CN103525720B

CN103525720B - 高效油脂降解菌及其应用

Info

Publication number: CN103525720B
Application number: CN201310403853.5A
Authority: CN
Inventors: 焦绪栋; 秦松
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2013-09-06
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2033-09-06
Also published as: CN103525720A

Abstract

本发明属于微生物发酵生产领域，更具体的说是一种高效油脂降解菌及其应用。高效油脂降解菌为由不动杆菌UC13；其中，不动杆菌UC13已于2013年6月24日在中国微生物保存中心保藏，保藏编号为CGMCC？No:7818。所述高效油脂降解菌在含油脂的餐厨垃圾或石油烃类污染物处理中的应用；以及高效油脂降解菌在油脂有关的工业炼制中的应用。生物表面活性剂为由不动杆菌UC13经发酵所得发酵物；所述生物表面活性剂用于清除工业油脂以及含有油脂的餐厨垃圾中的污染物。本发明提供了一种操作简单，产品活性高的生物表面活性剂的提取方法。

Description

高效油脂降解菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵生产领域，更具体的说是一种高效油脂降解菌及其应用。

背景技术

对油脂类污染的废水的处理方法主要有三种：物理法、化学法、和生物法。像盐析、电解、膜分离等物理化学方法，具有投资大，占地广，需特殊设备等诸多缺点。同时这类方法不能有效的处理油脂垃圾，还存在产生二次污染的危险。与此相比，生物处理法则是利用生物主要是微生物，将油脂作为微生物生长所需的碳源和能源，对油脂进行转移和转化，在酶的催化下将其水解成甘油、脂肪酸,最后降解为H₂O、CO₂等。与物理化学方法相比，生物处理法具有成本低、占地面积少、不需要特殊设备、不会带来二次污染等优点。并且生物处理法主要依靠微生物，而微生物具有来源广、易培养、繁殖速度快、环境适应性强等优点，因此生物处理法在处理油脂垃圾方面发挥着越来越大的作用。目前,日本、欧美一些发达国家已将油脂降解菌应用到生物垃圾降解、含油废水的处理、洗涤用酶和生物柴油的生产等多项领域,而我国在这些方面的应用尚待加强。

废弃油脂的生物处理技术有UASB法、生物膜法、生物接触氧化法、BAC生物处理技术、超临界CO2分解技术等。近年来，人们又发现了各种高效降解油脂的处理方法，并且通过各种方法的联合使用来提高处理效率。通过添加能够高效降解油脂的微生物无疑是最合适的方法之一。

自然界中存在很多能降解油脂的微生物，尤其是在含油量丰富的土壤和废水中。分解油脂的微生物主要包括细菌和真菌中的需氧性种类。在已发现的降解菌当中，细菌较多，真菌菌种较少。主要有细菌中的假单孢菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、节杆菌属(Arthrobacter)、微球菌属(Micrococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、硫杆菌属(Thiobacillus)、硝化杆菌属(Nitrobacter)、葡萄球菌属(StapHylococcus)等,真菌中的假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、丝孢酵母属(Trichosporon)、地霉属(Geotrichum)、Yarrowia属、掷孢酵母属(Sporobolomyces)等。目前已有许多针对混合菌群在油脂降解方面的研究，而筛选和获取高效油脂降解能力的菌株仍是关键之一。

同时生物表面活性剂是由微生物在一定的培养条件下产生的一类集亲水基和憎水基与一体的具有表面活性的代谢产物。生物表面活性剂的研究不是从近几年开始的，早在20世纪70年代就已经开始了对生物表面活性剂的研究。现在，人们对生物表面活性剂已经不再陌生。而且，现在已经开发出许多性能优异的生物表面活性剂，生物表面活性剂所应用的工业领域也在不断扩大。生物表面活性剂主要分为两类：非离子型和阴离子型，阳离子型较为少见。依据机构特点分类，生物表面活性剂可以分为五类：糖脂、脂肽、多糖蛋白络合物、磷脂和脂肪酸或中性脂。

生物表面活性剂随着微生物的不同制取方法也是千差万别，因而难以给出普遍的理想的生产指导路线。为了获得大的产率、转化率和最终浓度，选育生物表面活性剂的高产菌株，设计高生产力的发酵工艺和经济有效的回收方法，己成为人们研究的热点。生物表面活性剂与合成的表面活性剂相比仍占有较大的劣势，首先一点是生物表面活性剂的提取分离较复杂，增加了生产成本。而生物表面活性剂在发酵液中的低浓度和两亲性常妨碍其有效分离。随着研究的不断深入,一些传统的方法不断完善,新的方法不断出现。生物表面活性剂的常用提取方法有：溶剂萃取、结晶与沉淀、泡沫层析法、超滤法、薄层色谱法(TLC)等。

发明内容

本发明目的在于一种高效油脂降解菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效油脂降解菌，高效油脂降解菌为由不动杆菌UC13；其中，不动杆菌UC13已于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No:7818，分类学命名为不动杆菌Acinetobacter sp.。

高效油脂降解菌的应用，所述高效油脂降解菌在含油脂的餐厨垃圾或石油烃类污染物处理中的应用；以及高效油脂降解菌在油脂有关的工业炼制中的应用。所述油脂为植物油、动物油或矿物油。

一种生物表面活性剂，生物表面活性剂是以花生油为唯一碳源的发酵培养基中发酵培养不动杆菌UC13所得产物。

所述以花生油为唯一碳源的发酵培养基成分为花生油10-20mg/mL，NH₄NO₃0.2-0.5g/L,K₂HPO₄0.5-1.5g/L,KH₂PO₄0.5-1.5g/L,MgSO₄.7H₂O0.1-0.5g/L。

生物表面活性剂的提取方法，以不动杆菌UC13为生产菌株，依次经过发酵培养、发酵液离心、调节上清液pH值、有机溶剂萃取、有机相干燥、减压抽滤、减压蒸馏后得到表面活性剂。

具体步骤为：

（1）发酵：按每100ml培养基中加入1-2ml UC13菌株的接种量接种在以花生油为唯一碳源的发酵培养基中；在28-30℃的恒温下以140-160r/min的转速振荡培养100-120h；

（2）离心：取发酵液在8000-10000r/min，4-8℃下离心10-15min；

（3）调pH值：离心后收集上清液，再将上清液调节pH值至2.0-3.0；

（4）萃取：将调好pH的上清液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯与上清液的体积比为1:1-1:2；

（5）干燥：在萃取后的有机相中加入6-8%的（质量体积比）Na₂SO₄干燥6-10h；

（6）过滤：去除Na₂SO₄沉淀；

（7）蒸馏：在40-45℃下减压蒸馏除去乙酸乙酯得到表面活性剂。

所述将离心所得上清液用4-6mol/L的HCl进行调节pH值至2.0-3.0。

所述以花生油为唯一碳源的发酵培养基成分为花生油10-20mg/mL，NH₄NO₃0.2-0.5g/L,K₂HPO₄0.5-1.5g/L,KH₂PO₄0.5-1.5g/L,MgSO₄.7H₂O0.1-1.5g/L。

生物表面活性剂的应用，所述生物表面活性剂用于清除工业油脂以及含有油脂的餐厨垃圾中的污染物。表面活性剂表观为浅黄色浆状物。具有较好的乳化和排油性能。

不动杆菌UC13已于2013年6月24日在中国微生物保存中心保藏，保藏编号为CGMCC No:7818。该菌对大豆油、花生油、猪油、柴油均有一定的降解能力。室温条件下（25-30℃），24h对浓度为10mg/mL的大豆油、花生油、猪油的降解率分别可达60%、64%、50%。

本发明所具有的优点：本发明生物表面活性剂是经一株油脂降解菌发酵得到活性较好的表面活性剂的产品。利用本发明的提取方法，可以简单快速的进行生物表面活性剂的提取，所得的生物表面活性剂为浅黄色浆状物，粗产品的产量为10-15g/L。并具有较好的乳化性能和排油活性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的UC13的生长及花生油降解情况图。

图2为本发明实施例提供的UC13油脂降解能力分析图。

图3为本发明实施例提供的温度对UC13油脂降解能力的影响图。

图4为本发明实施例提供的pH对UC13油脂降解能力的影响图

图5为本发明实施例提供的表面活性剂的产生及乳化性能测试效果图，其中A为超声处理后的样品；B为静置24h后样品。

图6为本发明实施例提供的排油性能测试效果图。

具体实施方式

下面围绕本发明所述的菌株所开展的具体实施方式做详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：菌株富集驯化与分离培养

采集山东烟台市一家食品加工厂油脂处理池的污泥样品5-10g，加入装有50-100mL无菌水和无菌玻璃珠的150-300mL三角瓶内,置于摇床上,150-180r/min充分振荡10-15min,取混合液5-8mL，加入35-50mL的无菌富集培养液（NaCl0.5,蛋白胨5.0,牛肉膏0.5,花生油4mL,pH7.2-7.4,用水定容至1000mL）中,28-30℃,150-250r/min培养。每24h观察油脂降解及消散情况,适量补加花生油至4ml。每4-6d转接5-10mL培养物至30-50mL新的培养基中,以促进油脂分解菌的生长。此驯化过程持续2个月。

制备油脂选择性平板，分别取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉12g，花生油10g,1.6%（质量体积比：g/ml）中性红水溶液1mL，用蒸馏水定容至1L，加入2-3%（质量体积比：g/ml）的琼脂糖。121℃高温灭菌30min。取适量上述驯化得到的菌液，经水稀释至10^-3-10^-6后涂布在上述平板上。选择具有明显油脂降解圈的菌落，经重复划线分离，得到单菌落的纯培养物，命名后保存。经16s rDNA分析，确定UC13为一株不动杆菌(Acinetobacter sp.)。

实施例2：油脂降解活性分析

将UC13菌株活化后，接种在以花生油为唯一碳源的培养基中，培养基成分为花生油10mg/mL，NH₄NO₃0.2g/L,K₂HPO₄0.5g/L,KH₂PO₄0.5g/L,MgSO₄.7H₂O0.1g/L；在恒温振荡培养箱中发酵培养，培养温度为28-30℃，转速150-250r/min；分别取培养至第0,6,12,24,30,36,42,48h的菌液。分别测定上述各菌液于600nm条件下吸光值确定细菌的生长量；同时分别取不同发酵时间的发酵液各5mL，分别用等体积的正己烷萃取两次，合并有机相。合并后的有机相用无水硫酸钠除水干燥，置于圆底烧瓶中，40-45℃减压抽滤，残余物即为降解后剩余油脂的质量。降解率=（50-剩余油脂的质量（mg））/50×100%。如图1所示。随着细菌的生长，发酵液中油脂的降解明显加强。

实施例3：UC13对不同油脂的降解能力

将UC13菌株活化后，分别接种在以花生油、大豆油、芝麻油、猪油、柴油为唯一碳源的培养基中。培养基除油脂种类不同外，同于实施例2的成分。分别将上述发酵液在恒温振荡培养箱中发酵培养，培养温度为28-30℃，转速150-250r/min；培养至第24h的菌液。测定600nm吸光值确定细菌的生长量；分别取5mL发酵液，用正己烷萃取。按照实施例2的方法计算降解率。UC13对所测的不同油脂的降解情况如图2所示。UC13对所测的油脂皆有降解能力。对于食用油的降解能力好于工业用油。食用油中，对于植物类油脂的降解能力稍好于动物类油脂。同时对于工业柴油具有一定的降解能力。

实施例4：温度对UC13降解能力的影响

将UC13菌株活化后，按照1%（v/v）的接种量接种在以花生油为唯一碳源的培养基中。培养基成分同于实施例2。将发酵液分为三份，分别置于25、30、37℃的摇床中，转速150-250r/min培养；将上述发酵液培养48h，分别取5mL发酵液，用正己烷萃取。按照实施例2的方法计算降解率。温度对UC13降解油脂的影响如图3所示。25-30℃有利于油脂的降解。

实施例5：pH对UC13降解能力的影响

将UC13菌株活化后，按照1%（v/v）的接种量接种在以花生油为唯一碳源的培养基中。培养基成分同于实施例2。将发酵液分为三份，分别调节pH为6、7、8。将发酵液置于28-30℃的摇床中，转速150-250r/min培养；将上述发酵液培养48h，分别取5mL发酵液，用正己烷萃取。按照实施例2的方法计算降解率。pH对UC13降解油脂的影响如图4所示。碱性条件有利于油脂的降解。

实施例6：表面活性剂的提取

1）将UC13菌株按照1%（体积比）接种量接种在以花生油为唯一碳源的发酵培养基中；在恒温振荡培养箱中进行发酵培养；在培养过程中，培养温度为28-30℃，培养时间为96-120h；恒温振荡箱转速为150-250r/min；培养基成分为花生油10-20mg/mL，NH₄NO₃0.2g/L,K₂HPO₄0.5g/L,KH₂PO₄0.5g/L,MgSO₄.7H₂O0.1g/L；

2）上清液离心：将上述经发酵培养的发酵液在8000-10000r/min，4-8℃下离心15-20min;

3）调节上清液的pH值：收集离心后的上清液，上清液用4-6mol/L的HCl调节pH值至2.0-3.0；

4）有机溶剂萃取：将调好pH的上清液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯与上清液的体积比为1-1.2:1；

5）有机相干燥：合并萃取后的有机相，加入5-8%的（质量体积比,g/ml）Na₂SO₄干燥1.5-2h；。

6）过滤：将干燥后的有机相过滤，得到无Na₂SO₄杂质的萃取相；

7）蒸馏：在40-45℃下减压蒸馏，除去有机溶剂得到表面活性剂。蒸馏获得的乙酸乙酯返回步骤（5）再利用。

实施例7：乳化性能分析

将UC13菌株按照1%（体积比）接种量接种在以花生油为唯一碳源的发酵培养基中；在恒温振荡培养箱中进行发酵培养；在培养过程中，培养温度为28-30℃，培养时间为48h；恒温振荡箱转速为150-250r/min；培养基成分为花生油10-20mg/mL，NH₄NO₃0.2g/L,K₂HPO₄0.5g/L,KH₂PO₄0.5g/L,MgSO₄.7H₂O0.1g/L。

15mL或50mL离心管中分别加入5mL上述UC13培养24h后的培养液，而后再分别加入5mL液体石蜡。加入石蜡后于80W超声波处理30S（参见图5A），25℃下静置24h（参见图5B），测定油相，水相和乳化相的体积，以乳化相的体积与总体积之比表示乳化能力(%)。如图1所示。该表面活性剂的乳化能力可达50%-55%。

实施例8排油活性分析

将UC13菌株按照1%（体积比）接种量接种在以花生油为唯一碳源的发酵培养基中；在恒温振荡培养箱中进行发酵培养；在培养过程中，培养温度为28-30℃，培养时间为48-96h；恒温振荡箱转速为150-250r/min；培养基成分为花生油10-20mg/mL，NH₄NO₃0.2g/L,K₂HPO₄0.5g/L,KH₂PO₄0.5g/L,MgSO₄.7H₂O0.1g/L。将上述经发酵培养的发酵液在8000-10000r/min，4-8℃下离心15-20Min，收集上清液，待用；

将直径为9.5cm的玻璃培养皿经酸浸泡、双蒸水冲洗两次后，加入30mL的双蒸水，水面上加入0.2mL花生油形成以薄层油膜，在油膜中心慢慢加入0.1mL上述上清液，中心油膜被挤向四周形成一圆圈，圆圈直径大约与表面活性剂的含量成正比。（图6）。

Claims

1.一种高效油脂降解菌，其特征在于：高效油脂降解菌为不动杆菌UC13Acinetobacter；其中，不动杆菌UC13已于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No:7818。

2.一种权利要求1所述的高效油脂降解菌的应用，其特征在于：所述高效油脂降解菌在含油脂的餐厨垃圾或石油烃类污染物处理中的应用；以及高效油脂降解菌在油脂有关的工业炼制中的应用；

所述油脂为植物油、动物油或矿物油。

3.一种生物表面活性剂，其特征在于：生物表面活性剂是以花生油为唯一碳源的发酵培养基中发酵培养权利要求1所述的不动杆菌UC13所得产物；以不动杆菌UC13为生产菌株，依次经过发酵培养、发酵液离心、调节上清液pH值、有机溶剂萃取、有机相干燥、减压抽滤、减压蒸馏后得到表面活性剂，所述以花生油为唯一碳源的发酵培养基成分为花生油10-20mg/mL，NH₄NO₃0.2-0.5g/L,K₂HPO₄0.5-1.5g/L,KH₂PO₄0.5-1.5g/L,MgSO₄.7H₂O0.1-1.5g/L。

4.一种权利要求3所述的生物表面活性剂的提取方法，其特征在于：以不动杆菌UC13为生产菌株，依次经过发酵培养、发酵液离心、调节上清液pH值、有机溶剂萃取、有机相干燥、减压抽滤、减压蒸馏后得到表面活性剂，所述以花生油为唯一碳源的发酵培养基成分为花生油10-20mg/mL，NH₄NO₃0.2-0.5g/L,K₂HPO₄0.5-1.5g/L,KH₂PO₄0.5-1.5g/L,MgSO₄.7H₂O0.1-1.5g/L。

5.按权利要求4所述的生物表面活性剂的提取方法，其特征在于：具体步骤为：

(1)发酵：将UC13菌株按照1-2％(v/v)接种量接种在以花生油为唯一碳源的发酵培养基中；在28-30℃的恒温下以140-160r/min的转速振荡培养100-120h；

(2)离心：取发酵液在8000-10000r/min，4-8℃下离心10-15min；

(3)调pH值：离心后收集上清液，再将上清液调节pH值至2.0-3.0；

(4)萃取：将调好pH的上清液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯与上清液的体积比为1:1-1:2；

(5)干燥：在萃取后的有机相中加入6-8％的(质量体积比)Na₂SO₄干燥6-10h；

(6)过滤：去除Na₂SO₄沉淀；

(7)蒸馏：在40-45℃下减压蒸馏除去乙酸乙酯得到表面活性剂。

6.按权利要求4所述的生物表面活性剂的提取方法，其特征在于：所述将离心所得上清液用4-6mol/L的HCl进行调节pH值至2.0-3.0。

7.一种权利要求3所述的生物表面活性剂的应用，其特征在于：所述生物表面活性剂用于清除工业油脂以及含有油脂的餐厨垃圾中的污染物。