CN103501766B - 不良水溶性物质的高主动脂质体装载 - Google Patents

不良水溶性物质的高主动脂质体装载 Download PDF

Info

Publication number
CN103501766B
CN103501766B CN201280021180.0A CN201280021180A CN103501766B CN 103501766 B CN103501766 B CN 103501766B CN 201280021180 A CN201280021180 A CN 201280021180A CN 103501766 B CN103501766 B CN 103501766B
Authority
CN
China
Prior art keywords
liposome
water soluble
gradient
poorly water
soluble material
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201280021180.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103501766A (zh
Inventor
P·J·盖拉德
C·C·M·阿佩尔多恩
J·里普
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
2-BBB medical Limited by Share Ltd
Original Assignee
TO BBB Holding BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TO BBB Holding BV filed Critical TO BBB Holding BV
Publication of CN103501766A publication Critical patent/CN103501766A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103501766B publication Critical patent/CN103501766B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及在脂质体中包封、尤其通过主动装载包封具有低水溶解度的物质的领域。本发明人已经出人意料地发现，可通过溶解度增强剂首先溶解自身几乎不溶于水的功能性物质，实现具有高脂质体装载的脂质体的有效主动装载。这显著地使功能性物质与脂质的质量比增加至高于通过常规主动或被动装载技术而获得的那些水平的水平，并且扩大了适于包封在脂质体中的包括药物在内的功能性物质的范围。本发明一方面提供了主动装载方法。本发明还提供具有高载药的脂质体组合物。

Description

不良水溶性物质的高主动脂质体装载
发明领域
本发明涉及在脂质体中包封具有低水溶解度的物质的领域。更具体地，本发明涉及不良水溶性药物到脂质体中的主动装载。本发明还提供了具有高载药的脂质体组合物。
发明背景
在医学环境和研究环境中，高度期望诊断剂和治疗剂向细胞和组织的有效递送。尽管多年来已产生了许多用于诊断剂和治疗剂的递送***，但具有最小副作用和低毒性的用于具有不良水溶解度的化合物的有效递送***仍遥不可及。因此，对于实现这些目标的诊断剂和治疗剂递送技术而言，存在着持续的需求。
脑部是药物治疗和诊断的特别具有挑战性的靶标。具体地，因为血脑屏障(BBB)抑制了诊断剂和治疗剂向中枢神经***(CNS)的全身给药的效力。能穿过BBB的大部分药物以及许多药理学目标化合物为亲脂性的，因此具有非常低的水溶解度或甚至不溶于水。有限的水溶解度妨碍了药物或功能性化合物的静脉内给药。此外，通过血液的给药导致体内的毒副作用。此外，药物或功能性化合物是否能以治疗量达到靶器官仍存在疑问。仍需要用于将治疗化合物和/或诊断化合物穿过BBB有效递送至CNS靶标的组合物和方法。
已经提出脂质体能增加穿过BBB达到脑部的药物递送(EP 0652775 B1以及其中的参考文献)。本领域技术人员普遍已知脂质体能装载各种组分，包括药物、肽和蛋白。用于递送药物和其他功能性化合物的脂质体的优势主要在于，与静脉内给药游离化合物相比，由脂质体制剂表现出降低的毒副作用。
在利用用于递送功能性化合物的脂质体时，通常期望将脂质体装载至高浓度，产生功能性化合物-脂质的高质量比，因为这降低了每次治疗为获得所需治疗作用而给药的脂质体的量，更是因为在脂质体中使用的多个脂质自身具有剂量限制性毒性(引用)。装载百分比对于成本效率也是重要的，因为不良装载导致活性化合物的大幅损失。
用于将功能性化合物、特别是药物包封在脂质体中的多种装载方法是可行的。例如，亲水性化合物能通过将功能性化合物和形成囊泡的脂质的混合物水化而被包封在脂质体中。该技术被称为“被动装载”。当纳米颗粒形成时，功能性化合物被包封在脂质体中。亲脂性以及在较小程度上为两亲性的功能化合物，与亲水性功能性化合物相比，稍微更加有效地被装载，这是因为它们分配在脂质双层和脂质体内的含水介质中。然而，使用被动装载，最终的功能性化合物与脂质的比以及包封效率通常是低的。药物在脂质体中的浓度等于周围流体的浓度，并且游离的未包封的药物在包封之后被冲洗掉。
可使用溶解度增强剂以增加亲脂性化合物在脂质体外的含水介质中的浓度，从而增加被动装载技术的最终的功能性化合物与脂质的比。基于共溶剂、表面活性剂和络合剂的使用，已经开发了许多用于溶解亲脂性化合物的方法。在含水药物制剂中常用的多种溶解度增强剂为环糊精、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、山梨醇、非离子表面活性剂和聚乙氧基化蓖麻油。在一些情况中，极端的pH还可以用于增加不良可溶性药物的溶解度。然而，这些溶解度增强剂和溶解度增强条件对于人类而言可能为毒性的或刺激性的。
由Challa等人,2005给出了环糊精-药物络合的综述。McCormack等人,1994&1998描述了使用被动装载技术将羟丙基-β-环糊精-药物包合络合物包封入脂质体的方法。经改性的环糊精用作用于水不溶性药物***、脱氢表雄酮、视黄醇和视黄酸的溶解度增强剂，与当装载有未络合的药物时获得的脂质体相比，其产生具有增加的药物与脂质体的质量比的脂质体。
US 2009/0196918 A1公开了具有羟丙基-β-环糊精或磺丁醚-β-环糊精和疏水性内酯药物的包合络合物的脂质体制剂。通过被动装载将环糊精-药物包合络合物包封入脂质体。
US 2007/0014845 A1公开了具有小于约50μg/ml的典型水溶解度的疏水性药物的脂质体递送载剂，其包含用亲水性聚合物衍生化的脂质。通过形成药物-环糊精包合络合物来增加所述疏水性药物在脂质体内的溶解度。在脂质体内的环糊精浓度优选大于400mg/ml。通过被动装载进行包合络合物的包封。
这些被动装载技术的缺点为，除了所需功能性化合物之外的溶解度增强剂环糊精的不期望的给药，以及包封效率仍不令人满意的事实。
使用跨膜pH梯度或离子梯度可将某些亲水性或两亲性化合物装载到预制的脂质体中(Zucker等人,2009)。该技术被称为主动或远程装载。适于主动装载的化合物应能从可扩散穿过脂质体膜的不带电形式变化为不能扩散穿过脂质体膜的带电形式。通常，通过向被制备为具有更低外部/更高内部pH梯度或离子梯度的脂质体悬浮液添加功能性化合物来装载所述功能性化合物。通过主动装载，可以实现功能性化合物与脂质的高质量比以及高的装载效率(到达100%)。实例为抗癌药物阿霉素、道诺霉素和长春新碱的主动装载(Cullis等人,1997，以及其中的参考文献)。
对于非极性/极性表面积比>2.31的亲脂性化合物，必要的是，药物具有合理溶解度，即>1.9mM，从而实现有效的主动装载，这是因为仅有可溶性不带电分子能进入脂质体(Zucker等人,2009)。这意味着许多亲脂性功能性化合物，例如与穿过BBB相关的药物，不能通过主动装载而产生足够高的功能性化合物与脂质的质量比。
发明简述
本发明人已经出人意料地发现，可使用溶解度增强剂，通过首先溶解自身不溶于水或具有非常低的水溶解度的功能性物质，实现具有高脂质体装载的脂质体的有效主动装载。因此，本发明将具有低水溶解度的物质的功能性物质与脂质的质量比增加至高于通过脂质体的常规的主动或被动装载技术而获得的那些水平的水平，并且扩大了适于包封在脂质体中的包括药物在内的功能性物质的范围。
不希望受到任何理论的束缚或限制本发明的范围，要确信的是，本发明允许使用溶解度增强剂装载脂质体，所述溶解度增强剂在装载期间和装载之后保持在脂质体外部。在从包含未包封的功能性化合物的流体相分离脂质体之后，通常地，在剩余的脂质体制剂中存在非常少的增溶剂或根本不存在增溶剂。
本领域技术人员显而易见是，本发明的方法的使用不限于药物产品。需要不良水溶性物质的脂质体包封的任何产品或方法都可受益于本发明。因此，即使本文具体例示和/或限定的所有实施方案涉及药物产品，本申请也包括不涉及药物产品的实施方案。
发明详述
本发明的第一方面涉及使用不良水溶性物质装载脂质体的方法，所述方法包括：
a)提供混合物，其包含：
i.包封内部含水介质的脂质体；
ii.所述不良水溶性物质；
iii外部含水介质；以及
iv.增加所述不良水溶性物质在所述外部含水介质中的溶解度的溶解
度增强剂；
其中存在跨所述脂质体膜的质子梯度和/或离子梯度；以及
b)孵育所述混合物，持续足以导致至少部分所述不良水溶性物质被提取出(drawn out)所述外部含水介质并在所述质子梯度和/或离子梯度的影响下在所述脂质体中蓄积的时间段。
在本文件及其权利要求书中，动词“包括”及其词形变化以其非限制性含义使用，从而表示在该词语之后的项目被包括在内，但不排除未特别提及的项目。此外，由英文不定冠词“a”或“an”所提及的元素不排除存在多于一个所述元素的可能性，除非上下文明确要求有且只有一个所述元素。因此，英文不定冠词“a”或“an”表示“至少一个”。
脂质体
本发明包括提供包含预制脂质体的混合物，所述预制脂质体包封内部含水介质。术语“脂质体”按照其一般含义用在本文中，是指包封内部含水介质的、由双层磷脂或任何类似的两亲性脂质组成的微观脂质囊泡。本发明的脂质体可以为单层囊泡（如小单层囊泡(SUV)和大单层囊泡(LUV)）以及多层囊泡(MLV)，通常尺寸为50nm至200nm。在本发明中，对脂质体膜结构没有施加特别限制。术语“脂质体膜”是指将内部含水介质与外部含水介质分开的双层磷脂。
可用于本发明的脂质体膜可以由多种形成囊泡的脂质形成，所述形成囊泡的脂质通常包括二脂族链脂质如磷脂，双甘油二酯，二脂族糖脂（dialiphatic glycolipid），单脂质如鞘磷脂和鞘糖脂，胆固醇及其衍生物，以及它们的组合。如本文所定义，磷脂是两亲性物质，其具有由长链烷基链形成的疏水性基团和包含磷酸根部分的亲水性基团。磷脂包括磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸，以及它们的混合物。优选地，所述磷脂选自1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰-磷脂酰胆碱(DMPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、大豆磷脂酰胆碱(SPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、蛋黄磷脂酰胆碱(EYPC)或氢化蛋黄磷脂酰胆碱(HEPC)。
本发明的脂质体膜还可以包含离子载体，例如尼日利亚菌素和A23187。
在本发明的方法中，优选的是，脂质体的相变温度为0℃至100℃，优选4℃至65℃。相变转化温度是诱导组成脂质体的脂质由其中烃链完全伸展且紧密堆砌的有序凝胶相变化为其中烃链随机取向且为流体的无序液晶相的物理状态变化所需的温度。在脂质体的相变温度之上，脂质体膜的渗透性增加。选择脂质体始终为凝胶态的高转变温度会提供无渗漏脂质体组合物，即，在暴露于环境时，内部含水介质中的不良水溶性物质的浓度得到保持。或者，转变温度在其所暴露的环境的起始温度至终末温度之间的脂质体会提供当所述脂质体经过其转变温度时释放不良水溶性物质的手段（means）。因此，用于主动装载技术的加工温度通常高于脂质体相变温度以促进主动装载过程。如本领域普遍已知的，除了其他参数之外，可通过选择磷脂和通过添加诸如胆固醇、羊毛固醇、胆甾烷醇、粪甾醇、麦角固醇等的类固醇来影响脂质体的相变温度。因此，在本发明的实施方案中，提供任一前述的方法，其中脂质体包含一种或多种选自不同磷脂的组分和胆固醇，所述组分和胆固醇的摩尔比有多种，从而改变所述转变、所需加工温度以及在血浆中的脂质体稳定性。在混合物中的胆固醇越少会导致脂质体在血浆中越不稳定。优选的磷脂组合物包括10摩尔%至50摩尔%的类固醇，优选胆固醇。
根据本发明，可通过目前已知的或以后为了制备脂质体而开发的任何技术来制备脂质体。例如，脂质体可通过用于制备多层脂质囊泡(MLV)的常规技术而形成，即，通过将一种或多种所选的脂质溶解在氯仿中并随后蒸发所述氯仿而将所述脂质沉积在合适的容器的内壁上，然后通过向所述容器添加要包封的水溶液，使所述水溶液将所述脂质水化，并旋动或涡旋所得的脂质悬浮液。该过程产生包含所需脂质体的混合物。或者，用于制备大单层脂质囊泡(LUV)的技术，例如逆相蒸发、输注法以及去垢剂稀释，可以用于制备脂质体。这些和其他用于制备脂质囊泡的方法的可见于文件Liposome Technology,Volume I,Gregory Gregoriadis Ed.,CRC Press,BocaRaton,Fla.,(1984)，其通过援引加入本文。例如，含脂质的颗粒可为下述形式：甾体脂质囊泡、稳定的多层脂质囊泡(SPLV)、单相囊泡(MPV)或脂质基质载体(LMC)。对于MLV，若需要，可将脂质体进行多次(五次或更多次)冻融循环以增加其包封体积和包封效率，并提供更均匀的溶质层间分布。
在脂质体制备之后，可以对脂质体进行尺寸调整(sized)以实现所需的尺寸范围和相对窄的脂质体尺寸分布。约20-200纳米的尺寸范围允许通过常规过滤器（通常0.22或0.4微米过滤器）过滤对脂质体悬浮液进行消毒。如果脂质体尺寸已经被下调至约20-200纳米，则可以高通量(through-putbasis)实施所述过滤器消毒法。多种技术可用于将脂质体尺寸调整至所需尺寸。通过浴或探针超声处理来超声处理脂质体悬浮液产生了逐渐的尺寸降低，直至尺寸小于约50纳米的单层囊泡。均化是另一方法，其依赖于剪切能以将大脂质体破碎成更小的脂质体。在典型的均化操作中，将多层囊泡通过标准乳液均化器再循环，直至观察到所选的脂质体尺寸，通常为约50-500纳米。在两种方法中，可以通过常规的激光束粒径测定来监测粒径分布。通过小孔聚碳酸酯膜或不对称陶瓷膜的脂质体的挤出也是用于将脂质体尺寸降低至相对界定明确的尺寸分布的有效方法。通常，使悬浮液通过膜循环一次或多次，直至实现所需的脂质体尺寸分布。可以通过依次更小孔径的膜来挤出脂质体，以实现脂质体尺寸的逐渐降低。其他可用的尺寸调整方法，例如超声处理、溶剂蒸发或逆相蒸发，是本领域技术人员已知的。
为了用于本发明，尺寸为约50纳米至约180纳米的脂质体是优选的。
如本文所提到的，‘内部含水介质’通常为这样的初始介质：在所述初始介质中制备脂质体，且当形成所述脂质体时，所述初始介质首先被包封。根据本发明，包封所述初始含水介质的新鲜制备的脂质体可直接用于主动装载。然而，还可考虑这样的实施方案，其中，例如为了贮存，在制备之后将脂质体脱水。在这样的实施方案中，本发明的方法可以包括向用于产生跨膜梯度的外部含水介质直接添加脱水的脂质体。然而，本领域技术人员会理解，还可以首先将所述脂质体在另一外部介质中水化。优选地，使用标准冷冻-干燥设备或等效装置，在减压下将脂质体脱水。可以将脂质体及其周围介质冷冻在液氮中，然后脱水和减压放置。没有先前冷冻的脱水与有先前冷冻的脱水相比耗时更长，但是，没有冷冻步骤，总体过程更温和，因此，随后对脂质体的破坏更小以及内部内容物的损失更少。为了确保脂质体在不损失大部分内部内容物的情况下度过（survive）脱水过程，通常采用一种或多种保护糖以与脂质囊泡膜相互作用并且使它们在除去***中的水时保持完整。可使用多种糖，包括诸如海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖和葡聚糖的糖。通常，已经发现二糖糖类与单糖糖类相比表现得更好，其中二糖海藻糖和蔗糖最有效。也可使用其他更复杂的糖。例如，已经发现包括链霉素和双氢链霉素的氨基糖苷在脱水期间保护脂质体。通常，包含一种或多种糖以作为脂质囊泡的内部介质或外部介质的一部分。更优选地，将所述糖包含在内部介质和外部介质二者中，从而于它们可与脂质体膜的内表面和外表面二者相互作用。通过向在脂质体形成过程中被包封在脂质囊泡中的缓冲剂添加所述一种糖或多种糖，完成在内部介质中的包含。在这些实施方案中，在主动装载过程中使用的外部介质还应优选包含所述保护糖中的一种或多种。
如本领域技术人员普遍已知的，聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物已经广泛用于改善脂质体包封的功能性化合物的循环时间，从而避免或降低功能性化合物从脂质体组合物的过早渗漏以及防止身体免疫***检测到脂质体。PEG-衍生的脂质到脂质体的连接被称为聚乙二醇化。因此，在本发明特别优选的实施方案中，脂质体为聚乙二醇化的脂质体。通过将PEG的反应性衍生物与靶脂质体一起孵育，实现聚乙二醇化。本发明的合适的PEG衍生的脂质包括被下列之一官能化的DSPE-PEG缀合物：羧酸、谷胱甘肽(GSH)、马来酰亚胺(MAL)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸(PDP)、氰尿酸(cyanur)、叠氮化物、胺、生物素或叶酸，其中PEG的分子量为2000-5000g/mol。其他合适的PEG衍生的脂质为与神经酰胺缀合的mPEG，其具有C8或C16-尾部，其中mPEG的分子量为750-5000g/mol。其他合适的配体为与甘油磷脂缀合的mPEG或官能化PEG，例如，1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)等。脂质体的聚乙二醇化是本领域技术人员普遍已知的技术。
在本发明的特别优选的实施方案中，使用DSPE-PEG-GSH缀合物(高达5mol%)和/或DSPE-mPEG缀合物(其中PEG分子量通常为750-5000g/mol，例如2000g/mol)将脂质体聚乙二醇化。本发明的磷脂组合物可以包含高达5-20mol%的PEG-脂质缀合物。
此外，在某些实施方案中，期望将使脂质体特异性靶向特定细胞类型、组织等的部分掺入脂质体膜中。以前已经描述了使用多种靶向部分(例如，配体、受体和单克隆抗体)的脂质体靶向。这样的靶向部分的合适的实例包括：脂蛋白脂肪酶(LPL)、[α]2-巨球蛋白([α]2M)、受体相关蛋白(RAP)、乳铁蛋白、去氨普酶、组织-和尿激酶-型纤溶酶原激活剂(tPA/uPA)、纤溶酶原激活抑制剂(PAI-I)、tPA/uPA:PAI-l复合物、黑素转铁蛋白(或P97)、血小板反应蛋白1和2、肝脂肪酶、因子Vlla/组织-因子途径抑制剂(TFPI)、因子Villa、因子Ixa、A[β]l-40、淀粉样-[β]前体蛋白(APP)、Cl抑制剂、补体C3、载脂蛋白E(apoE)、假单胞菌外毒素A、CRM66、HIV-I Tat蛋白、鼻病毒、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、MMP-13(胶原酶-3)、鞘脂激活蛋白(SAP)、妊娠带蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、[α]l-抗胰蛋白酶、热休克蛋白96(HSP-96)、血小板衍生生长因子(PDGF)、载脂蛋白J(apoJ或丛生蛋白)、与apoJ和apoE结合的A[β]、抑肽酶、angiopep-2(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)、极低密度脂蛋白(VLDL)、转铁蛋白、胰岛素、瘦素、***、表皮生长因子、凝集素、对所述抗体具有特异性的素拟肽和/或人源化单克隆抗体或肽(例如，与人转铁蛋白受体结合的序列HAIYPRH和THRPPMWSPVWP，或抗人转铁蛋白受体(TfR)单克隆抗体A24)、血红蛋白、白喉毒素多肽链的无毒部分、白喉毒素Ｂ链的所有或部分、白喉毒素CRM197的无毒突变体的所有或一部分、载脂蛋白B、载脂蛋白E(例如，在与polysorb-80涂层结合后)、维生素D结合蛋白、维生素A/视黄醇结合蛋白、维生素B12/钴胺素血浆载体蛋白、谷胱甘肽和钴胺传递蛋白-B12。
靶向机制通常需要靶向剂以靶向部分可与靶标（如细胞表面受体）相互作用的方式位于脂质体表面上。通常以首先在形成膜时将连接体(connector)部分掺入所述膜的方式来形成脂质体。所述连接体部分必须具有亲脂性部分，所述亲脂性部分被牢固地嵌入和锚固在所述膜中。其必须还具有亲水性部分，所述亲水性部分在脂质体的水性表面上为在化学上可利用的。选择所述亲水性部分，使得于其在化学上适于与后来添加的靶向剂形成稳定的化学键。因此，连接体分子必须具有亲脂性锚，和从脂质体表面伸出去的适于与靶向剂反应并将靶向剂保持在其正确位置的亲水性反应性基团。用于将靶向部分掺入脂质体膜的技术在本领域中普遍已知。
不良水溶性物质
如上所述，本发明涉及用不良水溶性物质装载脂质体。在本发明的语境中，术语“不良水溶性”表示不溶于水或在水中具有非常有限的溶解度，更特别地，在环境温度(通常为约20℃)和pH=7下具有小于1.9mM的水溶解度，甚至更优选具有小于1mM的水溶解度。
根据本发明的实施方案，不良水溶性物质为选自类固醇、蒽环类、紫杉醇、雷帕霉素(西罗莫司)、CKD-602、双氯芬酸、阿霉素、布比卡因、长春新碱、托泊替康、环丙沙星、西替利嗪、非索非那定、扑米酮和其他儿茶酚胺类、肾上腺素、这些药用化合物的盐和衍生物、以及它们的混合物的药用化合物。
然而，该化合物列举不旨在限制本发明的范围。实际上，功能性化合物可以为任何不良水溶性的两亲性弱碱或两亲性弱酸。如上所述，也考虑其中不良水溶性物质不为药物或药用物质的实施方案。
在优选的实施方案中，所述不良水溶性物质为选自类固醇、蒽环类、紫杉醇、雷帕霉素(西罗莫司)、双氯芬酸、克唑替尼(Crizotinib)、喹啉酸、PD 150606、布比卡因、长春新碱、托泊替康、环丙沙星、西替利嗪、非索非那定、扑米酮和其他儿茶酚胺、肾上腺素、这些药用化合物的盐和衍生物、以及它们的混合物的药用化合物。
通常，在本文的语境中，不良水溶性的两亲性弱碱在pH7下具有-2.5至2的辛醇-水分布系数(logD)且pKa≤11，而不良水溶性的两亲性弱酸在pH7下具有-2.5至2的logD且pKa>3。优选地，要主动装载的不良水溶性物质具有良好的热稳定性(至约70℃，持续4小时)和在更高(7-11)或更低(4-7)pH下良好的化学稳定性。
通常，前述所用的术语“弱碱”和“弱酸”分别是指在水中仅被部分质子化或去质子化的化合物。可质子化的物质的实例包括具有可在酸性介质中被质子化的氨基的化合物，以及在中性介质中为两性离子的且还可在酸性环境中被质子化的化合物。可去质子化的物质的实例包括具有可在碱性介质中被去质子化的羧基的化合物，以及在中性介质中为两性离子的且还可在碱性环境中被去质子化的化合物。
术语“两性离子的”是指可同时在不同原子上携带正电荷和负电荷的化合物。前述所用的术语“两亲性的”通常用于指具有亲脂性和亲水性部分的化合物。前述表明，作为两亲性弱酸或弱碱的化合物的水溶液同时包含所述化合物的带电和不带电形式。仅不带电形式可以穿过脂质体膜。
主动装载
如上所述，按照主动或远程装载技术，用不良水溶性物质装载预制的脂质体。“主动装载”的方法包括使用跨膜电位。一般而言，主动装载的原理已经在本领域中广泛描述。术语“主动装载”和“远程装载”是同义词并可交换地使用。
在主动装载期间，不良水溶性物质通过跨膜质子梯度或离子梯度，从外部含水介质穿过脂质体膜而转移至内部含水介质。本文所用的特定化合物的术语“梯度”是指从脂质体外部(外部含水介质)到内部(内部含水介质)的跨越脂质体膜的所述化合物的浓度的不连续增加。
为了产生浓度梯度，通常在第一液相(典型地为水相)中形成脂质体，然后替换或稀释所述第一液相。稀释的或新的外部介质具有不同浓度的带电物质或者完全不同的带电物质，由此建立离子梯度或质子梯度。
外部介质的替换可以通过各种技术完成，例如通过使脂质囊泡制剂经过已用新介质平衡的凝胶过滤柱（例如Sephadex或Sepharose柱），或者通过离心、渗析或相关技术。
在其他方面中，向脂质体中的主动装载的效率取决于要装载的物质的化学性质以及施用的梯度的类型和大小。在本发明的一实施方案中，提供了利用跨脂质体膜的梯度的任一前述实施方案中限定的方法，其中所述梯度选自pH梯度，硫酸盐梯度，磷酸盐梯度，柠檬酸盐梯度或乙酸盐梯度，EDTA-离子梯度，铵盐梯度，烷基化铵盐如甲基-、乙基-、丙基-和戊基-铵盐梯度，使用或不使用离子载体的Mn2+-梯度、Cu2+-梯度、Na+-梯度、K+-梯度，或者它们的组合。这些装载技术已经在本领域广泛描述。
优选地，预制的(即未装载的)脂质体的内部含水介质包含所谓的主动装载缓冲剂，其包含水，并且根据在主动装载期间所用的梯度类型，可进一步包含硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或乙酸盐、铵盐、烷基化（如甲基-、乙基-、丙基-和戊基-）铵盐、Mn2+-盐、Cu2+-盐或Na+/K+-盐、EDTA-离子盐，以及任选地包含用于保持pH梯度的pH缓冲剂。在未装载的脂质体的内部含水介质中的盐的优选浓度为1-1000mM。
用于建立主动装载所用的跨膜梯度的外部含水介质包含水、溶解度增强剂、要装载的不良水溶性物质，以及任选地包含用于调节渗量的蔗糖和/或用于辅助离子载体活性的诸如EDTA的螯合剂，更优选地包含蔗糖和/或EDTA。也可以用盐水调节渗量。在本发明的优选实施方案中，提供了用于主动装载脂质体的方法，其中所确立的在内部含水介质中的形成梯度的盐的浓度以及在外部介质中的不良水溶性物质和溶解度增强剂的浓度的大小使得在主动装载期间发生跨脂质体膜的所述不良水溶性物质的净转运。
在更优选的实施方案中，所述梯度选自pH梯度、硫酸盐梯度和乙酸钙梯度。如本领域技术人员普遍已知的，跨膜pH梯度(内部pH较低，外部pH较高)或乙酸钙梯度可用于主动装载两亲性弱酸。使用硫酸铵梯度或氯化铵梯度也可将两亲性弱碱主动装载到脂质体中。未电离的不良水溶性两亲性化合物穿过膜并被质子化或去质子化和/或与脂质体内硫酸根、氯或钙反荷离子一起形成不溶性盐沉淀。
根据脂质囊泡膜的渗透性，与浓度梯度相对应的全跨膜电位会自发形成，或者可能必须向浴介质(bathing medium)添加渗透增强剂，如质子离子载体。若需要，可以使用色谱或其他技术，在装载已经完成之后从制剂除去所述渗透增强剂。
通常，在主动装载期间的加工温度为0-100℃，优选为0-70℃，且最优选为4-65℃。
包封或装载效率，其被定义为在内部水相中包封的不良水溶性物质的摩尔量除以在外部水相中的不良水溶性物质的初始摩尔量乘以100%，为至少25%，优选至少50%、至少60%或至少70%。
溶解度增强剂
如本文先前所述，本发明的主旨是向外部含水介质添加溶解度增强剂以增加不良水溶性物质从外部介质到脂质体中的摄取的速率和效率。由此，增加了在本发明的外部含水介质中溶解的不良水溶性物质的浓度。根据本发明的一实施方案，提供了前述实施方案所定义的方法，所述方法使用选自络合剂、共溶剂、表面活性剂和乳化剂的溶解度增强剂。所述溶解度增强剂通常使不良水溶性化合物在外部含水介质中的溶解度增加到至少2倍，优选至少3倍，优选增加到在环境温度下大于1.9mM的值，更优选增加到大于3.8mM的值。
如本文所定义的络合剂为与不良水溶性化合物形成水溶性包合络合物，由此增加所述不良水溶性化合物的水溶解度的水溶性化合物。在本发明的一实施方案中，所述溶解度增强剂为选自环糊精和聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)的络合剂。
聚维酮已知与许多功能性化合物形成水溶性络合物。本领域也已知环糊精的与多种两亲性和亲脂性客体分子形成稳定的非共价包合络合物的能力(Challa等人,2005)。它们具有亲脂性内腔和亲水性外表面，这产生了它们良好的水溶解度。3种天然存在的环糊精，即α-、β-和γ-环糊精，在它们环尺寸和水溶解度方面不同。在这些天然存在的环糊精中，β-环糊精的亲脂性内腔最适于各种功能性化合物。使用羟丙基-和磺烷基醚基团的化学修饰可以增加天然存在的环糊精的水溶解度和络合活性(Thompson 1997,Muller等人,1985,Szente等人,1999)。在本发明的一实施方案中，所述络合剂选自α-、β-和γ-环糊精以及用烷基-、羟基烷基-、二烷基和磺烷基醚基团修饰的环糊精。
在优选实施方案中，所述溶解度增强剂为选自β-环糊精、羟丙基-β-环糊精(HPβCD)和磺丁醚-β-环糊精的络合剂。优选地，以所述外部含水介质的总质量计，所述络合剂以0.1-25w%的量、优选0.5-15w%的量且最优选1-12w%的量存在于所述外部含水介质。
如上所述，所述溶解度增强剂还可以为共溶剂。将共溶剂用于增加有机药物类化合物的水溶解度是本领域公知的(Sweetana等人,1996;Rytting等人,2005)。
因此，在另一实施方案中，所述溶解度增强剂为共溶剂。在本文的语境中，共溶剂为可水混溶的溶剂，其一旦添加到水中则产生与纯水相比具有大幅增加的不良水溶性化合物溶解度的混合物。根据本发明，合适的共溶剂为聚乙二醇(PEG)、烟酰胺、脂族羧酸的N,N-二烷基酰胺、二甲基甲酰胺、醇、多元醇、二甲基亚砜和吡咯烷酮，尤其为聚乙二醇(PEG)、烟酰胺、脂族羧酸的N,N-二烷基酰胺、二甲基甲酰胺、多元醇、二甲基亚砜和吡咯烷酮。然而，该共溶剂列举不旨在限制本发明的范围。
在优选实施方案中，所述溶解度增强剂不为渗透所述脂质体膜的醇。
在优选的实施方案中，所述溶解度增强剂为选自PEG和烟酰胺的共溶剂，甚至更优选地，所述共溶剂为分子量为200-400g/mol的PEG。优选地，以所述外部含水介质的总质量计，所述共溶剂以至少1wt%，更优选至少2wt%，最优选至少5wt%的量存在。此外，优选的是，以所述外部含水介质的总质量计，所述共溶剂的量为小于75wt%，优选小于50wt%，更优选小于33wt%，且最优选小于10wt%。
如本文先前所述，所述溶解度增强剂还可以为表面活性剂和/或乳化剂。本文所定义的表面活性剂或乳化剂为使功能性化合物的微小的流体液滴或固体胶体颗粒在外部含水介质中稳定，由此使功能性化合物的跨水相分布几乎均一的化合物。不希望受限于任何特定理论，假设表面活性剂或乳化剂通过像保持不良水溶性化合物的饱和浓度的储库那样发挥作用，来增加不良水溶性化合物在外部含水介质中的可用性。
因此，在又一实施方案中，所述溶解度增强剂为表面活性剂和/或乳化剂，其选自聚乙氧基化蓖麻油(Cremophors)、聚乙二醇(macrogol)-15-羟基硬脂酸酯、PEG-脂质、泊洛沙姆(Pluronics)、多库酯钠、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸、聚山梨酯、中链甘油三酯、甲基纤维素及其衍生物、糖（如蔗糖）或其替代物(Metoloses)以及它们的组合，更优选选自聚乙氧基化蓖麻油(Cremophors)、聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯、PEG-脂质、泊洛沙姆(Pluronics)、多库酯钠、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸、聚山梨酯、中链甘油三酯、甲基纤维素及其衍生物以及它们的组合。优选的乳化剂/表面活性剂为蔗糖酯。通常，所述表面活性剂和/或乳化剂以10vol%的量存在。
在最优选的实施方案中，提供了用于主动装载脂质体的方法，所述方法包括使用选自HPβCD、分子量为200-400g/mol的PEG、蔗糖以及它们的混合物的溶解度增强剂。
如本文先前所述，存在于外部含水介质中的溶解度增强剂优选在不良水溶性化合物的主动装载期间不被转移穿过脂质体膜。因此，根据优选实施方案，提供了根据任一前述实施方案的主动装载方法，其中所述溶解度增强剂不能或仅稍微能够物理地最终（in time）通过脂质体膜。
在优选实施方案中，存在于外部含水介质中的溶解度增强剂不渗透所述脂质体膜。
在所述溶解度增强剂为络合剂的情况中，优选的是，所述络合剂和不良水溶性物质在外部介质中的解离速率超过将所述不良水溶性物质从所述外部介质摄取入脂质体中的速率。不希望受限于任何特定理论，确信的是，前者可以通过使所述外部介质中的络合剂和不良水溶性物质的浓度和/或组合以及跨越所述脂质体膜的质子梯度和/或离子梯度最优化而建立。因此，在优选实施方案中，提供了根据任一前述实施方案的用于装载预制脂质体的方法，其中，使在主动装载期间的加工温度、脂质体的相变温度、在外部介质中的络合剂和不良水溶性物质的浓度和/或组合、以及跨越脂质体膜的质子梯度和/或离子梯度最优化至使溶解度增强剂的脂质体摄取足够低的大小。优选地，以不良水溶性物质和溶解度增强剂的总摩尔数计，在已装载的脂质体的内部含水介质中的溶解度增强剂的浓度小于20mol%，更优选地，在已装载的脂质体中的溶解度增强剂的浓度小于5mol%，最优选地，其小于1mol%。
如前述所显而易见的，将给定的不良水溶性物质主动装载入脂质体中的速率和效率受许多因素的影响，特别是受跨膜梯度、溶解度增强剂的选择、脂质体膜的组成、加工温度等的影响。调整并最优化这些参数并同时得到最有效的方法(即，对于给定的不良水溶性物质而言)在本领域技术人员的能力和标准惯例的范围内。
不论如何，本发明的意义为首次认识到，在外部介质中使用溶解度增强剂与其中不采用溶解度增强剂的相同主动装载方法相比通常增加了摄取速率。
因此，本发明的另一方面涉及将如前所述的溶解度增强剂用于脂质体的主动装载以增加不良水溶性物质的装载效率和/或速率。在优选实施方案中，所述溶解度增强剂选自络合剂、共溶剂、表面活性剂、乳化剂以及它们的组合。应理解，优选的实施方案包括施用如任一前述实施方案中定义的预制脂质体、不良水溶性物质、内部含水介质、外部含水介质、梯度等。在本发明的优选实施方案中，所述使用包括将所述溶解度增强剂与所述不良水溶性物质、第一含水介质(即，本文先前所定义的外部介质)和包封第二含水介质(即，内部介质)的脂质体组合。
本发明的第三方面涉及可通过前述的主动装载方法获得的脂质体组合物。应理解，优选的实施方案包括这样的脂质体组合物，其中脂质体、不良水溶性物质、内部含水介质等均为如任一前述实施方案所定义的。
在本发明的优选实施方案中，该组合物的不良水溶性物质与脂质的质量比为至少1:25，优选至少1:15，更优选至少1:10，更优选至少1:7，更优选至少1:5，并且更优选至少1:2。
本领域技术人员会理解，通常所述脂质体组合物包含主要为沉淀形式的不良水溶性物质。通常，不多于小部分的在脂质体内的不良水溶性物质与溶解度增强剂络合，例如，在内部含水介质中，小于10mol%且优选小于1mol%的不良水溶性化合物与溶解度增强剂络合。
此外，在一实施方案中，以不良水溶性物质和溶解度增强剂的总量计，在已装载的脂质体的内部含水介质中的溶解度增强剂的量小于20mol%，更优选地，在已装载的脂质体中的溶解度增强剂的浓度小于5mol%，最优选地，其小于1mol%。
通过下列实施例进一步举例说明本发明，所述实施例不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1.预制的主动装载脂质体的制备
脂质体可以由多种摩尔比的不同磷脂和胆固醇组成，从而修改转变/加工温度和血浆中的颗粒稳定性。具体地，将磷脂与胆固醇(Chol)以不同比例使用，所述磷脂例如1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、大豆磷脂酰胆碱(SPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或蛋黄磷脂酰胆碱(EYPC)，其中，混合物中的Chol越少，会导致脂质体在血浆中越不稳定。将组分溶解在乙醇或异丙醇中。此外，为了增加(体内)颗粒稳定性和增强脑部递送，可以将由DSPE-PEG-GSH(高达5mol%)组成的胶束和/或DSPE-mPEG(Mw2000)以不同的摩尔百分比(总计高达5-10mol%)添加到溶液中，所述DSPE-PEG-GSH是使用DSPE-PEG-MAL和新鲜的还原谷胱甘肽溶液在制备脂质体之前合成的。将(脂质)混合物注入包含不同离子强度(1-1000mM)的主动装载缓冲剂（例如2mg/mL硫酸铵或1mg/mL乙酸钙）的水溶液中。在搅拌之后，将形成的囊泡通过膜而挤出或者在乳化器中均化以产生均匀尺寸的脂质体。或者，在通过在25℃至高达60℃下孵育2小时至高达24小时(取决于脂质混合物的相变温度以及物质的温度敏感性)而制备脂质体之后，添加DSPE-PEG-GSH或DSPE-mPEG。通过一般分离方法，例如渗析或渗滤，将脂质体与过量的主动装载缓冲剂分离。通过测量粒径(在Malvern Zetasizer上为50-200nm)、ζ电位、磷脂含量(使用Phopholipids B试剂盒或HPLC/UPLC***)以及肽含量(基于HPLC/UPLC或OPA测定，为0.2-10mol% GSH)来表征脂质体。
实施例2.不良溶解性化合物A的高主动脂质体装载
具有低分子量的小分子(化合物A)在环境温度(约20℃)下的水溶解度为0.003mg/ml。在不同pH下(测试范围为pH1.5-10)，溶解度没有显著增加，其中在环糊精、PEG200和烟酰胺中，溶解度在pH=7下增加至2.5mg/ml。
在5-60μg/ml的浓度下，在262nm使用UV测定化合物，或使用装备有C-18RP柱的HPLC***测定化合物。
将溶解的化合物以不同的药物与脂质的比(4:1、2:1、1:1、1:2、1:4)暴露于一系列实施例1所述的预制脂质体，以测定最优包封效率条件。
具体地，最优装载条件如下。在60℃下，将GSH-PEG-DSPE胶束(5%)溶解在2mg/mL硫酸铵溶液中。向该溶液添加溶解于乙醇(在60℃)的HSPC(55%)和胆固醇(40%)，并通过经由过滤器的挤出直至获得约100nm的颗粒来制备脂质体。随后，通过渗析除去游离硫酸铵，并且在4℃贮存以供进一步使用。然后，制备在10%羟丙基β-环糊精(HPβCD)中的化合物A的2.5mg/mL溶液，并添加到预制脂质体(在60℃，持续60分钟)中，从而使化合物A与硫酸铵的铵交换，并在脂质体核内沉淀。之后，直接将已装载的脂质体在冰上冷却，并通过渗析除去HPβCD中过量的化合物A，并且在4℃贮存以供进一步使用。与最优装载条件相对应的初始的药物与脂质比为1:4。
最优包封效率为60-70%，并且最终产物具有含1mg/ml化合物A且药物与脂质的比为1:5.7的脂质体。可以随后将该脂质体溶液浓缩2-3倍，以提供甚至更浓的溶液。相反，溶解在PEG200和烟酰胺中的化合物A没有产生进入相同预制脂质体的活性装载。
测试已装载的脂质体在50mM磷酸盐缓冲剂(pH7.4，5%蔗糖)中，在4℃和37℃下持续12天(2、4、6、24、48、120、288小时)的体外渗漏。在测量之前，使用尺寸排阻色谱，将释放的化合物从溶液除去，并且用50%2-丙醇释放包封的化合物，并进行测量。从该分析测定的是，一些化合物从脂质体释放，在第一个24小时期间在两个温度下相似(约20%)，并且在24小时之后，该渗漏稳定。
从基于细胞的测定获知的是，化合物A为药物流出泵乳腺癌耐药蛋白(BCRP，还称为ABCG2)的底物，所以在野生型小鼠和BCRP敲除小鼠中测试制剂。将化合物以2.5mg/kg的剂量注入小鼠的尾静脉。用脂质体化合物或在HPβCD中配制的游离化合物来注射动物。在注射后6个小时，在血浆中回收了脂质体化合物A的注射剂量的52%，并且在野生型小鼠的脑匀浆中回收了0.5%。在BCRP敲除小鼠中，这些值分别为50%(在血浆中)和0.6%(在脑匀浆中)。相反，对于HPβCD制剂，在野生型动物中，这些值仅为0.01%(在血浆中)和0.03%(在脑匀浆中)，其中BCRP敲除小鼠在8小时之后，在脑匀浆中具有配制在HPβCD中的化合物A的注射剂量的0.23%，并且在血浆中，浓度低于检出水平。
总之，通过提高化合物A在HPβCD中的溶解度，由使用硫酸铵梯度的主动装载机制制备了高度浓缩且稳定的脂质体制剂。该脂质体制剂提供化合物A的长血液循环时间，并且显著地使化合物A的脑部递送增加至超过可在仅用配制在HPβCD中的最大耐受量的化合物A注射的BCRP敲除小鼠中获得的水平的2倍，并且超过可在野生型小鼠中达到的水平的15倍。
实施例3.不良溶解性化合物B的高主动脂质体装载
化学分子(化合物B)具有低分子量。在水中的溶解度为0.048mg/ml，并且该化合物在碱性pH下分解。溶解度在PEG200中增加至高达8mg/ml。
在5-60μg/ml的浓度下，在295nm用UV测定化合物。将溶解的化合物暴露于一系列实施例1所述的预制脂质体。具体地，制备具有良好包封效率的两种不同的组合物。首先，在60℃下，将GSH-PEG-DSPE胶束(5%)溶解在250mM乙酸钙溶液中。向该溶液添加溶解在乙醇(在60℃下)中的HSPC(55%)和胆固醇(40%)。其次，在25℃下，将GSH-PEG-DSPE胶束(5%)溶解在250mM乙酸钙溶液中。向该溶液添加溶解在乙醇(在25℃下)中的DMPC(55%)和胆固醇(40%)。对于两种组合物，通过经由过滤器的挤出直至获得约100nm的颗粒来制备脂质体。随后，通过渗析除去游离乙酸钙，并且在4℃贮存以供进一步使用。然后，制备在PEG200和5%蔗糖水溶液的(1:1vol/vol)混合物中的化合物B的4mg/mL溶液，并以不同的药物与脂质的比添加至预制脂质体中(对于第一种组合物在60℃下，并且对于第二种组合物在25℃下，二者均持续60分钟)，从而使化合物B与乙酸钙交换并在脂质体核内沉淀。之后，直接将已装载的脂质体在冰上冷却，并通过渗析除去PEG200/蔗糖混合物中过量的化合物B，并且在4℃贮存以供进一步使用。
第一组合物的最优包封效率在1:3的初始的药物与脂质比下为60-70%。最终产物具有包含1.8mg/ml化合物B且药物与脂质的比为1:4.5的脂质体。对于第二组合物，最优包封效率在1:3的初始的药物与脂质比下为25-30%的包封。最终产物具有包含2mg/ml化合物B且药物与脂质的比为1:25的脂质体。可以将这些脂质体溶液浓缩2-3倍，从而提供甚至更浓的溶液。相反，溶解在纯PEG200和HPβCD中的化合物B没有产生进入相同预制脂质体的主动装载，并且还没有产生在包含硫酸铵的预制脂质体中的主动装载。
测试已装载的脂质体在50mM磷酸盐缓冲剂(pH7.4，5%蔗糖)中，在4℃和37℃下，在制备之后的第1、3和7天的体外渗漏。在测量之前，使用尺寸排阻色谱，将释放的化合物从溶液除去，并且用50%2-丙醇释放包封的化合物，并进行测量。从该分析测定的是，两种制剂在冷藏箱中至少稳定1周，并且对于第一组合物，在37℃下至少稳定1天。第二组合物在37℃下在1天之后失去了其大部分化合物。
将配制的化合物以2mg/kg的剂量注入小鼠的尾静脉。用脂质体化合物(组合物1和2)或在PEG400-HPβCD(10:90v/v)中配制的游离化合物来注射动物。然而，两种脂质体制剂具有出人意料地短的血浆半衰期。因此，在注射之后15分钟进行在制剂之间的分布差异的评估。在这些样品中，对于组合物1和2，在血浆中分别回收了脂质体化合物B的注射剂量的52%和18%，而在脑匀浆中分别回收了3.1%和1.0%。相反，对于PEG400-HPβCD制剂，这些值为7%(在血浆中)和2.8%(在脑匀浆中)。
总之，通过提高化合物B在PEG200和5%蔗糖的1:1混合物中的溶解度，由使用乙酸钙的主动装载机制制备了高度浓缩且稳定的脂质体制剂。这些脂质体制剂具有短的血液循环时间，但在注射之后不久与没有脂质体相比具有更高的血浆水平(Cmax)，并且脂质体制剂与已由PEG400-HPβCD制剂获得的高的脑水平相比，没有显著增加化合物B的脑部递送。例如通过降低乙酸钙缓冲剂浓度来增加脂质体的血浆稳定性会进一步增加化合物B向脑部的递送。
实施例4.不良溶解性化合物C的高主动脂质体装载
NMDA受体的血脑屏障可渗透激动剂(化合物C)具有低分子量，其在水中具有pH依赖性溶解度，所述溶解度在pH5下为0.003mg/mL，在pH6下为0.020mg/mL，在pH7下为0.35mg/mL，在pH8下为0.9mg/mL。在pH=7下，在HPβCD中，溶解度进一步增加至高达2.2mg/mL。
在5-60μg/ml的浓度下，在262nm使用UV测定化合物，或使用装备有C-18RP柱的HPLC***测定化合物。
将溶解的化合物以不同的药物与脂质的比(4:1、2:1、1:1、1:2、1:4)暴露于一系列实施例1所述的预制脂质体，以测定最优包封效率条件。
具体地，最优装载条件如下。在25℃下，将GSH-PEG-DSPE胶束(5%)溶解在250mM乙酸钙溶液中。向该溶液添加溶解于乙醇(在25℃)的DMPC(57%)和胆固醇(38%)，并通过经由过滤器的挤出直至获得约100nm的颗粒来制备脂质体。随后，通过渗析除去游离乙酸钙，并且在4℃贮存以供进一步使用。然后，制备在2w/w%HPβCD水溶液中的化合物C的2.2mg/mL溶液，并添加到预制脂质体(在25℃，持续60分钟)中，从而使化合物C与乙酸钙的钙交换，并在脂质体核内沉淀。之后，直接将已装载的脂质体在冰上冷却，并通过渗析除去HPβCD中过量的化合物C，并且在4℃贮存以供进一步使用。
包封效率为60-70%，并且最终产物在为1:2的药物与脂质比下具有含1mg/ml化合物C的脂质体。可以将该脂质体溶液能被浓缩3.5倍，从而提供甚至更浓的溶液。
将化合物以10mg/kg的剂量注入小鼠的尾静脉。用脂质体化合物或在HPβCD中配制的游离化合物来注射动物。在注射之后30分钟，在血浆中回收了脂质体化合物C的注射剂量的14%，在脑匀浆中回收了0.26%并且在脑脊液中(CSF)回收了0.09%。相反，对于化合物C的HPβCD制剂，这些值为6%(在血浆中)，0.08%(在脑匀浆中)和0.03%（在CSF中）。通过定量环鸟苷3′,5′-单磷酸(cGMP)水平的增加，在小鼠的小脑中生物化学地评价激动剂对NMDA受体的作用。在注射之后30分钟，化合物C的HPβCD制剂没有产生cGMP水平的变化，其中脂质体制剂产生了对照水平的160%的显著增加。
总之，通过提高化合物C在HPβCD中的溶解度，由使用乙酸钙梯度的主动装载机制制备了高度浓缩的脂质体制剂。尽管血浆半衰期较短，但该脂质体制剂显著地将化合物C的脑部和CSF递送增加至超过可在仅用配制在HPβCD中的最大耐受量的化合物C以相同剂量水平注射的小鼠中获得的水平的3倍，并且超过可用最大耐受量的浓脂质体制剂达到的水平的15倍。例如通过降低乙酸钙缓冲剂浓度来增加脂质体的血浆稳定性会进一步增加化合物C向脑部的递送。由该脂质体制剂获得的增加的脑部递送能在小脑中引起受体特异性作用，这用游离化合物是未观察到的。
实施例5.不良溶解性克唑替尼的高主动脂质体装载
具有450Da的低分子量的小分子酪氨酸激酶抑制剂(克唑替尼)在环境温度(约20℃)下的水溶解度<0.1mg/ml。在羟丙基β-环糊精(HPβCD)中的溶解度增加至2.2mg/ml，其中，在PEG200和烟酰胺中，在pH=7下溶解度增加到至少5mg/ml。
在5-60μg/ml的浓度下使用UV测定化合物，或使用装备有C-18 RP柱的HPLC***测定化合物。
将溶解的化合物以不同的药物与脂质的比(4:1、2:1、1:1、1:2、1:4)暴露于一系列实施例1所述的预制脂质体，以测定最优包封效率条件。
具体地，最优装载条件如下。在60℃下，将GSH-PEG-DSPE胶束(5%)溶解在2mg/mL硫酸铵溶液中。向该溶液添加溶解于乙醇(在60℃)的HSPC(55%)和胆固醇(40%)，并通过经由过滤器的挤出直至获得约100nm的颗粒来制备脂质体。随后，通过渗析除去游离硫酸铵，并且在4℃贮存以供进一步使用。然后，制备在20%HPβCD中的克唑替尼的2.2mg/mL溶液，并添加到预制脂质体(在60℃，持续60分钟)中，从而使克唑替尼与硫酸铵的铵交换，并在脂质体核内沉淀。之后，直接将装载的脂质体在冰上冷却，并通过渗析除去HPβCD中过量的克唑替尼，并且在4℃贮存以供进一步使用。与最优装载条件相对应的初始的药物与脂质比为1:4。
最优包封效率为60-70%，并且最终产物具有含1mg/ml克唑替尼且药物与脂质的比为1:5.7的脂质体。可以随后将该脂质体溶液浓缩2-3倍，以提供甚至更浓的溶液。
测试已装载的脂质体在50mM磷酸盐缓冲剂(pH7.4，5%蔗糖)中，在4℃和37℃下持续12天(2、4、6、24、48、120、288天)的体外渗漏。在测量之前，使用尺寸排阻色谱，将释放的化合物从溶液除去，并且用50%2-丙醇释放包封的化合物，并进行测量。从该分析测定的是，一些化合物从脂质体释放，在第一个24小时期间在两个温度下相似(约20%)，并且在24小时之后，该渗漏稳定。
从基于细胞的测定获知的是，酪氨酸激酶抑制剂通常为药物流出泵乳腺癌耐药蛋白(BCRP，还称为ABCG2)的底物，所以在野生型小鼠和BCRP敲除小鼠中测试制剂。将化合物以2.5mg/kg的剂量注入小鼠的尾静脉。用脂质体化合物或在HPβCD中配制的游离化合物来注射动物。在注射后6个小时，在血浆中回收了脂质体克唑替尼的注射剂量的52%，并且在野生型小鼠的脑匀浆中回收了0.5%。在BCRP敲除小鼠中，这些值分别为50%(在血浆中)和0.6%(在脑匀浆中)。相反，对于HPβCD制剂，在野生型动物中，这些值仅为0.01%(在血浆中)和0.03%(在脑匀浆中)，其中BCRP敲除小鼠在8小时之后，在脑匀浆中具有配制在HPβCD中的克唑替尼的注射剂量的0.23%，并且在血浆中，浓度低于检出水平。
总之，通过提高克唑替尼在HPβCD中的溶解度，由使用硫酸铵梯度的主动装载机制制备了高度浓缩且稳定的脂质体配制剂。该脂质体制剂提供克唑替尼的长血液循环时间，并且显著地使克唑替尼的脑部递送增加至超过可在仅用配制在HPβCD中的最大耐受量的克唑替尼注射的BCRP敲除小鼠中获得的水平的2倍，并且超过可在野生型小鼠中达到的水平的15倍。
实施例6.不良溶解性PD150606的高主动脂质体装载
提供钙蛋白酶抑制剂(PD150606)，其具有306Da的低分子量。在水中的溶解度低于0.05mg/ml，并且该化合物在碱性pH下分解。溶解度在PEG200中增加至高达8mg/ml。
在5-60μg/ml的浓度下用UV测定化合物。将溶解的化合物暴露于一系列实施例1所述的预制脂质体。具体地，制备具有良好包封效率的两种不同的组合物。首先，在60℃下，将GSH-PEG-DSPE胶束(5%)溶解在250mM乙酸钙溶液中。向该溶液添加溶解在乙醇(在60℃下)中的HSPC(55%)和胆固醇(40%)。其次，在25℃下，将GSH-PEG-DSPE胶束(5%)溶解在250mM乙酸钙溶液中。向该溶液添加溶解在乙醇(在25℃下)中的DMPC(55%)和胆固醇(40%)。对于两种组合物，通过经由过滤器的挤出直至获得约100nm的颗粒来制备脂质体。随后，通过渗析除去游离乙酸钙，并且在4℃贮存以供进一步使用。然后，制备在PEG200和5%蔗糖水溶液的(1:1vol/vol)-混合物中的化合物B的4mg/mL溶液，并以不同的药物与脂质的比添加至预制脂质体中(对于第一种组合物在60℃下，并且对于第二种组合物在25℃下，二者均持续60分钟)，从而使PD 150606与乙酸钙交换并在脂质体核内沉淀。之后，直接将已装载的脂质体在冰上冷却，并通过渗析除去PEG200/蔗糖混合物中过量的PD 150606，并且在4℃贮存以供进一步使用。
第一组合物的最优包封效率在1:3的初始的药物与脂质比下为60-70%。最终产物具有包含1.8mg/ml PD 150606且药物与脂质的比为1:4.5的脂质体。对于第二组合物，最优包封效率在1:3的初始的药物与脂质比下为25-30%的包封。最终产物具有包含2mg/ml PD 150606且药物与脂质的比为1:25的脂质体。可以将这些脂质体溶液浓缩2-3倍，从而提供甚至更浓的溶液。相反，溶解在纯PEG200和HPβCD中的PD 150606没有产生进入相同预制脂质体的主动装载，并且还没有产生在包含硫酸铵的预制脂质体中的主动装载。
测试已装载的脂质体在50mM磷酸盐缓冲剂(pH7.4，5%蔗糖)中，在4℃和37℃下，在制备之后的第1、3和7天的体外渗漏。在测量之前，使用尺寸排阻色谱，将释放的化合物从溶液除去，并且用50%2-丙醇释放包封的化合物，并进行测量。从该分析测定的是，两种配制剂在冷藏箱中至少稳定1周，并且对于第一组合物，在37℃下至少稳定1天。第二组合物在37℃下在1天之后失去了其大部分化合物。
将配制的化合物以2mg/kg的剂量注入小鼠的尾静脉。用脂质体化合物(组合物1和2)或在PEG400-HPβCD(10:90v/v)中配制的游离化合物来注射动物。然而，两种脂质体制剂具有出人意料地短的血浆半衰期。因此，在注射之后15分钟进行在制剂之间的分布差异的评估。在这些样品中，对于组合物1和2，在血浆中分别回收了脂质体PD 150606的注射剂量的52%和18%，而在脑匀浆中分别回收了3.1%和1.0%。相反，对于PEG400-HPβCD配制剂，这些值为7%(在血浆中)和2.8%(在脑匀浆中)。
总之，通过提高PD 150606在PEG200和5%蔗糖的1:1混合物中的溶解度，由使用乙酸钙的主动装载机制制备了高度浓缩且稳定的脂质体配制剂。这些脂质体配制剂具有短的血液循环时间，但在注射之后不久与没有脂质体相比具有更高的血浆水平(Cmax)，并且脂质体制剂与已由PEG400-HPβCD制剂获得的高的脑水平相比，没有显著增加PD 150606的脑部递送。例如通过降低乙酸钙缓冲剂浓度来增加脂质体的血浆稳定性会进一步增加PD150606向脑部的递送。
实施例7.不良溶解性的喹啉酸的高主动脂质体装载
NMDA受体的血脑屏障可渗透激动剂(喹啉酸)具有167Da的低分子量，其在水中具有pH依赖性溶解度，所述溶解度在pH5下为0.003mg/mL，在pH6下为0.020mg/mL，在pH7下为0.35mg/mL，在pH8下为0.9mg/mL。在pH=7下，在HPβCD中，溶解度进一步增加至高达2.2mg/mL。
在5-60μg/ml的浓度下，在262nm使用UV测定化合物，或使用装备有C-18RP柱的HPLC***测定化合物。
将溶解的化合物以不同的药物与脂质的比(4:1、2:1、1:1、1:2、1:4)暴露于一系列实施例1所述的预制脂质体，以测定最优包封效率条件。
具体地，最优装载条件如下。在25℃下，将GSH-PEG-DSPE胶束(5%)溶解在250mM乙酸钙溶液中。向该溶液添加溶解于乙醇(在25℃)的DMPC(57%)和胆固醇(38%)，并通过经由过滤器的挤出直至获得约100nm的颗粒来制备脂质体。随后，通过渗析除去游离乙酸钙，并且在4℃贮存以供进一步使用。然后，制备在2w/w%HPβCD水溶液中的喹啉酸的2.2mg/mL溶液，并添加到预制脂质体(在25℃，持续60分钟)中，从而使喹啉酸与乙酸钙的钙交换，并在脂质体核内沉淀。之后，直接将已装载的脂质体在冰上冷却，并通过渗析除去HPβCD中过量的喹啉酸，并且在4℃贮存以供进一步使用。
包封效率为60-70%，并且最终产物在为1:2的药物与脂质比下具有含1mg/ml喹啉酸的脂质体。可以将该脂质体溶液浓缩3.5倍，从而提供甚至更浓的溶液。
将化合物以10mg/kg的剂量注入小鼠的尾静脉。用脂质体化合物或在HPβCD中配制的游离化合物来注射动物。在注射之后30分钟，在血浆中回收了脂质体喹啉酸的注射剂量的14%，在脑匀浆中回收了0.26%并且在脑脊液(CSF)中回收了0.09%。相反，对于喹啉酸的HPβCD配制剂，这些值为6%(在血浆中)，0.08%(在脑匀浆中)和0.03%（在CSF中）。通过定量环鸟苷3′,5′-单磷酸(cGMP)水平的增加，在小鼠的小脑中生物化学地评价激动剂对NMDA受体的作用。在注射之后30分钟，喹啉酸的HPβCD制剂没有产生cGMP水平的变化，其中脂质体制剂产生了对照水平的160%的显著增加。
总之，通过提高喹啉酸在HPβCD中的溶解度，由使用乙酸钙梯度的主动装载机制制备了高度浓缩的脂质体制剂。尽管血浆半衰期较短，但该脂质体制剂显著地将喹啉酸的脑部和CSF递送增加至超过可在仅用配制在HPβCD中的最大耐受量的喹啉酸以相同剂量水平注射的小鼠中获得的水平3倍，并且超过可用最大耐受量的浓脂质体制剂达到的水平的15倍。例如通过降低乙酸钙缓冲剂浓度来增加脂质体的血浆稳定性会进一步增加喹啉酸向脑部的递送。由该脂质体制剂获得的增加的脑部递送能在小脑中引起受体特异性作用，这用游离化合物是未观察到的。
参考文献
D.Zucker等人,Journal of Controlled Release,2009 139 73-80
B.McCormack,G.Gregoriades,Journal of drug targeting,19942(5)449-454
B.McCormack,G.Gregoriades,Internationl Journal of Pharmaceutics,1998162 59-69
P.R.Cullis等人,Biochimica et Biophysica Acta 1997 1331 187-211
R.Challa等人,AAPS PharmSciTech20056(2)E329-E357
J.Gubernator等人,Journal of Controlled Release 2010 146 68-75
A.Fritze等人,Biochimica et Biophysica Acta 2006 1758 1633-1640
A.S.Taggar等人,Journal of Controlled Release 2006 114 78-88
B.C.L.Cheung等人,Biochimica et Biophysica Acta 1998 1414 205-216
D.B.Fenske等人,Biochimica et Biophysica Acta 1998 1414 188-204
D.O.Thompson,CRC Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.1997 14 1-104
B.W.Muller等人,Int.J.Pharm.1985 26 77-88
L.Szente等人,Adv.Drug Deliv.Rev.1999 36 17-38
S.Sweetana等人,PDA J.Pharm.Sci.Technol.1996 50 330-342
E.Rytting等人,The AAPS Journal 20057(1)E78-E105

Claims (33)

1.用不良水溶性物质装载脂质体的方法，所述不良水溶性物质在20℃和pH＝7下具有小于1.9mM的水溶解度，所述方法包括：
a)提供混合物，其包含：
i.包封内部含水介质的脂质体；
ii.所述不良水溶性物质；
iii.外部含水介质；以及
iv.增加所述不良水溶性物质在所述外部含水介质中的溶解度的溶解度增强剂；
其中存在跨所述脂质体膜的质子梯度和/或离子梯度；以及
b)孵育所述混合物，持续足以导致至少部分所述不良水溶性物质被提取出所述外部含水介质并在所述质子梯度和/或离子梯度的影响下在所述脂质体中蓄积的时间段。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述溶解度增强剂为络合剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述溶解度增强剂为选自环糊精及其衍生物、聚维酮以及它们的组合的络合剂。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述溶解度增强剂为共溶剂。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述溶解度增强剂为选自聚乙二醇、烟酰胺、脂族羧酸的N,N-二烷基酰胺、醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、吡咯烷酮以及它们的组合的助溶剂。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述溶解度增强剂为选自聚乙二醇、烟酰胺、脂族羧酸的N,N-二烷基酰胺、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、吡咯烷酮以及它们的组合的共溶剂。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述溶解度增强剂为表面活性剂或乳化剂。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述溶解度增强剂为选自聚乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯、PEG-脂质、泊洛沙姆、多库酯钠、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸、聚山梨酯、中链甘油三酯、甲基纤维素、糖以及它们的组合的表面活性剂或乳化剂。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述溶解度增强剂选为选自聚乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯、PEG-脂质、泊洛沙姆、多库酯钠、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸、聚山梨酯、中链甘油三酯、甲基纤维素以及它们的组合的表面活性剂或乳化剂。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述溶解度增强剂不为渗透所述脂质体膜的醇。
11.如权利要求1所述的方法，其中在孵育期间的加工温度为0-100℃。
12.如权利要求11所述的方法，其中在孵育期间的加工温度为0-70℃。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述不良水溶性物质在20℃和pH＝7下在水中的溶解度小于1mM。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述溶解度增强剂使所述不良水溶性物质在所述外部含水介质中的初始浓度增加到至少2倍，达到在20℃下至少为1.9mM的值。
15.如权利要求1所述的方法，其中在步骤b)期间，存在跨所述脂质体膜的pH梯度、硫酸盐梯度、磷酸盐梯度、柠檬酸盐梯度或乙酸盐梯度、EDTA-离子梯度、铵盐梯度、烷基化铵盐梯度、任选使用在所述脂质体膜中的离子载体的Mn2+-梯度、Cu2+-梯度、Na+-梯度、K+-梯度、或它们的组合。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述外部含水介质包含盐水和/或蔗糖和/或EDTA，并且所述内部含水介质包含不良水溶性物质，以及硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或乙酸盐、烷基化铵盐、Mn2+离子、Cu2+离子、Na+离子或K+离子中的至少之一。
17.如权利要求1的方法，其中所述不良水溶性物质包含可质子化胺、羧基官能团或二者。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述不良水溶性物质为选自类固醇、蒽环类、紫杉醇、雷帕霉素(西罗莫司)、双氯芬酸、阿霉素、布比卡因、长春新碱、环丙沙星、西替利嗪、非索非那定、扑米酮和其他儿茶酚胺类、肾上腺素、这些化合物的盐、以及它们的混合物的药用化合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述不良水溶性物质为选自类固醇、蒽环类、紫杉醇、雷帕霉素(西罗莫司)、双氯芬酸、克唑替尼、喹啉酸、PD 150606、布比卡因、长春新碱、环丙沙星、西替利嗪、非索非那定、扑米酮和其他儿茶酚胺类、肾上腺素、这些化合物的盐、以及它们的混合物的药用化合物。
20.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)包括孵育所述混合物，持续足以实现在步骤a)中向所述混合物添加的不良水溶性物质的总量的至少25％的装载的时间段。
21.如权利要求20所述的方法，其中步骤b)包括孵育所述混合物，持续足以实现在步骤a)中向所述混合物添加的不良水溶性物质的总量的至少50％的装载的时间段。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述溶解度增强剂在步骤b)期间不被转运穿过所述脂质体膜。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述溶解度增强剂不渗透所述脂质体膜。
24.溶解度增强剂用于在用不良水溶性物质主动装载脂质体的方法中改善装载效率的用途，所述不良水溶性物质在20℃和pH＝7下具有小于1.9mM的水溶解度。
25.如权利要求24所述的用途，其包括将所述溶解度增强剂与所述不良水溶性物质、第一含水介质和包封第二含水介质的脂质体组合。
26.脂质体组合物，其可通过权利要求1至23中任一权利要求所述的方法获得。
27.如权利要求26所述的脂质体组合物，其中所述脂质体包含的所述溶解度增强剂的量不超过所述不良水溶性物质的总量的10mol％。
28.脂质体组合物，其包含装载有不良水溶性物质的脂质体，所述不良水溶性物质在20℃和pH＝7下具有小于1.9mM的水溶解度，所述组合物的药物与脂质的重量比为至少1:25，所述组合物包含小于所述不良水溶性物质的总量的20mol％的溶解度增强剂。
29.如权利要求28所述的脂质体组合物，其药物与脂质的重量比为至少1:15。
30.如权利要求28所述的脂质体组合物，其药物与脂质的重量比为至少1:7。
31.如权利要求28所述的脂质体组合物，其药物与脂质的重量比为至少1:5。
32.如权利要求28所述的脂质体组合物，其药物与脂质的重量比为更至少1:2。
33.如权利要求28至32中任一权利要求所述的脂质体组合物，其中所述脂质体包含的所述溶解度增强剂的量不超过所述不良水溶性物质的总量的10mol％。
CN201280021180.0A 2011-03-01 2012-03-01 不良水溶性物质的高主动脂质体装载 Active CN103501766B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161447770P 2011-03-01 2011-03-01
US61/447,770 2011-03-01
NL2006324 2011-03-01
NL2006324 2011-03-01
PCT/NL2012/050123 WO2012118376A1 (en) 2011-03-01 2012-03-01 Advanced active liposomal loading of poorly water-soluble substances

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103501766A CN103501766A (zh) 2014-01-08
CN103501766B true CN103501766B (zh) 2016-08-17

Family

ID=44544834

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280021180.0A Active CN103501766B (zh) 2011-03-01 2012-03-01 不良水溶性物质的高主动脂质体装载

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20130337051A1 (zh)
EP (1) EP2680820B1 (zh)
JP (1) JP2014506922A (zh)
CN (1) CN103501766B (zh)
WO (1) WO2012118376A1 (zh)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9221867B2 (en) 2003-01-06 2015-12-29 Angiochem Inc. Method for transporting a compound across the blood-brain barrier
US9365634B2 (en) 2007-05-29 2016-06-14 Angiochem Inc. Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues
CA2721019C (en) 2008-04-18 2015-09-15 Angiochem Inc. Pharmaceutical compositions of paclitaxel, paclitaxel analogs or paclitaxel conjugates and related methods of preparation and use
EP2331092B1 (en) 2008-08-21 2014-03-19 The Johns Hopkins University Methods and compositions for administration of 3-halopyruvate and related compounds for the treatment of cancer
US8828925B2 (en) 2008-10-15 2014-09-09 Angiochem Inc. Etoposide and doxorubicin conjugates for drug delivery
MX2011004017A (es) 2008-10-15 2011-06-24 Angiochem Inc Conjugados de agonistas glp-1 y usos de los mismos.
CA2745524C (en) 2008-12-05 2020-06-09 Angiochem Inc. Conjugates of neurotensin or neurotensin analogs and uses thereof
JP2012512185A (ja) 2008-12-17 2012-05-31 アンジオケム インコーポレーテッド 膜１型マトリックス金属タンパク質阻害剤およびその使用
US9173891B2 (en) 2009-04-20 2015-11-03 Angiochem, Inc. Treatment of ovarian cancer using an anticancer agent conjugated to an angiopep-2 analog
IN2012DN00248A (zh) 2009-07-02 2015-05-01 Angiochem Inc
WO2014121235A2 (en) * 2013-02-01 2014-08-07 Zoneone Pharma, Inc. Transformation of drug cyclodextrin complex compositions into compositions of mixtures of lipid vesicle encapsulated drug and cyclodextrin drug complexes
FI3922241T3 (fi) 2013-02-01 2023-11-28 Celator Pharmaceuticals Inc Niukasti liukoisten lääkkeiden etälataus liposomeihin
AU2014340568B2 (en) * 2013-10-22 2017-02-02 Aradigm Corporation Inhaled surfactant-modified liposomal formulations providing both an immediate and sustained release profile
JP6247525B2 (ja) * 2013-12-24 2017-12-13 花王株式会社 難水溶性芳香族化合物含有組成物の製造方法
AU2015206628A1 (en) * 2014-01-14 2016-08-25 The Johns Hopkins University Liposome compositions encapsulating modified cyclodextrin complexes and uses thereof
JP6676035B2 (ja) * 2014-04-10 2020-04-08 イッサム リサーチ ディベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブライ ユニバーシティー オブ エルサレム リミテッドＹｉｓｓｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ Ｌｔｄ． リポソームムピロシン
CN106999419A (zh) * 2014-08-04 2017-08-01 佐尼奥尼制药股份有限公司 远程装载略微水溶性药物至脂质膜泡
WO2016025559A1 (en) * 2014-08-13 2016-02-18 Zoneone Pharma, Inc. Pharmaceutical formulations of and methods to prepare chelating agents for efficient metal removal treatment systems
EP3307326B9 (en) 2015-06-15 2021-02-24 Angiochem Inc. Methods for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis
US11260027B2 (en) 2015-07-29 2022-03-01 Musc Foundation For Research Development Donor organ pre-treatment formulation
US20170065520A1 (en) * 2015-09-09 2017-03-09 Manli International Ltd Stable liposomal formulations of rapamycin and rapamycin derivatives for treating cancer
WO2017079563A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 The Johns Hopkins University Methods of treating liver fibrosis by administering 3-bromopyruvate
CN110381929A (zh) 2016-06-13 2019-10-25 阿森迪亚制药有限责任公司 卡维地洛分散***的肠胃外缓释传递
CN106265519B (zh) * 2016-08-30 2019-03-29 上海交通大学 一种灯盏乙素苷元脂质体制剂及其制备方法
CA3040517A1 (en) * 2016-10-19 2018-04-26 Avive, Inc. Novel pegylated liposomal formulations of apelin for treatment of cardiovascular-related diseases
SI3532067T1 (sl) * 2016-10-28 2022-09-30 Les Laboratoires Servier Liposomska formulacija za uporabo v zdravljenju raka
CN107184553A (zh) * 2017-06-14 2017-09-22 天津佰力喜动物药业有限公司 一种替米考星脂质体分散剂的制备方法
WO2019082139A1 (en) * 2017-10-27 2019-05-02 Shilpa Medicare Limited LIPOSOMAL FINGOLIMOD HYDROCHLORIDE INJECTION
CN110496103B (zh) * 2018-05-18 2022-05-10 上海维洱生物医药科技有限公司 一种多西他赛棕榈酸酯脂质体及其制备方法
CN114832113B (zh) * 2022-03-22 2023-06-20 重庆医科大学 疏水药物-马来酰亚胺衍生物及其主动载药脂质体和应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL91664A (en) * 1988-09-28 1993-05-13 Yissum Res Dev Co Ammonium transmembrane gradient system for efficient loading of liposomes with amphipathic drugs and their controlled release
AU677216B2 (en) 1992-07-27 1997-04-17 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Targeting of liposomes to the blood-brain barrier
US5837282A (en) * 1996-10-30 1998-11-17 University Of British Columbia Ionophore-mediated liposome loading
WO2000023052A1 (en) * 1998-09-16 2000-04-27 Alza Corporation Liposome-entrapped topoisomerase inhibitors
DE60330745D1 (de) * 2002-12-31 2010-02-11 Bharat Serums & Vaccines Ltd Nicht-pegylierte lang-zirkulierende Liposome
JP2007500239A (ja) * 2003-05-30 2007-01-11 アルザ・コーポレーシヨン 薬剤の肺投与の方法
WO2005002546A1 (en) * 2003-06-27 2005-01-13 Smithkline Beecham Corporation Stabilized topotecan liposomal composition and methods
WO2006055903A1 (en) * 2004-11-18 2006-05-26 Celator Pharmaceuticals, Inc. Method for loading multiple agents into delivery vehicles
WO2006079216A1 (en) * 2005-01-28 2006-08-03 Bc Cancer Agency Liposomal compositions for parenteral delivery of agents
JP2006280389A (ja) * 2005-03-31 2006-10-19 Terumo Corp Ｄｄｓ製剤
WO2007005754A2 (en) 2005-07-01 2007-01-11 Alza Corporation Liposomal delivery vehicle for hydrophobic drugs
JP5080779B2 (ja) * 2006-10-25 2012-11-21 テルモ株式会社 リポソーム製剤の製造方法
US20090196918A1 (en) 2008-02-01 2009-08-06 University Of Kentucky Research Foundation Liposomal formulations of hydrophobic lactone drugs in the presence of metal ions
WO2010090991A1 (en) * 2009-02-04 2010-08-12 Supernus Pharmaceuticals, Inc. Formulations of desvenlafaxine
US9968583B2 (en) * 2009-03-30 2018-05-15 Eisai R & D Management Co., Ltd. Method of manufacture of liposome composition
JP6194248B2 (ja) * 2010-10-28 2017-09-06 パシラ ファーマシューティカルズ インコーポレーテッド 非ステロイド性抗炎症薬の徐放性処方物

Also Published As

Publication number Publication date
US20130337051A1 (en) 2013-12-19
CN103501766A (zh) 2014-01-08
JP2014506922A (ja) 2014-03-20
WO2012118376A1 (en) 2012-09-07
EP2680820A1 (en) 2014-01-08
EP2680820B1 (en) 2022-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103501766B (zh) 不良水溶性物质的高主动脂质体装载
KR102554628B1 (ko) 리포좀 내로 난수용성 약물의 원격 부하
Zhao et al. A simple way to enhance Doxil® therapy: drug release from liposomes at the tumor site by amphiphilic block copolymer
Tamam et al. Development of liposomal gemcitabine with high drug loading capacity
Jensen et al. Opportunities and challenges in commercial pharmaceutical liposome applications
US20140220112A1 (en) Transformation of drug cyclodextrin complex compositions into compositions of mixtures of lipid vesicle encapsulated drug and cyclodextrin drug complexes
US20140356414A1 (en) Targeted Crosslinked Multilamellar Liposomes
CA3098868A1 (en) Carotenoid compositions and uses thereof
WO1998034597A1 (en) Liposomes containing active agents
US20040022842A1 (en) Liposome preparations containing oxaliplatin
Yoshino et al. Comparative studies of irinotecan-loaded polyethylene glycol-modified liposomes prepared using different PEG-modification methods
CN106999419A (zh) 远程装载略微水溶性药物至脂质膜泡
JP2009519250A (ja) リポソーム組成物
Na et al. A solvent-assisted active loading technology to prepare gambogic acid and all-trans retinoic acid co-encapsulated liposomes for synergistic anticancer therapy
Zhang et al. Improving drug retention in liposomes by aging with the aid of glucose
Parmar et al. Inhalational system for etoposide liposomes: Formulation development and in vitro deposition
KR100996975B1 (ko) 혈류 내 순환시간 증가를 위한 단백질로 수식된 리포솜 및이의 제조방법
US10925831B2 (en) Liposomal formulations of platinum-acridine anticancer agents and methods thereof
PL226015B1 (pl) Liposomowy preparat zawierajacy przeciwnowotworowa substancje aktywna, sposob jego wytwarzania i zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna
Desu Targeted delivery of surface modified nanoparticles: modulation of inflammation for acute lung injury
WO2024081910A1 (en) Liposome compositions for delivery of compounds and methods thereof
TW202320803A (zh) 製備脂質體調配物之方法
Nallamothu Development and evaluation of a tumor vasculature targeted liposome delivery system for a novel anti-vascular agent, combretastatin A4

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20171024

Address after: Leiden

Patentee after: 2-BBB medical Limited by Share Ltd

Address before: Leiden

Patentee before: TO BBB Holding B V

TR01 Transfer of patent right