新型溶菌酶制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种新型溶菌酶口服制剂的制备,其特征表现在溶菌酶二聚体海藻酸钠微球和谷芽或其汤剂或其吸附剂混合组成,二者缺一不可;该制剂明显促进溶菌酶蛋白的肠道吸收效率,作为新型饲料添加剂,可取代抗生素增强猪等哺乳类养殖动物的生产性能和非特异性免疫功能。
背景技术
溶菌酶(Lysozyme)是一种蛋白质类的生物酶,具有抗菌、抗病毒、免疫调节以及止血、消肿、加快组织修复等功能,是一种重要的非特异性免疫因子,在医药领域中有着广泛的应用。溶菌酶二聚体是溶菌酶经合成后的二聚体形式,近年发现除保留单体的所有优点(抗菌、抗病毒、无毒副作用)(WO89/11294)外,还有较强的免疫调制作用,双向功能性调节免疫***平衡,体现在细胞因子网络水平上调制TNF\IL-2\IL-6\INF等的合成,活化吞噬细胞以及相关免疫反应,特别有利于治疗和预防高水平TNF引致的疾病(WO94/01127)以及免疫缺陷或免疫抑制引致的疾病(WO96/21463)。如:治疗和预防脓毒症和败血性休克(特别是感染性创伤)、急性消化道和呼吸道疾病、流感引发的肺炎引致的急性细菌或病毒性感染、少精症、牛***炎、病毒和细菌性皮肤病和生殖器官疾病;增强***活力、促进牛***成熟和受精;明显抑制以下病毒的繁殖:牛痘,HSV-1,犬细小病毒,腮腺炎病毒,麻疹病毒,以及流感病毒等。溶菌酶二聚体治疗猪病最有效。对下列疾病几乎100%有效:产后无乳(MMA综合征),痢疾,化脓性子宫炎,流感,大肠杆菌病,特别是对猪腹泻的治愈率达到94~98%(US88/01785)。
溶菌酶二聚体对上述疾病的治疗和预防作用有一基本前提,即它是在体内以血药浓度的形式发挥生理功能。现有口服溶菌酶药物或饲料添加剂主要在胃肠道起作用,其药靶主要为直接作用于胃肠道致病菌,或者是作为体外用药,体内吸收入血的效率非常低,药理用途十分有限。体内注射可直接提高溶菌酶的血药浓度,但对于开发非治疗性的预防制剂,对于开发预防疾病性质的新型饲料添加剂没有实际应用价值。因此,研究和开发溶菌酶二聚体的口服制剂或经口服用的饲料添加剂,对于养殖动物预防疾病、提高非特异性免疫功能、保持健康活力,特别在抗生素的滥用、耐药等问题非常突出的今天,尤其具有重要的现实意义和巨大的潜在经济价值。
蛋白质是生物大分子,稳定性差,经口服用必须经受整个消化***的严酷理化环境,体内吸收效率低下,生物利用度极低。蛋白类大分子要顺利吸收入血必须克服二道天然屏障:一是胃肠道中酸、碱以及众多消化酶的分解和降解作用;二是肠道的吸收屏障,极性的蛋白质大分子通常不能完整吸收入血。针对这二道屏障已有多种技术实现蛋白质的完整吸收入血。其一是发展蛋白类大分子载体,其中海藻酸钠微球因其天然高分子多糖的特点,具有良好的生物相容性和可生物降解性,可达到蛋白类大分子良好的负载、保护、控释、以及在回结肠定位释放等目标,特别适用作蛋白质的运载***。其二是发展增强肠道对蛋白类大分子的吸收促进剂。研究中的肠道吸收促进剂包括小分子化合物和聚合物等,如中链脂肪酸钠盐、胆酸盐类、一氧化氮供体等小分子类吸收促进剂,聚合物类吸收促进剂有交联聚丙烯酸酯等,其中多数肠道吸收促进剂的作用与其细胞毒性高度相关,所以寻找无毒而有效的肠道吸收促进剂是研究人员关注的焦点。为达到蛋白类大分子完整吸收的目标以上二个环节缺一不可。
谷芽是一种食物,也是一味中药,主治消食化积,健脾开胃。我们在工作中首先发现谷芽还具有促进蛋白类大分子完整吸收的功能,因为其安全、有效、天然、价廉等特点,我们将其开发为一种有效的肠道吸收促进剂,再通过溶菌酶二聚体海藻酸钠微球的制备,二者结合形成蛋白类大分子运载***,在胃肠道中有效保护溶菌酶二聚体蛋白并成功促进其肠道吸收,大幅度提高生物利用度,切实赋予其实际应用价值,不仅可开发为猪等哺乳类养殖动物的新型饲料添加剂,也具有发展人用口服蛋白类药物的潜在应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型溶菌酶口服制剂,它由溶菌酶二聚体海藻酸钠微球和谷芽或其汤剂或其吸附剂以一定比例混合组成,能明显促进溶菌酶蛋白的肠道吸收效率,作为新型饲料添加剂,可取代抗生素增强猪等哺乳类养殖动物的生产性能和非特异性免疫功能。
本发明的目标通过下述技术方案实现,该技术方案和实施例仅是对本发明的进一步说明,并不对本发明覆盖的范围作任何限制:
谷芽或其汤剂或其吸附剂的制备:
谷芽干粉:商品炒谷芽粉碎。
谷芽汤剂:商品炒谷芽按中药常规方法煎制,1.0Kg煎制得1.0L药液汤剂。
谷芽汤剂玉米淀粉吸附剂:上述汤剂用等重玉米淀粉吸附并干燥。
谷芽烧煮干燥粉:商品炒谷芽加水(1:1)烧煮0.5hr后干燥粉碎。
(上述谷芽汤剂计量时均倒推至其干重)
溶菌酶二聚体的合成:
合成基本按AlorichChemisry公司说明书进行并纯化,纯度为30%~95%。
溶菌酶二聚体海藻酸钠微球的制备:
按常规方法如滴注法、喷雾法等制备,在氯化钙溶液中成形和固定,加温干燥。制备主要参数为:海藻酸钠浓度1%~5%(W/V),溶菌酶二聚体浓度0.1%~1.0%(W/V),氯化钙浓度3%~10%。制备所得载药微球具有良好的分散性和稳定性,粒径范围1~1000μm(水分约10%),载药量为0.5~5.0%。
小鼠动物实验:
小鼠分作六组,其中四组实验组(1~4),一组对照组(5),一组空白组(6)。
5只/组,组合饲料自由采食或灌胃(1次/天)。
鼠血清溶菌酶酶活测定:
按GBT25879进行。正常鼠血清中加入定量溶菌酶制作鼠血清溶菌酶酶活测定标准曲线(图1A)。实验鼠血清溶菌酶样品酶活测定结果(图1B)。
鼠血清溶菌酶浓度测定(ELISA):
采用常规间接竞争ELISA法定量测定。溶菌酶包被,溶菌酶梯度标准液(鼠血清溶菌酶样品)和兔抗溶菌酶抗血清竞争结合,HRP-羊抗兔IgG反应,底物显色并A490测定。
鼠血清溶菌酶浓度测定标准曲线(图2A)。鼠血清溶菌酶样品浓度测定结果(图2B)。
断奶仔猪实验:
DLY断奶仔猪(28日龄)设试验组、对照组和抗生素组。试验组日粮中添加溶菌酶二聚体饲料添加剂。自由采食,考察其对断奶仔猪生产性能和免疫机能的影响。
实验结果:
前期工作证明溶菌酶以原粉形式施喂基本检测不出血药浓度,肠道吸收极低。现小鼠动物实验结果(图A\B)表明,谷芽或其汤剂或其吸附剂与溶菌酶二聚体海藻酸钠微球混合施喂,都能大幅提高溶菌酶的血药浓度,实验证明本专利谷芽与溶菌酶二聚体海藻酸钠微球的组合对于增强溶菌酶肠道吸收、提高血药浓度是有效的。同时,吸收入血的溶菌酶仍保留酶学活性,表明溶菌酶可以完整形式吸收入血,有利于其在体内发挥生物学功能。
断奶仔猪实验表明,饲粮中添加溶菌酶二聚体制剂可提高断奶仔猪平均日增重,显著增强腹腔巨噬细胞的吞噬活性及其吞噬指数,提高血液中中性粒细胞的吞噬率,从而提高断奶仔猪免疫功能。所有实验动物体况良好,未产生任何不良反应和影响。
结论:
本专利主张的谷芽与溶菌酶二聚体海藻酸钠微球的组合对于增强溶菌酶肠道吸收、提高猪等哺乳类养殖动物的生产性能和免疫机能是有效并安全的,断奶仔猪日粮中添加本制剂可以替代抗生素。
附图说明
图1A:鼠血清溶菌酶酶活测定标准曲线。
图1B:鼠血清溶菌酶酶活(连续给药23天)。
图2A:鼠血清溶菌酶浓度测定标准曲线。
图2B:鼠血清溶菌酶浓度(连续给药23天)。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的:
实施例1、溶菌酶二聚体的合成:
实验材料为蛋清溶菌酶,交联剂DMS(Dimethylsuberimidatedihydrochloride),合成基本按AlorichChemisry公司说明书进行。20K超滤膜装置浓缩并透析,二聚体纯度平均为42%。
实施例2、溶菌酶二聚体海藻酸钠微球(Lys.D-SA-MS)的制备:
按高压喷雾法常规制备,制备主要参数为:海藻酸钠浓度2.0%(W/V),溶菌酶二聚体浓度0.1%(W/V),氯化钙浓度3%。制备所得载药微球具有良好的分散性和稳定性,粒径范围150~300μm(烘干后水分约10%),载药量为2.5%。
实施例3、谷芽干粉组(实验组1)
制作1000g常规饲料,其中加入Lys.D-SA-MS7.6g,谷芽干粉50g,二者混合比例为1:6.5,小鼠自由采食连续23天。
实施例4、谷芽烧煮干燥粉组(实验组2)
制作1000g常规饲料,其中加入Lys.D-SA-MS7.6g,谷芽烧煮干燥粉50g,二者混合比例为1:6.5,小鼠自由采食连续23天。
实施例5、谷芽汤剂玉米淀粉吸附剂组(实验组3)
制作1000g常规饲料,其中加入Lys.D-SA-MS7.6g,谷芽汤剂玉米淀粉吸附剂50g,二者混合比例为1:6.5,小鼠自由采食连续23天。
实施例6、谷芽汤剂组(实验组4)
每只小鼠每天灌胃1次,剂量Lys.D-SA-MS30mg,谷芽汤剂0.2ml(0.2g),二者混合比例为1:6.7,连续灌胃23天。
实施例7、对照组(对照组5)
制作1000g常规饲料,其中仅加入Lys.D-SA-MS7.6g,小鼠自由采食连续23天。
实施例8、空白组(空白组6)
常规饲料,小鼠自由采食连续23天。
实施例9、溶菌酶二聚体饲料添加剂对断奶仔猪生产性能和免疫机能的影响
试验组饲粮制备:
将90gLys.D-SA-MS和1.5kg谷芽烧煮干燥粉与1吨常规饲粮混合。放大则按此比例。
对照组饲粮制备:
常规饲粮。
抗生素组饲粮制备:
常规饲粮添加国家规定允许添加的抗生素品种和限量。
断奶仔猪实验:
断奶仔猪试验组、对照组和抗生素组各为36头,各组饲粮自由采食连续28天。测定断奶仔猪生产性能指标和非特异性免疫指标。