在会完全抑制翻译起始。同时也有报道表明，当5′非翻译区存在富含G-C配对的茎环(stem-loop)结构时，翻译起始复合体很难在体外组装成功，从而影响翻译的起始（Pestova TV, Kolupaeva VG. Genes Dev.2002,16(22):2906-2922.）。

在真核表达载体中，常用的真核启动子为巨细胞病毒（Cytomegalovirus, CMV）启动子、猴空泡病毒40（Simian virus 40，SV40）启动子、小鼠巨细胞病毒（Mouse cytomegalovirus，mCMV）启动子等。有研究表明：在CHO细胞中，CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR（Rous肉瘤病毒基因）启动子的10倍和30倍左右，在之前的研究中我们通过一个比较强的启动子如CMV promoter来驱动目的基因的表达，和一个稍弱的启动子如SV40 promoter来表达筛选基因，但是最后形成的克隆仍是很多，从成千上万个转染子中筛选高表达细胞系仍然是很困难的，通常需要耗费很长时间。

选择基因（如neo、dhfr）的弱化表达，使大量整合在低表达整合位点的细胞由于选择标记基因表达量不够而在选择培养基条件下死亡，只有那些少量整合在转录活跃区的细胞由于表达足够的选择基因产物而存活下来形成克隆。在弱化选择基因的表达上，本领域的研究者做了很多尝试：（1）通过基因突变来削弱筛选基因的功能（Sautter K, Enenkel B. Bioengineer. 2005 Mar 5;89(5):530-8. ）；（2）通过改造起始密码子邻近的基因序列来弱化筛选基因的表达（Reff, US Patent No. 5,733,799, 1998 );（3）通过对起始密码子本身进行改造，使筛选基因的起始密码子具有比较低的翻译起始效率，之后连接的目的基因的起始密码子为优化的密码子，从而提高目的基因的表达（Van Blokland et al. J Biotechnol. 2007 Feb 1;128(2):237-45）。有文献报道，删除SV40启动子中两个重复72bp序列，或在删除一个72bp重复序列后，在剩余的一个72bp重复序列的第5-7位引入TGG-GTT突变，可使SV40启动子转录活性分别降低为野生型的1/3、1/1000及1/36（ JamesJ, Lucy CP, Patricia ED.Sciense.1994;249:404-406）。通常情况下，经过这样严格的筛选，表达筛选基因低的细胞将会被更有效的杀死，表达筛选基因高的细胞才能存活下来；同时形成的克隆会比较少，这些克隆一般会比较高水平的表达目的蛋白。

据报道，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element, WPRE）是存在于土拨鼠肝炎病毒基因组序列（GenBank Accession No.J04514）的HBVPRE(人乙型肝炎病毒转录后调控元件)相类似的区域，是基因组序列第1093位到1684位的592个碱基的转录后调控区域（Journal of Virology,Vol.72,5085-5092,1998）,可以增强基因的表达水平(US 6284469 B1)。关于WPRE的报道主要集中在与病毒载体相关的基因治疗方面。中国专利CN102618579A公开了HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建证实了添加调控元件WPRE可以提高杆状病毒介导外源基因在CHO细胞中的表达率。专利CN102533862A中发明人成功地构建EGFP基因重组杆状病毒表达载体，WPRE增强了外源基因的表达效率。同时有文献报道WPRE可以提高蛋白的瞬时表达水平（Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2009 October; Volume 14, Issue 5, pp 633-638）。

本发明基于以上思路，构建了一种携带筛选基因的真核表达载体pSNEO，筛选基因的启动子是弱化后的SV40启动子，同时在筛选基因翻译起始位点前引入发卡结构，共同的目标是使转染子的形成率大大降低，只有那种整合位点较好，高表达目的基因的转染子才可以存活下来。同时加入转录调控元件WPRE，利用该载体可以简单快速的获得目的基因的稳定高表达细胞株，为真核重组蛋白的表达提供了新的工具。

发明内容

本发明在现有技术的基础上，构建了真核表达载体pSNEO，该载体主要由筛选基因表达框与目的基因表达框组成。该真核表达载体pSNEO的筛选基因启动子是弱化的SV40启动子，即SV40′，可以降低筛选基因的转录水平；筛选基因翻译起始位点前引入发夹结构序列，该序列可以降低筛选基因的翻译水平；目的基因表达框的多克隆位点与rabbit beta-globin polyA之间加入WPRE序列，该转录后调控元件可以增强目的基因mRNA的稳定性，进而提高目的基因的表达水平。

弱化的SV40启动子和发夹结构序列可以确保本发明中的载体上的筛选基因的低水平表达，因而在该载体整合至宿主细胞的基因组之后，只有整合在适合外源基因高表达的“热点”位置（hot-spot）的克隆才能存活，不仅能够有效克服高表达克隆筛选过程的“位置效应”（position effect），而且减少了筛选过程中的低表达背景克隆。联合WPRE序列，本发明将能够有效提高构建高表达细胞株的效率。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种真核表达载体，该载体是以pTSE载体为基础改造获得，包括表达弱化的筛选基因表达框和表达增强的目的基因表达框，该载体被命名为pSNEO。

所述的真核表达载体，其表达弱化的筛选基因表达框依次含有弱化的SV40启动子、发夹结构、筛选基因、SV40 polyA加尾信号；表达增强的目的基因表达框依次含有CMV启动子，多克隆位点，转录后调控元件WPRE和 rabbit beta-globin polyA加尾信号。

所述弱化的SV40启动子核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的发夹结构核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述WPRE核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

所述的的真核表达载体，其筛选基因是新霉素抗性基因NEO。

本发明同时提供了所述基础载体pTSE载体的构建方法，具体步骤如下：

以pTT载体为基础进行改造获得pTSE载体，关于pTT载体的制备过程在参考文献（Yves Durocher，Sylvie Perret and Amine Kamen，Nucleic Acids Research,2002，Vol. 30, No. 2 e9)中有详细的描述。pTSE载体的制备过程如下：首先用EcoRI单切pTT载体，接着用T4 DNA polymerase将产生的粘性末端补平，重新连接该载体，消除EcoRI酶切位点；接着将得到的载体用SalI单切，用T4 DNA polymerase将产生的粘性末端补平，重新连接该载体，消除SalI酶切位点，得到pTT′载体。合成含信号肽及多克隆位点的序列如下：5’-agtgtttaaacggagaattcgccgccaccATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGGTCGACCGGTGGCGCCAAGCTTGGATCCAGA-3’，下划线部分分别为PmeI、EcoRI、BamHI位点，方框部分为信号肽序列，便于表达的外源蛋白分泌到胞外。PmeI及BamHI双酶切该序列后定向克隆入pTT′载体的PmeI及BamHI之间，从而引入信号肽及多克隆位点（包括SalI、AgeI、KasI、HindIII及BamHI），得到pTSE载体，结构如图1所示。

为了构建pSNEO，接着对pTSE载体进行了改造，在目的基因表达框的多克隆位点与rabbit beta-globin polyA之间定向克隆入WPRE，得到表达载体pTSE-w，为了证明WPRE的功能，我们分别构建了抗CD22的人源化抗体hRFB4的轻链与重链基因表达载体pTSE-hRFB4K及pTSE-hRFB4H、 pTSE-hRFB4K-w及pTSE-hRFB4H-w，在相同的条件下转染293E细胞，比较它们的蛋白表达量，具体见实施例1。

接着在pTSE-w的基础上，连接入SV40′-NEO-SV40polyA表达单元，在NEO基因翻译起始位点ATG前引入可形成发卡结构的序列，如SEQ ID No：2所示，构建成真核表达载体pSNEO。连接的SV40′-NEO-SV40polyA表达单元来源于商业化的pcDNA3.1+载体（购自invitrogen），通过设计引物缺失突变SV40启动子序列的第一个72bp重复序列及第二个72bp重复序列的前26个碱基。为了验证该载体的有效性，我们构建了肿瘤坏死因子TNF-α的表达载体pSNEO-TNF，用于稳转细胞株的筛选，阳性克隆形成率很高，具体见实施例2。同时构建了抗原癌基因人类表皮生长因子受体2即Her2的抗体antiHer2的表达载体pSNEO-antiHer2，用于稳转细胞株的筛选，最后得到高表达的稳转细胞株，具体见实施例2。

本发明同时提供了所述真核表达载体的构建方法，具体步骤如下：

（1）在目的基因表达框的多克隆位点与rabbit beta-globin polyA之间定向克隆入WPRE，构建含WPRE序列的表达载体，命名为pTSE-w；

（2）由PcDNA3.1⁺制备筛选表达单位SV40′-NEO-SV40polyA；

（3）在NEO基因翻译起始位点ATG前引入可形成发卡结构的序列，构建真核表达载体命名为pSNEO。

本发明同时提供了所述的真核表达载体在单基因或双基因表达中的应用。

本发明同时提供了所述的真核表达载体在制备哺乳动物细胞高表达细胞株中的应用。

该载体不仅能实现蛋白在瞬时表达水平上的提升，而且能够快速得到稳定的高表达株，缩短了稳转细胞株的研发周期。

附图说明

图1 为pTSE质粒图谱。

图2为pTSE-w质粒图谱。

图3为hRFB4抗体纯化产物电泳图。其中，泳道1代表pTSE-hRFB4K与pTSE-hRFB4H共转染293E细胞收获的上清纯化后的电泳图，泳道2代表pTSE-hRFB4K-w与pTSE-hRFB4H-w共转染293E细胞收获的上清纯化后的电泳图，marker指的是Themo的PageRuler Unstained Protein Ladder，10-200KDa蛋白质分子量标准。

图4 为发卡结构示意图。

图5为pSNEO质粒图谱。

图6为pSNEO-TNF质粒图谱。

图7为表达TNF膜蛋白的CHO-S稳转细胞株流式检测结果图。其中2、4、5、6、8号为阳性克隆，1、3、7、9、10号克隆为阴性克隆。

图8为pSNEO-antiHer2质粒图谱。

图9为表达antiHer2抗体的10株pSNEO-antiHer2稳转细胞株表达示意图。

下面对所有质粒图谱中的缩写标注进行解释：Amp-R是氨苄青霉素抗性基因；pBR 322 ori是质粒pBR322复制原点；PSV40′是弱化后的SV40早期启动子；hairpin是可形成发卡结构的序列；NEO是新霉素抗性基因；SV40 polyA是SV40病毒蛋白表达的加尾信号序列；PCMV是人巨细胞病毒启动子；leader是信号肽序列；WPRE是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；Rabbit beta-globin polyA是兔β球蛋白加尾信号序列；EBV ori是EBV病毒复制原点；TNF是一种肿瘤坏死因子；antiHer2-L是antiHer2抗体的轻链序列；antiHer2-H是antiHer2抗体的重链序列。

具体实施方式：

下述实施例中所述实验方法如无特殊说明均为常规实验方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：pTSE-w载体的构建及WPRE序列的有效性的验证

1、pTSE-w载体的构建：

WPRE序列如SEQ IN NO：3所示，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。设计PCR引物扩增，然后用BamHI和BglII酶切，得目的片段。

P1：5’-TAGGGATCCAATCAACCTCTGGA-3’

P2：5’- TGTAGATCTCGAAGACGCGGAAGAGGCCG-3’

用BamHI线性化pTSE载体，并进行去磷酸化，防止载体自连；因为BamHI及BglII为同尾酶，产生的粘性末端可以连接，最后挑取WPRE***方向为正向的pTSE-w载体（我们规定与PCMV-MCS-RBGpolyA相同的***方向为正向）。此时保留原来多克隆位点的BamHI位点，WPRE序列连入后，下游的酶切位点消失。BamHI与BglII双酶切的WPRE序列与BamHI线性化的pTSE载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取克隆，提取质粒，测序得到正确的pTSE-w载体，如见图2所示。

、WPRE序列的有效性的验证：

通过构建人源化的抗CD22抗体的轻链与重链基因表达载体pTSE-hRFB4K及pTSE- hRFB4H、pTSE-hRFB4K-w及pTSE-hRFB4H-w来验证WPRE序列的有效性。

扩增hRFB4重链（hRFB4H）所需的引物是P3与P4，扩增hRFB4轻链(hRFB4K)所需的引物是P5与P6；以pGH-hRFB4K与pGH-hRFB4H质粒(即CN 103214578A 说明书第6页第54段公开的含hRFB4轻链和重链基因的pCDNA3.1的载体，此处分别命名为pGH-hRFB4K和pGH-hRFB4H，由上海捷瑞生物工程有限公司全合成)为模板合成引物：

P3：5’-cggGtcGaccggTGAAGTGCAGCTGGT-3’

P4：5’-GACGGATCCTCATTTACCCGGGGACAGGGA-3’

P5：5’-cggGtcGaccggTGATATCCAGATGACCCAGAGC-3’

P6：5’-GACGGATCCTAACACTCTCCCCTGTTGA-3’

P3与P5下划线部分是SalI酶切位点，P4与P6下划线部分是BamHI酶切位点。SalI与BamHI双酶切pTSE-w及pTSE载体，并双酶切由PCR得到的hRFB4K及hRFB4H，分别进行连接转化鉴定后得到正确的pTSE-hRFB4K、pTSE- hRFB4H、pTSE- hRFB4K-w及pTSE- hRFB4H-w四种载体。

在完全平行的条件下，将pTSE-hRFB4K与pTSE-hRFB4H等量各取15ug共转染30ml 293Ecell，pTSE- hRFB4K-w及pTSE- hRFB4H-w等量各取15ug共转染30ml 293E细胞，分别在3天后收获上清，用Protein A进行纯化。pTSE- hRFB4K与pTSE- hRFB4H共转染收获的上清纯化后得到的蛋白总量是1.1mg，pTSE- hRFB4K-w及pTSE- hRFB4H-w共转染收获的上清纯化后得到的蛋白总量是2mg。

各取500ul收获的-上清加入1×PB（0.02M，pH7.0）平衡好的Protein A悬液，使Protein A与培养上清中的抗体充分结合，离心舍弃上清，在余下的Protein A介质中加入50ul 1×loading buffer，沸水煮3-5min。取出煮好的样品，冷却后再离心一下样品，取上层澄清液体5ul，上样于SDS-PAGE胶，电泳结果如图3，结果证明pTSE载体连入WPRE序列后可以提高蛋白的表达水平。

实施例2：pSNEO载体的构建及在细胞株构建方面高效性的验证

1、pSNEO载体的构建

以pTSE-w载体为基础，构建用于筛选稳转细胞株的载体pSNEO，具体的构建方法如下：以PcDNA3.1⁺质粒（购自Invitrogen公司）为模板，合成引物序列如下(PNEOF-1与PNEOR-2合成5’端磷酸化引物)：

PNEOF-1：5’-GCAGGCAGAAGTATGCAAAG-3’

PNEOR-1：5’-GATGTCTACTGCATCCTCGATGTGATCAGATCCGAAAAT-3’

PNEOF-2：5’-AGGATGCAGTAGACATCCTCGATGATTGAACAAGATGGAT-3’

PNEOR-2：5’-GATATCGCTACATGTATACAGACATGATAAGATACATTGATG-3’

方框标注部分为反向互补序列，下划线部分分别是EcoRV与PciI酶切位点，PNEOF-1与PNEOR-1扩增得到片段NEO1，PNEOF-2与PNEOR-2扩增得到片段NEO2，以PNEOF-1与PNEOR-2为引物，NEO1与NEO2为模板，重叠PCR得到 “SV40′启动子-hairpin-NEO-SV40 polyA”单元，该单元的启动子是缺失5’-CTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCA-3’片段的弱化的启动子，同时在翻译起始位点ATG前引入序列5’-CATCGAGGATGCAGTAGACATCCTCGATG-3’，该序列可形成发卡结构，如图4所示，影响筛选基因的翻译起始；在该筛选单元的下游引入EcoRV与PciI酶切位点，便于构建重链与轻链在一个载体的全抗体表达载体。PciI单切质粒pTSE-w，然后用T4 DNA polymerase将产生的粘性末端补平，接着用CIP进行去磷酸化，回收后连接pTSE-w和5’端磷酸化的筛选基因表达单元PCR产物，构建质粒pSNEO，如图5所示，经过鉴定测序挑取正向方向的克隆（我们规定与PCMV-MCS-Rabbit beta-globin polyA相同的***方向为正向，MCS指多克隆位点）。

2、pSNEO载体在稳转细胞株构建方面具有高效性的验证

2.1载体pSNEO-TNF的构建：

为了验证真核表达载体pSNEO在稳转细胞株构建方面具有高效性，我们构建了表达肿瘤坏死因子TNF-α的载体pSNEO-TNF。

以pGH-TNF(T.Arora et al. Cytokine 45(2009)124-131中第125页所用的含突变的TNF DNA序列的慢病毒载体，此处命名为pGH-TNF载体，由上海捷瑞生物工程有限公司合成)为模板合成扩增TNF的引物序列：

PTNFF：5’-AGCGAATTCGCCGCCACCATGAGCACTGAAAGCATGATC-3’ 

PTNFR：5’-ACTGGATCCTCACAGGGCAATGATCC-3’             

下划线部分分别为EcoRI与BamHI酶切位点，方框部分为kozak序列，将扩增的PCR片段定向***pSNEO载体的EcoRI与BamHI酶切位点之间，得到正确的pSNEO-TNF质粒，如图6所示。

将pSNEO-TNF质粒转染CHO-S细胞，具体的转染过程参见Lipofectamine2000(购自Invitrogen，Cat.No.11668-019)的说明书，转染及筛选过程如下：转染前一天在六孔板中每孔接种6×10⁵个CHO-S细胞，转染时每孔需10ul Lipofectamine2000及4ug SSpI线性化的pSNEO-TNF质粒，转染24h后，以1:10的比例将细胞传代至150mm细胞培养皿中，传代24h后换成筛选培养基进行筛选，筛选培养基是含10% FBS、4mM Glutamine和500 ug/ml G418的IMDM培养基；接下来每2-3天更换筛选培养基，10-14天后可见清晰的单克隆形成，每个150mm细胞培养皿大概长单克隆30-50个，随机挑取10个单克隆扩大培养到12孔板，接着扩大到6孔板，待细胞汇合度达到90%时，进行鉴定。

通过流式细胞仪鉴定表达的TNF-α 膜蛋白，具体的方法如下：首先配含1%BSA的PBS工作液，每个克隆分别取1×10⁶个细胞，用工作液洗2遍细胞，接着孵育抗TNF-α的抗体humira（购自国药控股北京有限公司），每管加入100ul浓度为10ug/ml的humira抗体稀释液重悬细胞，4℃孵育1h；用工作液洗2-3遍细胞，将未结合的humira抗体全部洗掉；接着孵育以1:50稀释的IPTG标记的山羊抗人IgG二抗（购自中杉金桥有限公司），每管加入100ul二抗工作液，混匀重悬后4℃孵育1h；将细胞洗2-3遍后，重悬至500ul的PBS工作液中，用流式细胞仪进行检测，检测结果见图7。在检测的10个单克隆中阳性克隆率占50%，证明构建的pSNEO载体能很好的应用于稳转细胞株的构建，且阳性克隆形成率很高。

2.2载体pSNEO-antiHer2的构建：

为了验证pSNEO载体在稳转细胞株构建方面具有高效性，我们构建了抗原癌基因人类表皮生长因子受体2即Her2的抗体antiHer2的表达载体pSNEO-antiHer2。

2.2.1 pTSE-antiHer2L-w的构建

以pBT-antiHer2质粒（US20090202546A1，2009年8月13日中公开的含SEQ IN NO：13轻链和SEQ IN NO：14重链氨基酸序列的载体，此处命名为pBT-antiHer2，由上海捷瑞生物工程有限公司合成）为模板，设计并合成以下引物：

PantiHer2LF: 5’-TCAGTCGACCGGTGACATCCAGATGACCCAGAG-3’

PantiHer2LR: 5’- GACGGATCCTAACACTCTCCCCTGTTGA -3’

其中下划线部分分别为SalI及BamHI的酶切位点，将扩增到的PCR产物antiHer2轻链即antiHer2L片段定向***pTSE-w载体的SalI与BamHI位点之间，得到pTSE-antiHer2L-w。

以构建好的pTSE-antiHer2L-w为模板，设计并合成以下引物：

PLEUF: 5’- TTGCTCACATGTTCTTTCCTG -3’

PLEUR: 5’-GATCTCGACCAAATGATTTGC-3’

下划线部分为PciI酶切位点，以pTSE-antiHer2L-w为模板，PLEUF及PLEUR扩增得到antiHer2轻链的整个表达单元“pCMV-leader-antiHer2L- polyA”。

2.2.2 pSNEO-antiHer2H的构建

以pBT-antiHer2质粒为模板，设计并合成以下引物：

PherceptinVHF：5’-TCAGTCGACCGGTGAGGTGCAGCTGGTGG-3’

PherceptinCHR：5’-GACGGATCCTCAACCCGGGGACAGGGAGAGG-3’

其中下划线部分分别为SalI及BamHI的酶切位点，将扩增的antiHer2重链片段antiHer2H定向***pSNEO载体的SalI及BamHI酶切位点之间，得到载体pSNEO-antiHer2H。

2.2.3 pSNEO-antiHer2构建

将上述2.2.1扩增得到的anti-Her2轻链表达单元PciI酶切后定向***到pSNEO-antiHer2H的PciI及EcoRV之间，得到正确的pSNEO-antiHer2载体，如图8所示。

将pSNEO-antiHer2质粒转染CHO-S细胞，具体的转染过程参考pSNEO-TNF的转染，转染及筛选过程如下：为了获得高表达的稳转细胞株，我们将起始转染细胞数扩大为6×10⁶个细胞，转染24h后，以1:10的比例将转染的细胞传代至150mm细胞培养皿中，传代24h后换成筛选培养基进行筛选，筛选培养基是含10%FBS、4mMGlutamine和500ug/mlG418的IMDM培养基；接下来每2-3天更换筛选培养基，10-14天后可见清晰的单克隆形成，此时我们通过消化传代，将150mm细胞培养皿中的单克隆混在一起形成混合克隆，即clone pool，计数后通过有限稀释法将细胞稀释到5个/ml，于96孔细胞培养板中每孔接种200ul稀释的细胞悬液，共接种10板96孔板，每板单克隆的形成率为30%左右。7天后，通过ELISA方法进行稳定表达细胞株的初筛。

具体ELISA方法如下：将山羊抗人纯化IgG(购自中杉金桥)用包被液稀释，100ul/孔包被ELISA亲和96孔板，4℃包被过夜；接着以200ul/孔的封闭液（PBST+1%BSA）37℃封闭1h；PBST洗板3次，将待测样品等量稀释后100ul/孔加入96孔板，37℃孵育1h；PBST洗板3-4次；将辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG二抗（购自中杉金桥）以1:10000的比例稀释至PBST中配成二抗工作液，每孔加入二抗工作液100ul，37℃孵育30min-1h；PBST洗板3-4遍；用TMB底物显色试剂盒（购自康为世纪，Cat.No.CW0050）中的试剂配置的显色工作液显色，0.5MH₂SO₄终止显色，于酶标仪上测OD450及OD630值。

通过一轮初筛后挑选表达antiHer2抗体的稳转细胞株，比较选择后挑选相对表达量高的单克隆10个，扩大培养到12孔板中，待细胞汇合度达到90%左右，进行细胞计数，以1×10⁵/ml细胞每孔接种1ml至24孔板，24h后收取上清，通过ELISA方法进行表达分析，表达antiHer2蛋白的10株细胞株表达量在6.5-18pg/cell/day，具体的表达结果如图9所示。

Claims (7)

1.一种真核表达载体，该载体是以如图1所示的pTSE载体为基础改造获得，其特征在于，该载体包括表达弱化的筛选基因表达框和表达增强的目的基因表达框，该载体被命名为pSNEO，表达弱化的筛选基因表达框依次含有弱化的SV40启动子、发夹结构、筛选基因、SV40 polyA加尾信号；表达增强的目的基因表达框依次含有CMV启动子，多克隆位点，转录后调控元件WPRE和rabbit beta-globin polyA加尾信号；所述弱化的SV40启动子核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述的发夹结构核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于，所述WPRE核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于，筛选基因是新霉素抗性基因NEO。

4.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于，所述pTSE载体为如图1所示的载体，其构建步骤如下：

(1)以pTT载体为基础，消除EcoRI酶切位点和SalI酶切位点，所得载体命名为pTT′载体；

(2)合成含信号肽及多克隆位点的序列，PmeI及BamHI双酶切该序列后定向克隆入pTT′载体的PmeI及BamHI之间，所述多克隆位点包括SalI、AgeI、KasI、HindIII及BamHI，所得载体命名为pTSE载体。

5.构建权利要求1所述真核表达载体的方法，具体步骤如下：

(1)在目的基因表达框的多克隆位点与rabbit beta-globin polyA之间定向克隆入WPRE，构建含WPRE序列的表达载体，命名为pTSE-w；

(2)由PcDNA3.1⁺制备筛选表达单位SV40′-NEO-SV40polyA，所述表达单元中SV40’的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(3)在NEO基因翻译起始位点ATG前引入可形成发卡结构的序列，所述发夹结构核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，构建真核表达载体命名为pSNEO。

6.根据权利要求1-3任一所述的真核表达载体用于单基因或双基因的表达中的应用。

7.根据权利要求1-3任一所述的真核表达载体用于构建哺乳动物细胞高表达细胞株中的应用。