CN103509083B - 一种广谱β-内酰胺酶荧光底物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种广谱β-内酰胺酶荧光底物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可供检测个体中细菌耐药性的荧光检测方法中所用的广谱β内酰胺酶荧光底物，其结构如下所示：

Description

一种广谱β-内酰胺酶荧光底物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物合成领域，具体地说是涉及一种可用于检测广谱β内酰胺抗生素治疗的细菌耐药性的荧光底物及其制备方法和应用。
背景技术
自从人类在上世纪20年代首次发现以青霉素为代表的β-内酰胺类抗生素以来，它们已经成为治疗细菌感染的一线药物，挽救了无数人的生命。同其它类别的抗生素相比，β-内酰胺类抗生素具有疗效高，毒性低的特性。但是，细菌也在不断的进化各种抗药机制。目前，抗药性细菌感染已经成为全球性的问题。特别是在中国，印度，已经其他一些国家，由于存在着滥用抗生素的现象，出现超级抗药性细菌，从而导致无药可治的可能性是不容忽视的。
细菌对抗β-内酰胺类抗生素的最主要机制是通过β-内酰胺酶实现的。它们可以有效的分解β-内酰胺类抗生素。为抵消这些酶的作用，在临床上可以采取了两种方法。第一，共同使用β-内酰胺类药物和β-内酰胺酶抑制剂。一些处方药利用这一策略，包括(氨苄青霉素+舒巴克坦)和(阿莫西林+克拉维酸钾)。第二是开发不被普通β-内酰胺酶降解的药物，比如许多第三和***的广谱头孢菌素。然而，抗生素的发展和抗药性细菌的出现是一个矛和盾的关系。目前，许多在临床上检测到的细菌已经具有了分解第三和***的头孢菌素的能力。这主要是由广谱β-内酰胺酶所造成的。
由于细菌耐药性的发展与误用/滥用抗生素是紧密相关的，为延长广谱抗生素的有效使用期，在临床上治疗细菌感染应该尽可能的做到对症下药，避免使用无必要的广谱抗生素。为了实现这一目标，快速，灵敏，和准确诊断细菌菌株对各种β-内酰胺类药物的药敏程度是必须的步骤。
在西方发达国家，抗生素的使用受到严格控制。但在中国，印度，以及发展中国家，抗生素被大大滥用和误用，其后果是抗药性细菌的不断出现。2009年在印度出现的新德里金属β-内酰胺酶，NDM-1，是一个典型的例子。这个蛋白质酶可以水解目前所有的β-内酰胺类抗生素。换句话说，含有NDM-1的细菌可以抵御任何β-内酰胺类抗生素。同时，由于全球的交通便利，在一地得到的抗药性细菌可以很容易的传播到世界各地，从而造成大规模的微生物感染。
为尽可能的延缓抗药性细菌的出现和延长现有抗生素的使用寿命，防止抗生素的滥用和误用是一个有力的手段。这要求在临床治疗细菌感染过程中，能够尽快确定细菌对不同抗生素的抗药和敏感程度，以防止过分使用，或者无效使用抗生素。另外，在治疗败血症病人时，由于及早使用正确的抗生素和病人的生存率直接挂钩，这也需要尽快确定细菌对不同抗生素的抗药和敏感程度。
β-内酰胺类抗生素被广泛应用在临床和畜牧业中用来治疗细菌感染。特别是第三四代头孢菌素是一线抗生素药物。但是，广谱β-内酰胺酶的出现使得三四代头孢菌素不再是治疗细菌感染的万能妙药。在临床上迫切需要一种快速的能够确定细菌是否对三四代头孢菌素具有抗药性的分析方法。利用β-内酰胺酶的荧光底物来检测β-内酰胺酶的存在是一个普遍的分析方法。事实上，目前许多现有的荧光β-内酰胺酶的底物可以做到高灵敏度和实时的对β-内酰胺酶进行检测。然而，所以这些分子都不具有选择性，即不可能区分普通和广谱β-内酰胺酶。
由于含有普通β-内酰胺酶的细菌对第三四代广谱头孢菌素敏感，而含有广谱β-内酰胺酶的细菌对第三四代广谱头孢菌素具有抗药性。我们希望能够有一种快捷的方法来区分这两类细菌，从而可以尽快确定临床细菌感染是否可以用第三四代广谱头孢菌素来治疗。
目前，国内外用来检测细菌抗药性的方法可以分成3大类。
第一类是基于传统的微生物培养技术，又可以分为液体培养基和固态培养基的方法。液体培养基方法可以准确测定一种抗生素的最低抑菌浓度。但是，当待测抗生素品种较多时，此方法工作量大，所以已经逐渐被固态培养基方法所取代。固态培养基方法又可以分为若干类，主要有纸片扩散法，E-test，等等。比如，在纸片扩散中，不同的抗生素药片被放置在固态培养基表面。当细菌在培养基表面生长时，如果对某种抗生素敏感，这在此药片周围形成一个清晰的环状无菌带。其大小受细菌对抗生素的敏感程度所决定。如果细菌对此抗生素有抗药性，这不会形成此无菌带。这类基于微生物培养技术的方法目前是细菌抗药性检测的主流方法。但是，由于细菌生长需要时间，此类方法至少需要48-72小时。对于生长缓慢的细菌，比如结核分支杆菌，需要的时间更长，因此对于需要尽快知道细菌抗药性的情况，例如败血症病人的治疗，这类方法无法及时提供选择抗生素的必要信息。
第二类方法是基于聚合酶链反应的基因方法。病人样品可以用针对β-内酰胺酶基因的特定探针进行基因扩增，然后来检测得到抗药性的基因变异。此类方法快速，灵敏。但是，由于此类方法不是功能性测定，所以只能用来检测已知的耐药机制，而不能确定以往未知的全新抗药机理。
第三类方法是直接测定β-内酰胺酶的降解β-内酰胺类抗生素的功能。目前有多种β-内酰胺酶的荧光底物可以选择。这类底物本身没有荧光，但是，当它们被β-内酰胺酶分解后，会有荧光产品出现。通过观测荧光强度变化，可以确定β-内酰胺酶的存在。但是，现有β-内酰胺酶底物无法区分普通和广谱β-内酰胺酶。所以并不能够起到指导抗生素选择的作用。
概括而言，虽然目前的相关技术在它们的适用领域中有无可取代的位置，但在特定的应用中，特别是在处理治疗败血症病人的过程中，它们也有着种种局限。所以，一种可以快速区分普通和广谱β-内酰胺酶的检验方法是迫切需要的。在国内外尚无同类产品。类似产品有日本KantoChemical公司生产的Cica-β-test试剂。Cica-β-test试剂也可以用来检测细菌是否对三四代头孢菌素具有抗药性。但是，由于Cica-β-test试剂检测依赖于颜色变化(阳性样品的颜色从黄色变到红色)，灵敏度至少要比本产品的荧光检测法低一个数量级。另外一个类似产品是美国LifeTechnologies公司生产的GeneBLAze试剂。GeneBLAze试剂也是基于荧光检测，但是，此试剂只能用来无差别的检测所有的β-内酰胺酶的存在，而不能特异性的检测能够降解三四代头孢菌的广谱β-内酰胺酶。此外，GeneBLAze试剂只是一个研究用产品，用来进行一些真核细胞的光学显像实验，而不是在临床上用于检测细菌抗药性。
发明内容
早期的青霉素以及一二代的头孢菌素能够被普通β-内酰胺酶所分解，所以含有普通β-内酰胺酶的细菌对它们具有抗药性。但是，在只有普通β-内酰胺酶存在的情况下，第三和***头孢菌素是稳定的。这主要是因为第三和***头孢菌素的β-内酰胺环上有一个特殊的取代基，对普通β-内酰胺酶有巨大的位阻作用，所以普通β-内酰胺酶不能有效的分解三四代头孢菌素。换句话说，只含有普通β-内酰胺酶的细菌对三四代头孢菌素敏感。然而，广谱β-内酰胺酶，包括金属β-内酰胺酶以及由普通β-内酰胺酶突变而来的超广谱β内酰胺酶，不受此取代基的影响，因而可以有效的降解三四代头孢菌素。
以往的β-内酰胺酶的荧光底物不具有在三四代头孢菌素上的特殊取代基，所以它们可以同时被普通和广谱β-内酰胺酶所分解。因此它们可以检测所有的β-内酰胺酶，但是无法区分这两类的β-内酰胺酶。
解决上述技术问题可通过设计并合成一种全新的β-内酰胺酶的荧光底物，此底物的化学结构包含了在三四代头孢菌素上的特殊取代基。所以，它对普通β-内酰胺酶稳定，但是可以被广谱β-内酰胺酶所降解，从而得到可以观察到的荧光信号变化。因此，在临床上使用时，可以特定检测到含有广谱β-内酰胺酶的抗药性细菌。
根据此想法和思路，发明人通过反复的实验研究与分析和理论探索，已成功得到预期的研究结果和应用产品细菌耐药性荧光检测试剂盒。
本发明的目的之一是提供一种新的广谱β-内酰胺酶荧光底物，其具体结构式如下所示的化合物或所述化合物的对映体、消旋体或非对映异构体:
本发明的目的之二是提供上述β-内酰胺酶荧光底物的制备方法，包括如下具体步骤A～E、B～E、C～E或D～E，具体化学反应式如下所示：
作为一种优选方案，其中：
步骤A操作为：以头孢噻肟为原料在酸性条件下溶解，加入二苯基重氮甲烷，调节pH值到9后，萃取提取；洗涤有机层，干燥，除去溶剂；经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物1；
步骤B操作为：将2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基咪唑六氟磷酸盐、1-羟基-苯并***、二异丙基乙胺、加入化合物1和三苯甲基甘氨酸混合溶解，搅拌，反应完成后，将反应液提取，洗涤有机层浓缩后，经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物2；
步骤C操作为：三异丙基硅烷和三氟乙酸加入到含有化合物2的二氯甲烷溶液中，搅拌，除去溶剂后洗涤，然后溶解在乙腈和磷酸钠缓冲液中，加入从新鲜桔皮中提取的乙酰酯酶后，混合物搅拌，除去乙酰酯酶，滤液浓缩，缓慢加入Ph2CN2和乙腈，搅拌，调整pH值至8.9，，加入三苯甲基甘氨酸的羟基琥珀酼亚胺脂，有机层用乙酸乙酯提取两次，并用高效液相色谱法来监测反应进程，反应完成后，混合物浓缩除去溶剂后重新溶解于乙酸乙酯中，继续加入4-硝基苯基氯和吡啶，搅拌，反应结束后，经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物3；
步骤D操作为：化合物4溶解于含有二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺中，然后加入化合物3，混合物在-20°C下搅拌用胶柱纯化分离洗脱，得到化合物5；
步骤E操作为：三异丙基硅烷和三氟乙酸加入到含化合物4的正己烷中，搅拌，除去溶剂，用二氯甲烷洗涤3次后重新溶解在二甲基亚砜中，然后加入化合物6和二异丙基乙胺，搅拌，反应结束后，通过制备高效液相色谱纯化，用岛津高效液相色谱法在540nm波长检测，收集组分得到化合物7，即所述的β-内酰胺酶荧光底物。
优选地，所述步骤A具体反应为：以头孢噻肟为原料加入1毫摩尔的甲苯磺酸溶解在乙腈和水溶液中，加入二苯基重氮甲烷，在-20°C下混合搅拌直到特征的紫色消失；在混合物中加入氢氧化钠溶液调节pH值到9后，用乙酸乙酯萃取提取；有机层先后用水和饱和盐水洗涤，干燥，在用旋转蒸发仪除去溶剂；富集物用30％正己烷-乙酸乙酯在50克的硅胶柱上进行分离纯化，收集组分用旋转蒸发除去溶剂后得到化合物1。
优选地，所述步骤B具体反应为：在乙腈溶液中添加2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基咪唑六氟磷酸盐，1-羟基-苯并***和二异丙基乙胺，化合物1和三苯甲基甘氨酸，混合物在-20°C下搅拌，然后自然升温到0°C，并继续反应，反应完成后，将反应液倒入2MHCl中，用100毫升的二氯甲烷提取，有机层用水洗两次，干燥，然后旋转蒸发浓缩得到淡黄色固体，所述淡黄色固体经硅胶柱以15％乙酸乙酯-正己烷洗脱纯化，收集组分用旋转蒸发除去溶剂后得到化合物2。
优选地，所述步骤C具体反应为：三异丙基硅烷和三氟乙酸在-20°C分别加入到含有化合物2的二氯甲烷溶液中，混合物在-20°C下搅拌，除去溶剂后溶解在乙腈和磷酸钠缓冲液(pH值=6.5)中，继续加入从新鲜桔皮中提取的乙酰酯酶后，混合物搅拌过夜，加入丙酮沉淀乙酰酯酶，得到的黄色滤液浓缩，加入Ph2CN2和乙腈，搅拌2小时后，加入三苯甲基甘氨酸的羟基琥珀酼亚胺脂，溶液调整pH值至8.9，用乙酸乙酯提取两次有机层，浓缩除去溶剂；黄色油状产物被重新溶解于二氯甲烷中，继续加入4-硝基苯基氯和吡啶，混合物在-20°C下搅拌，反应结束后，将产物加载到硅胶柱上用30％乙酸乙酯—正己烷洗脱纯化，收集组分旋转蒸发后即得白色固体化合物3。
优选地，所述步骤D具体反应为：化合物4溶解在含有二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺中，然后加入化合物3，混合物在-20°C下搅拌用胶柱纯化，并用30％乙酸乙酯—正己烷洗脱，得到粉红色的固体产品化合物5。
优选地，所述步骤E具体反应为：三异丙基硅烷和三氟乙酸加入到含化合物4的正己烷中，搅拌，除去溶剂，用二氯甲烷洗涤3次后重新溶解在二甲基亚砜中，然后加入化合物6和二异丙基乙胺，在-20°C下搅拌，反应结束后，通过制备高效液相色谱纯化，用岛津高效液相色谱法在540nm波长检测，收集组分冷冻干燥后得到暗红色的蓬松固体化合物7，即所述的β-内酰胺酶荧光底物。
本发明的目的之三是提供了上述β-内酰胺酶荧光底物的应用，是用于制备检测个体耐药性的诊断检测试剂或诊断检测试剂盒。
作为进一步优选方案，所述的诊断检测试剂或诊断检测试剂盒用于检测β-内酰胺类抗生素的个体耐药性。
相比现有技术，本发明具有如下的技术特长：
本发明为医药等行业提供了一种新的β-内酰胺酶荧光底物及其制备方法，从而拓展了临床抗生素用药新指导的应用。
本发明提供的荧光底物制备工艺简便、步骤少、副产物少，实验结果表明，本发明提供的荧光底物C-2可准确的定性检测出不同样品中的抗头孢菌素的细菌，可用于临床或其他检测领域制备相应的诊断试剂或诊断试剂盒，具有广泛的应用空间和实用价值。
与现有的细菌耐药性诊断产品相比，本发明提供β-内酰胺酶荧光底物在实际应用等方面，具有以下显著特点：
1)检测具有广谱β-内酰胺酶的感染细菌，区别与以往仅检测普通β-内酰胺酶的感染细菌，临床上用于三、四代头孢菌素耐药性检验，提高治疗成功率；不受细菌类别的限制。革氏阳性和阴性细菌均可以被检测，如：阴沟肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌等。
2)可以直接检验血液中的抗药性细菌的存在，所以可以直接用于检测败血症病人的血样。
3)重感染细菌症的早期诊断，如败血症感染细菌的早期检测，便于临床及早治疗；
4)重感染细菌症的快速诊断，最大可能争取治疗时间，挽救病人生命；
5)判断重感染细菌广谱β-内酰胺酶的亚属，帮助医生制订有效的治疗方案；
6)能检测各种广谱β-内酰胺酶(即ESBLs)，而常规PCR仅仅能够检测一个基因是否存在，而不能确定基因的序列，所以常规PCR不能用于临床诊断ESBLs；
7)目前的DNA芯片仅可以用于诊断已知的ESBLs，但是不能诊断新出现的广谱β-内酰胺酶变异，本发明提供的诊断试剂盒不仅能检测目前已知的“超级细菌”如：鲍氏不动杆菌(ABA)、铜绿假单胞菌(PA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌(CRPK)、大肠埃希菌(CRE)，还可以检测目前未知的和未来可能出现的新型“超级细菌”。
因此，本发明所述方法的成功开发对于临床抗生素用药有着重要的意义。在临床上，医生会根据病人的症状，凭经验直接跳过普通β-内酰胺抗药性的检测，因为能被普通青霉素治愈的病症往往很轻。再加上三、四代头孢菌素已经是目前市场的主流，所以这也直接导致现有的CICA-β药性检验临床意义不大的原因。CEP-R和碳青霉烯系列抗药性检测试剂的发明完美构成了临床指导图，使得合理指导抗生素用药变得切实可行。所以，我们的发明在合理指导抗生素用药上具有里程碑的作用。
总之，本发明积极适应了现代生物、预防保健、临床诊断等领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明为研究开发该细菌耐药性荧光检测试剂盒，对改进和提高现有的该细菌耐药性荧光检测试剂盒具有重要价值。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。
本发明研究了现有的荧光检测技术，提供了一种新的细菌耐药性荧光检测试剂盒，便于现代生物、预防保健、临床诊断等领域的安全使用。
本发明最终需要制备成细菌耐药性荧光检测试剂盒进行应用，下面将列举实施例进行进一步说明。如有问题，可以与发明人直接联系。上述提供的一些实验数据以及下列实施例中按前述发明内容给出几种细菌耐药性荧光检测试剂盒及其使用方法及一些试验研究内容，但应该理解本发明并不仅限于此处所列出的研究内容，还应该理解此处所使用的术语仅用于描述特定的实施例，而并不是对本发明的限定。
也就是说，在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实施例均是为了更好地阐述本发明，特别是这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，不能解释为了对本申请的限制或者用来限制本发明的保护范围。
为了更清楚地说明本发明，下面结合如下实施例对本发明作详细描述。
实施例1
合成路线
步骤A：
以头孢噻肟为原料(cefotaxime,455.5毫克，1.00毫摩尔)和甲苯磺酸(172.2毫克，1.00毫摩尔)溶解在5毫升乙腈和8毫升的水溶液中；继续加入Diphenyldiazomethane(199.2毫克，1.00毫摩尔，1当量)；在-20°C下混合搅拌4到5分钟，直到特征的紫色消失；在混合物中加入氢氧化钠溶液调节pH值到9后，用乙酸乙酯(50毫升)提取；有机层先后用水(15毫升)洗涤两次，然后用无水氯化钙干燥；用旋转蒸发仪除去溶剂。富集物用30％正己烷-乙酸乙酯在50克的硅胶柱上进行分离纯化；收集组分用旋转蒸发除去溶剂后得到白色固体500毫克化合物1(得率80％)。
核磁共振氢谱(氘代氯仿,600MHz)δ7.81(s,1H),7.50-7.29(m,10H),6.99(s,1H),6.83(s,1H),6.11(s,1H),5.45(s,2H),5.12(s,1H),5.07(d,J=12.6Hz,1H),4.83(d,J=12.6Hz,1H),4.09(s,3H),3.59(d,J=18.6Hz,1H),3.45(d,J=18.6Hz,1H),2.05(s,3H)ppm;质谱(ESI)计算分子量:C29H27N5O7S2ExactMass:621.14,测量分子量622.3[M+1]+。
步骤B：
在乙腈溶液中(80毫升)添加2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基咪唑六氟磷酸盐(HBTU，834毫克，2.2毫摩尔)，1-羟基-苯并***(HOBT，298毫克，2.2毫摩尔)和二异丙基乙胺(DIPEA，284.5毫克，383UL，2.2毫摩尔)，化合物1(680毫克，1.1毫摩尔)和三苯甲基甘氨酸(347毫克，1.1毫摩尔)。得到的混合物在-20°C下搅拌4小时，然后自然升温到0°C，并继续反应12小时，氮气保护；反应完成后将反应液倒入250毫升2MHCl中。用100毫升的二氯甲烷提取；有机层用水(50毫升)洗涤两次，加入无水氯化钙干燥，然后旋转蒸发浓缩得到淡黄色固体；该产品加载到50克的硅胶柱上并用30％乙酸乙酯—正己烷洗脱纯化。收集组分用旋转蒸发除去溶剂后得到658毫克的白色固体化合物2(得率65％)。
核磁共振氢谱(氘代氯仿,600MHz)9.02(s,1H),7.46(s,1H),7.45–7.15(m,25H),6.99(s,1H),6.90(s,1H),6.25(s,1H),5.40(s,2H),5.20(s,1H),5.08(d,J=12.6Hz,1H),4.85(d,J=12.6Hz,1H),4.12(s,3H),3.55(d,J=18.6Hz,1H),3.48(d,J=18.6Hz,1H),2.04(s,3H)ppm;质谱(ESI)计算分子量:C50H44N6O8S2ExactMass:920.27,测量分子量921.0[M+1]+。
步骤C：
三异丙基硅烷(800μL)和三氟乙酸(400μL)在-20°C分别加入到含有化合物2(150毫克，0.16毫摩尔)的二氯甲烷溶液(8毫升)中；由此得到的混合物在-20°C下搅拌4小时；除去溶剂后得到的白色产品,然后溶解在乙腈(15毫升)和150毫升磷酸钠缓冲液(pH值=6.5)中。继续加入从新鲜桔皮中提取的乙酰酯酶(1毫克)后，混合物搅拌，并加入丙酮(40毫升)用来沉淀乙酰酯酶。得到的黄色滤液浓缩至40毫升左右，加入Ph2CN2(199.2毫克，1.0毫摩尔)。搅拌2小时后，黄色溶液用氢氧化钠溶液(15摩尔/升)调整pH值至8.9；加入三苯甲基甘氨酸的羟基琥珀酼亚胺脂(82.8毫克，0.2毫摩尔)，用乙酸乙酯提取(15毫升)两次，获得大约15毫升的有机层。混合物用浓缩除去溶剂；黄色油状产物被重新溶解于15毫升的乙酸乙酯中；继续加入4-硝基苯基氯(150毫克)和吡啶(220微升)；混合物在-20°C下搅拌4小时；产物加载到20克的硅胶柱上用30％乙酸乙酯正己烷洗脱纯化；收集组分旋转蒸发后得到白色固体化合物3(108毫克，61％)。
核磁共振氢谱(氘代氯仿,600MHz)8.26(d,J=8.4Hz,2H),7.88(s,1H),7.77-7.15(m,28H),6.96(s,1H),6.61(s,1H),5.82(m,2H),5.35(d,J=3.6Hz,1H),5.27(s,1H),4.84(d,J=12.6Hz,1H),4.74(d,J=12.6Hz,1H),4.26-4.18(m,4H),3.17(s,2H)ppm;质谱(MALDI-TOF)计算分子量:C57H48N8O12S2ExactMass:1100.28,测量分子量1101.3[M+1]+,1123.3[M+Na]+。
步骤D：
化合物4(14.8毫克，0.05毫摩尔)溶解在含有二异丙基乙胺(80μL)的2毫升二甲基甲酰胺中，然后加入化合物3(55.0毫克，0.05毫摩尔)。由此得到的混合物在-20°C下搅拌6小时后用胶柱纯化，并用30％乙酸乙酯—正己烷洗脱，得到粉红色的固体产品化合物5(41.2毫克，50％)。核磁共振氢谱(氘代氯仿,600MHz)δ8.30–6.90(m,32H),6.53(s,1H),5.40(d,J＝3.6Hz,1H),5.12(d,J=3.6Hz,1H),4.75(s,2H),4.09(s,2H),3.93(s,3H),3.50(d,J=12.1Hz,2H),3.39(d,J＝12.1Hz,2H),3.32(s,2H),3.09(s,3H)ppm；质谱(MALDI-TOF)计算分子量:C68H60N10O11S21256.38，测量分子量1257.4[M+1]+,1279.2[M+Na]+。
步骤E：
三异丙基硅烷(20微升)和三氟乙酸(10微升)加入到含有5毫克化合物4的正己烷中(200微升)。搅拌20分钟后用旋转蒸发仪出去溶剂，得到暗红色固体。用二氯甲烷(3毫升)洗涤3次后重新溶解在二甲基亚砜(DMSO,200微升)中，然后加入化合物6(3毫克)和二异丙基乙胺(7.0微升)。所得到的混合物在-20°C下搅拌6小时。该产品通过制备高效液相色谱纯化，用岛津高效液相色谱法在540nm波长检测。收集组分冷冻干燥后得到暗红色的蓬松固体化合物7(3.9毫克)，即荧光底物C-2。核磁共振氢谱(氘代氯仿,600MHz)δ8.30–7.50(m,9H),7.05–6.10(m,8H),5.40(d,J＝3.1Hz,1H),5.12(d,J=3.1Hz,1H),4.75(s,2H),4.10-4.00(m,8H),3.93(s,3H),3.64(t,4H),3.60(t,4H),3.50(d,J=12.1Hz,2H),3.42-3.35(m,6H),3.16(s,2H),3.09(s,3H),2.50(m,4H),1.41(t,6H),1.15(t,6H)ppm；质谱(MALDI-TOF)计算分子量C72H77N14O15S2 +1441.51，测量分子量1441.74M+。
步骤F：
将上述步骤得到的产物通过C18-HPLC纯化，所用梯度：0.1%TFA的纯水（洗脱剂A），0.1%TFA的乙腈（洗脱剂B），在40分钟内从10%的洗脱剂B到90%的洗脱剂B，在440nm波长检测；20分钟后收集C18柱洗脱液并冷冻干燥得到暗红色固体，即得到纯化后的荧光底物C-2。
荧光底物活性检测：
将经纯化后的荧光底物C-2与等体积的非变性细胞缓冲液溶解0.2ml的双蒸馏水中，其中荧光底物的溶液的组成成分是：50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液，pH值7.5，1微摩尔/升的荧光β-内酰胺酶底物。然后将生物样品（细菌培养液，血清，等等）和相同体积的非变性细胞裂解缓冲液充分混合，放置5分钟后取出0.1毫升，然后和0.1毫升的底物溶液混合。剩余的0.1毫升的底物溶液和0.1毫升的非变性细胞裂解缓冲液混合作为空白对照。采用单波长检测。
入射光535nm,荧光信号590nm.比较I590(样品)/I590(空白)>2倍，可以断定。
根据上述实验方法，检测如表1所示的各样品，并记录结果：
表1荧光底物C-2的个体抗药性检测
实验结果表明，本发明提供的荧光底物C-2可准确的定性检测出不同样品中的抗头孢菌素的细菌，可用于临床或其他检测领域制备相应的诊断试剂或诊断试剂盒，具有广泛的应用空间和实用价值。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种广谱β-内酰胺酶荧光底物，其特征在于：所述广谱β-内酰胺酶荧光底物为具体结构式如下所示的化合物或所述化合物的对映体、消旋体或非对映异构体:
2.一种制备权利要求1所述广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，包括如下具体步骤A～E、B～E、C～E或D～E，具体化学反应式如下所示：
3.根据权利要求2所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于：步骤A操作为：以头孢噻肟钠为原料在酸性条件下溶解，加入二苯基重氮甲烷，调节pH值到9后，萃取提取；洗涤有机层，干燥，除去溶剂；经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物1；
步骤B操作为：将2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基咪唑六氟磷酸盐、1-羟基-苯并***、二异丙基乙胺、加入化合物1和三苯甲基甘氨酸混合溶解，搅拌，反应完成后，将反应液提取，洗涤有机层浓缩后，经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物2；
步骤C操作为：三异丙基硅烷和三氟乙酸加入到含有化合物2的二氯甲烷溶液中，搅拌，除去溶剂后洗涤，然后溶解在乙腈和磷酸钠缓冲液中，加入从新鲜桔皮中提取的乙酰酯酶后，混合物搅拌，除去乙酰酯酶，滤液浓缩，调pH值至3.5，缓慢加入Ph2CN2和乙腈，搅拌，调整pH值至8.9，用乙酸乙酯提取两次，有机层加入三苯甲基甘氨酸的羟基琥珀酼亚胺脂，并用高效液相色谱法来监测反应进程，反应完成后，混合物用盐水洗涤三次后，浓缩除去溶剂后重新溶解于二氯甲烷中，继续加入4-硝基苯基氯和吡啶，搅拌，反应结束后，经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物3；
步骤D操作为：化合物4溶解于含有二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺中，然后加入化合物3，混合物在0℃下搅拌用胶柱纯化分离洗脱，得到化合物5；
步骤E操作为：三异丙基硅烷和三氟乙酸加入到含化合物4的正己烷中，搅拌，除去溶剂，用二氯甲烷洗涤3次后重新溶解在二甲基亚砜中，然后加入化合物6和二异丙基乙胺，搅拌，反应结束后，通过制备高效液相色谱纯化，用岛津高效液相色谱法在540nm波长检测，收集组分得到化合物7，即所述的β-内酰胺酶荧光底物。
4.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤A具体反应为：以头孢噻肟钠为原料加入1毫摩尔的盐酸和甲苯磺酸溶解在乙腈和水溶液中，加入二苯基重氮甲烷，在0℃下混合搅拌直到特征的紫色消失；在混合物中加入氢氧化钠溶液调节pH值到9后，用乙酸乙酯萃取提取；有机层先后用水和饱和盐水洗涤，干燥，再用旋转蒸发仪除去溶剂；富集物用30％正己烷-乙酸乙酯在50克的硅胶柱上进行分离纯化，收集组分干燥。
5.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤B具体反应为：在乙腈溶液中添加2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基咪唑六氟磷酸盐，1-羟基-苯并***和二异丙基乙胺，然后在-20℃下加入化合物1和三苯甲基甘氨酸，混合物在-20℃下搅拌，然后自然升温到0℃，并继续反应，反应完成后，将反应液倒入含冰水和2MHCl的混合液中，用100毫升的二氯甲烷提取，有机层用饱和盐水洗两次，干燥，然后旋转蒸发浓缩得到淡黄色固体，所述淡黄色固体经硅胶柱以15％乙酸乙酯-正己烷洗脱纯化，收集组分，干燥。
6.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤C具体反应为：三异丙基硅烷和三氟乙酸在-20℃分别加入到含有化合物2的二氯甲烷溶液中，混合物在0℃下搅拌，除去溶剂后以干燥***洗涤三次，然后溶解在pH值＝6.5的乙腈和磷酸钠缓冲液中，继续加入从新鲜桔皮中提取的乙酰酯酶后，混合物搅拌过夜，加入丙酮沉淀乙酰酯酶，得到的黄色滤液浓缩，用摩尔浓度为0.8摩尔/升的稀盐酸酸化至pH值3.5，缓慢加入Ph2CN2和乙腈，搅拌0.5小时后，溶液调整pH值至8.9，用乙酸乙酯提取两次，有机层加入三苯甲基甘氨酸的羟基琥珀酼亚胺脂，并用高效液相色谱法来监测反应进程，反应完成后，混合物用盐水洗涤三次后，浓缩除去溶剂；黄色油状产物被重新溶解于二氯甲烷中，继续加入4-硝基苯基氯和吡啶，混合物在-20℃下搅拌，反应结束后，将产物加载到硅胶柱上用25％丙酮—正己烷洗脱纯化，收集组分旋干燥。
7.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤D具体反应为：化合物4溶解在含有二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺中，然后加入化合物3，混合物在0℃下搅拌用胶柱纯化，并用25％丙酮—正己烷洗脱后收集。
8.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤E具体反应为：三异丙基硅烷和三氟乙酸加入到含化合物4的正己烷中，搅拌，除去溶剂，用二氯甲烷洗涤3次后重新溶解在二甲基亚砜中，然后加入化合物6和二异丙基乙胺，在0℃下搅拌，反应结束后，通过制备高效液相色谱纯化，用岛津高效液相色谱法在540nm波长检测，收集组分冷冻干燥。
9.一种权利要求1所述的广谱β-内酰胺酶荧光底物的应用，其特征在于：所述的广谱β-内酰胺酶荧光底物用于制备检测个体耐药性的诊断检测试剂或诊断检测试剂盒。
10.根据权利要求9所述的广谱β-内酰胺酶荧光底物的应用，其特征在于：所述的诊断检测试剂或诊断检测试剂盒用于检测β-内酰胺类抗生素的个体耐药性。
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