CN103509107A - 利用特征多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用特征多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法：利用Fmoc法合成“CGAGAGSGAGAGS”多肽序列，并通过多肽序列的N端的半胱氨酸使该多肽与匙孔血蓝蛋白偶联得到完全抗原；用生理盐水稀释完全抗原，将稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂混合，然后加入链霉素和青霉素溶液进行乳化处理得到初次免疫抗原乳化液，使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行初次免疫，然后对兔子加强免疫，加强免疫使用的加强免疫抗原乳化液是由稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合，然后再加入链霉素和青霉素溶液进行乳化处理得到；当兔子血样中的抗体的效价达到1/10000时，收集免疫后的兔子的血液，并使血块充分收缩及抗血清完全析出，然后收集抗血清并离心处理得到上清液。

Description

利用特征多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法
技术领域
本发明涉及多克隆抗体制备方法，尤其涉及一种制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法。
背景技术
家蚕是我国重要的经济昆虫，以产生蚕丝为目的。蚕丝主要由丝素和丝胶两种蛋白质组成，但丝胶蛋白在缫丝过程中脱落，因此，丝织品、丝绸产品等中主要的成分是丝素蛋白。一方面，目前在纺织品市场，假冒丝绸产品较多，侵犯了消费者权益，严重影响了我国丝绸长期以来的良好声誉，因此，有必要建立科学严谨的检测分析方法。另一方面，在丝绸起源研究领域，也迫切需要更科学的分析方法，因为古代埋入墓葬或遗址中的丝织品随着时间的推移，易受多种因素影响而遭到降解，外界的光照、酸、碱、微生物等环境因素，都会造成蚕丝蛋白质发生变性和大分子链的断裂，使之降解成肽段或氨基酸，因此利用传统由天然蛋白质大分子制备的抗体很难来检测这样已经遭到破坏的抗原蛋白，这样就很难来探寻丝绸的起源，且年代越早的证据越难寻觅。因此如何采用自然科学的先进手段，建立丝织品微痕检测技术体系，从印痕、残留物、土壤中提取古代丝绸的信息，对丝绸起源研究非常迫切。目前蛋白质检测的先进技术是基于抗体-抗原的Western Blotting或ELISA方法，但制备抗体常采用天然蛋白质大分子，因此，无法满足上述研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用特征多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：本发明利用特征多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法包括以下步骤：
步骤一：利用Fmoc法合成序列为“CGAGAGSGAGAGS”的多肽，并通过所述多肽的N端的半胱氨酸使该多肽与载体匙孔血蓝蛋白（KLH）偶联得到完全抗原；
步骤二：用生理盐水稀释所述完全抗原，将稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂混合，然后再加入链霉素和青霉素溶液进行乳化处理得到初次免疫抗原乳化液，使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行初次免疫，然后对兔子进行加强免疫，加强免疫使用的是加强免疫抗原乳化液；所述加强免疫抗原乳化液是由所述稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合，然后再加入链霉素和青霉素溶液进行乳化处理得到；当兔子血样中的抗体的效价达到1/10000时，收集免疫后的兔子的血液，并使血块充分收缩及抗血清完全析出，然后收集抗血清并离心处理得到上清液。
进一步地，本发明在所述步骤二中，在配制初次免疫抗原乳化液时，稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂是按体积比1:1进行混合；在配制加强免疫抗原乳化液时，稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂是按体积比1:1进行混合。
进一步地，本发明在所述步骤二中，对兔子进行所述初次免疫的方法是：使用初次免疫抗原乳化液对兔子的后大腿和皮下进行多点注射，每只注射100 ul；
对兔子进行所述加强免疫的方法是：在初次免疫后的第2、4、6周分别进行一次加强免疫，每次加强免疫是使用加强免疫抗原乳化液对兔子的后大腿和皮下进行多点注射，每只注射100 ul。
进一步地，本发明在所述步骤二中，使血块充分收缩及抗血清完全析出的方法是：将所收集的血液置室温下让其凝固，然后将凝固血液置于37℃温箱内放置30 min，再置于4℃冰箱过夜。
 与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
    （1）本发明方法通过家蚕（Bombyx mori）丝素蛋白的特征多肽制备的多克隆抗体具有很强的特异性，经ELISA法分析可知，该抗体与家蚕丝素蛋白具有明显的免疫反应，灵敏度很高，能够用于检测家蚕丝素蛋白，特别适合用于不完整丝素蛋白的检测分析。 
（2）与传统方法利用天然蛋白质的大分子制备的抗体不同，本发明制备的抗体不仅能够检测完整的丝素蛋白，也能用于检测诸如古代丝织品中已经断裂的丝素蛋白分子，从而为中国早期墓葬和遗址中的丝织品残留物提供一种敏感特异快捷的辨识方法，为丝绸考古和起源分析提供新的科学证据，在考古、文物鉴定和其他科学研究中具有重要作用。
具体实施方式
在PubMeD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）上下载家蚕（Bombyx mori ）丝素蛋白的重链(H-chain)氨基酸序列（如SEQ No.1所示）。通过统计分析，确定“GAGAGSGAGAGS”多肽片段出现频率最高，合计170处，是家蚕丝素的特征多肽，故以此片段制备抗原。
以下具体说明本发明的制备方法。
完全抗原合成：
利用Fmoc法合成半抗原（即“CGAGAGSGAGAGS”多肽序列），在“CGAGAGSGAGAGS”多肽序列的 N端添加半胱氨酸使该多肽与KLH偶联。通过交联剂的作用，“CGAGAGSGAGAGS” N端的半胱氨酸上的巯基和KLH伯胺形成共价键，从而将多肽和KLH偶联起来，得到完全抗原。
用适量的生理盐水稀释完全抗原，然后将稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂按体积比1:1混合，加入链霉素、青霉素溶液进行乳化处理，得到初次免疫时所使用的抗原乳化液（即初次免疫抗原乳化液）。此外，将以上稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂按体积比1:1混合，加入链霉素、青霉素溶液进行乳化处理，则得到加强免疫时所使用的抗原乳化液（即加强免疫抗原乳化液）。
2.抗体制备：
选取2只大白兔（14-16周龄）进行初次免疫和加强免疫。免疫前先抽取兔耳血样做对照。初次免疫是用初次免疫抗原乳化液对兔的后大腿和皮下进行多点注射，每只注射100 ul。初次免疫后的第2周、4周、6周各加强免疫一次，每次加强免疫是用加强免疫抗原乳化液对兔的后大腿和皮下进行多点注射，每只注射100 ul。分别在第三次、四次免疫后的第10天静脉取血检测抗血清效价。
当兔子血样中的抗血清的效价达到1/10000时，杀死兔子收集血液，收集的大量血液置室温下让其凝固；将凝固血液置于37℃温箱内放置30 min，再置于4℃冰箱过夜，使血块充分收缩及抗血清完全析出。收集抗血清，4℃ 3000 g离心10 min，分装上清液，放-70℃储存备用。
抗体纯化：
利用免疫亲和层析技术对抗血清进行纯化。先将合成的半抗原（即多肽“CGAGAGSGAGAGS”）和层析填料Sulfo-link-gel进行交联，使“CGAGAGSGAGAGS” N端的半胱氨酸封闭。用20ml、50mM、pH7.4的PBS对柱进行预处理，预处理的流速为60ml/h。用50mM、pH7.4的PBS将10ml的抗血清稀释至20ml，稀释后上样。重复上样一次。用20ml、50mM、pH7.4的PBS对柱进行清洗，清洗的流速为60ml/h。用pH3.0、0.1M 的glycine-HCL对抗体进行洗脱。洗脱完成后用含50mM、pH7.4、含0.02%硫柳汞钠的PBS洗涤多肽柱，得到纯化后的抗体并于4℃储存。
抗体特异性效果测定：抗原丝素蛋白以1ug/ml的浓度包被，4℃包被过夜。将抗体分别稀释20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍， 50ul/孔的量上样，37℃下温育1h。用TBST以200ul/孔洗涤2遍。酶标二抗以1:5000稀释使用，50ul/孔、37℃下温育1h。用TBST以200ul/孔洗涤3遍。以100 ul/孔加入TMB于阴暗处显色，显色10min后，以100ul/孔加入2M的H2SO4终止。用酶标仪测定OD450值。根据OD450值，对抗原抗体的结合等情况进行判断。当OD450值达到阳性标准时就可以确定样品中含有丝素；若样品中不含丝素，则OD450值就会低于阳性标准，据此就可以快速判断丝素的存在。
结果分析：结果显示除空白对照呈无色外，样品孔均呈现黄色。用酶标仪测定OD450值结果为：对纯化后的抗体进行20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍稀释后得到的OD450值分别为2.006、1.840、2.149、2.339、2.445，空白对照的OD450值为0.054。按照平台OD450值达到0.6为阳性的要求，即使将制备的抗体稀释20000倍，仍能够检测到丝素蛋白的阳性信号，显色清晰，结果明确。从以上结果可以说明，由本发明方法制备的抗体对丝素的反应灵敏度极高，所需的抗原量极少，且操作简便，投入小，宜大规模推广利用。
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Claims (5)

1. 一种利用特征多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤一：利用Fmoc法合成序列为 “CGAGAGSGAGAGS”的多肽，并通过所述多肽的N端的半胱氨酸使该多肽与匙孔血蓝蛋白偶联得到完全抗原；
步骤二：用生理盐水稀释所述完全抗原，将稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂混合，然后再加入链霉素和青霉素溶液进行乳化处理得到初次免疫抗原乳化液，使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行初次免疫，然后对兔子进行加强免疫，加强免疫使用的是加强免疫抗原乳化液；所述加强免疫抗原乳化液是由所述稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合，然后再加入链霉素和青霉素溶液进行乳化处理得到；当兔子血样中的抗体的效价达到1/10000时，收集免疫后的兔子的血液，并使血块充分收缩及抗血清完全析出，然后收集抗血清并离心处理得到上清液。
2. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：在所述步骤二中，在配制初次免疫抗原乳化液时，稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂是按体积比1:1进行混合；在配制加强免疫抗原乳化液时，稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂是按体积比1:1进行混合。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：在所述步骤二中，对兔子进行初次免疫的方法是：使用初次免疫抗原乳化液对兔子的后大腿和皮下进行多点注射，每只注射100 ul；
对兔子进行加强免疫的方法是：在初次免疫后的第2、4、6周分别进行一次加强免疫，每次加强免疫是使用加强免疫抗原乳化液对兔子的后大腿和皮下进行多点注射，每只注射100 ul。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：在所述步骤二中，使血块充分收缩及抗血清完全析出的方法是：将所收集的血液置室温下让其凝固，然后将凝固血液置于37℃温箱内放置30 min，再置于4℃冰箱过夜。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征是：在所述步骤二中，使血块充分收缩及抗血清完全析出的方法是：将所收集的血液置室温下让其凝固，然后将凝固血液置于37℃温箱内放置30 min，再置于4℃冰箱过夜。
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