CN103499572A - 一种增强型化学发光试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强型化学发光试剂，由溶液A和溶液B组成，所述溶液A包括鲁米诺或鲁米诺衍生物8～15mmol/L，氢氧化钠1～5mmol/L，4-[1H-1,2,4-三氮唑-1-基甲基]苯胺盐酸盐0.1～1.5mmol/L，1-萘硼酸0.1～0.8mmol/L，0.1mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.5～10；所述溶液B包括双氧水5～10mmol/L，谷氨酸体积分数0.01%～0.05%，0.1mol/LTris-HCl缓冲液pH7.5～10，其可以显著改善鲁米诺化学发光体系的发光强度与发光持续时间。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种用于化学发光免疫检测的增强型化学发光试剂。
背景技术
化学发光免疫分析是（CLIA）是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。化学发光免疫分析具有灵敏度高、简便快速、线性稳定、安全无害等特点。
鲁米诺（Luminol)、异鲁米诺（Isoluminol）及其衍生物是最早在化学发光法中使用的化学发光物质。鲁米诺化学名3-氨基邻苯二甲酰胼，最早由Albrecht报道其发光特性。这类物质通过氧化产生α-羟基过氧化物的中间体，该中间体的分解可释放出光能，所发光的性质与反应***的pH值有关。鲁米诺类化合物的氧化步骤与溶剂组分有关，在非质子溶剂中，化学发光只需要氧气和一种强碱；在质子溶剂中，需要酶来催化各种氧的衍生物氧化鲁米诺。鲁米诺体系的发光效率并不高，标记后发光强度会随时间降低，而通过对非杂环进行化学修饰可以提高部分发光强度。
化学发光酶免疫分析技术常用的两种标记体系是辣根过氧化物酶（HRP)和碱性磷酸酶（AP)。AP酶发光体系的底物价格昂贵，限制了它的应用，而HRP酶体系具有高转换系数、对不同灵敏度分析***具有通用性而受到广泛应用。HRP酶体系最常用的发光底物是鲁米诺、 异鲁米诺及其衍生物。不过，如果不使用增强剂，鲁米诺体系的发光为闪光型、强度弱、持续时间短。
上世纪八十年代中后期，科研人员逐渐发现了可以大大增强酶催化鲁米诺化学发光体系发光强度的物质，即增强剂，其可以明显增强发光强度，延长发光时间，提高信噪比及灵敏度。与不含增强剂的体系相比，加入增强剂后组成的鲁米诺体系的发光强度可提高1000倍，发光时间延长至几个小时，使原来的瞬时发光变为了持续发光，这些重大改进使得该体系在基因、免疫分析领域得到广泛应用。
目前市场上的发光底物稳定性不够、灵敏度有待改善、和/或使用成本较高，限制了化学发光免疫检测的应用。因此为适应科学研究及市场的实际需求，有必要开发新的配方，以提供研究者与使用者更多的选择。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足及实际需求，提供一种新的性质稳定、成本低的增强型化学发光试剂，用于增强现有鲁米诺-过氧化物化学发光体系的发光强度，延长该化学发光体系的发光持续时间，为化学发光酶免疫检测技术的发光体系提供一种新的选择。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种增强型化学发光试剂，由溶液A和溶液B组成，其特征在于，
所述溶液A包括：
鲁米诺或鲁米诺衍生物，8～15 mmol/L
氢氧化钠，1～5 mmol/L
4-[1H-1,2,4-三氮唑-1-基甲基]苯胺盐酸盐 0.1～1.5 mmol/L
1-萘硼酸，0.1～0.8 mmol/L
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5～10；
所述溶液B包括：
双氧水，5～10mmol/L
谷氨酸，体积分数0.01%～0.05%
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5～10。
在一种优选实施方案中，所述增强型化学发光试剂，由溶液A和溶液B组成，其特征在于，
所述溶液A包括：
鲁米诺或鲁米诺衍生物，10 mmol/L
氢氧化钠，3 mmol/L
4-[1H-1,2,4-三氮唑-1-基甲基]苯胺盐酸盐，1.0 mmol/L
1-萘硼酸，0.5 mmol/L
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.5；
所述溶液B包括：
双氧水：浓度为5mmol/L
谷氨酸，体积分数0.03%
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液 pH 8.5。
所述鲁米诺衍生物可以是鲁米诺钠盐、异鲁米诺或4-氨基已基-N-乙基异鲁诺等。使用时，将溶液A和溶液B以等体积混合，构成增强型化学发光试剂。
本发明采用4-[1H-1,2,4-三氮唑-1-基甲基]苯胺盐酸盐，1-萘硼酸和Tri-HCl缓冲溶液组成的化学发光增强体系，显著改善鲁米诺-过氧化氢化学发光强度、同时显著延长化学发光的持续时间，广泛用于以化学发光为检测手段的化学、生物、免疫等检测分析产品中， 提高化学发光检测技术的灵敏度及稳定性。
具体实施方式
以下结合附图并通过具体的实施例对本发明作进一步描述。以下实施例不应视为对本发明保护范围的限定。实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
实施例1：增强型化学发光试剂的配制
溶液A：
鲁米诺，10 mmol/L
氢氧化钠，3 mmol/L
4-[1H-1,2,4-三氮唑-1-基甲基]苯胺盐酸盐，1.0 mmol/L
1-萘硼酸，0.5mmol/L
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.5；
溶液B：
双氧水，5 mmol/L
谷氨酸，体积分数0.03%
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.5。
将上述溶液等体积混合，即为本发明的增强型化学发光试剂。
检测结果：与基础发光液（A液：鲁米诺，10 mmol/L，氢氧化钠，3 mmol/L，0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.5；B液：双氧水，5 mmol/L，0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.5，等体积混合）相比，在分别加入辣根过氧化物酶5pg之后，本发明的增强型化学发光试剂有效增强了鲁米诺-过氧化氢化学发光体系的发光强度（RLU）、延长了其发光持续时间，在2-200min时间内基本保持了发光强度的稳定性，结果如表1所示：
表1：
| 时间（min） | RLU基础发光液 | RLU增强型化学发光试剂 |
| 2 | 157 | 47536 |
| 6 | 178 | 49987 |
| 10 | 205 | 53624 |
| 20 | 198 | 47858 |
| 30 | 185 | 42586 |
| 50 | 170 | 37859 |
| 70 | 154 | 33217 |
| 100 | 139 | 31058 |
| 150 | 118 | 29854 |
| 200 | 109 | 24893 |
实施例2：增强型化学发光试剂的配制
溶液A：
鲁米诺单钠盐，8mmol/L
氢氧化钠，1mmol/L
4-[1H-1,2,4-三氮唑-1-基甲基]苯胺盐酸盐，0.2 mmol/L
1-萘硼酸，0.1mmol/L
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5；
溶液B：
双氧水，3mmol/L
谷氨酸，体积分数0.01%
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5。
将上述溶液等体积混合，即为本发明的增强型化学发光试剂。
检测结果：与基础发光液（A液：鲁米诺单钠盐，8mmol/L，氢氧化钠，1 mmol/L，0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5；B液：双氧水，3 mmol/L，0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5，等体积混合）相比，在分别加入辣根过氧化物酶5pg之后，本发明的增强型化学发光试剂有效增强了鲁米诺-过氧化氢化学发光体系的发光强度、延长了其发光持续时间，在2-200min时间内基本保持了发光强度的稳定性，结果如表2所示：
表2：
| 时间（min） | RLU基础发光液 | RLU增强型化学发光试剂 |
| 2 | 131 | 26653 |
| 6 | 159 | 29798 |
| 10 | 180 | 35462 |
| 20 | 170 | 31854 |
| 30 | 159 | 28582 |
| 50 | 132 | 25754 |
| 70 | 124 | 22202 |
| 100 | 114 | 18587 |
| 150 | 105 | 15854 |
| 200 | 95 | 12587 |
实施例3：增强型化学发光试剂的配制
溶液A：
鲁米诺，15 mmol/L
氢氧化钠，5 mmol/L
4-[1H-1,2,4-三氮唑-1-基甲基]苯胺盐酸盐，1.5 mmol/L
1-萘硼酸，0.8mmol/L
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.0；
溶液B：
双氧水，10mmol/L
谷氨酸，体积分数0.05%
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.0。
将上述溶液等体积混合，即为本发明的增强型化学发光试剂。
检测结果：与基础发光液（A液：鲁米诺，15mmol/L，氢氧化钠，5 mmol/L，0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.0；B液：双氧水，10 mmol/L，0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.0，等体积混合）相比，在分别加入辣根过氧化物酶10pg之后，本发明的增强型化学发光试剂有效增强了鲁米诺-过氧化氢化学发光体系的发光强度、延长了其发光持续时间，在2-200min时间内基本保持了发光强度的稳定性，结果如表2所示：
表3：
| 时间（min） | RLU基础发光液 | RLU增强型化学发光试剂 |
| 2 | 167 | 57639 |
| 6 | 185 | 60917 |
| 10 | 215 | 57658 |
| 20 | 201 | 50897 |
| 30 | 195 | 47589 |
| 50 | 178 | 42639 |
| 70 | 164 | 38654 |
| 100 | 142 | 36548 |
| 150 | 124 | 32857 |
| 200 | 119 | 28965 |
Claims (4)
1.一种增强型化学发光试剂，由溶液A和溶液B组成，其特征在于，
所述溶液A包括：
鲁米诺或鲁米诺衍生物，8～15 mmol/L
氢氧化钠，1～5 mmol/L
4-[1H-1,2,4-三氮唑-1-基甲基]苯胺盐酸盐 0.1～1.5 mmol/L
1-萘硼酸，0.1～0.8 mmol/L
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5～10；
所述溶液B包括：
双氧水，5～10mmol/L
谷氨酸，体积分数0.01%～0.05%
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5～10。
2.如权利要求1所述的增强型化学发光试剂，其特征在于，
所述溶液A包括：
鲁米诺或鲁米诺衍生物，10 mmol/L
氢氧化钠，3 mmol/L
4-[1H-1,2,4-三氮唑-1-基甲基]苯胺盐酸盐，1.0 mmol/L
1-萘硼酸，0.5mmol/L
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.5；
所述溶液B包括：
双氧水，5 mmol/L
谷氨酸，体积分数0.03%
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 8.5。
3.如权利要求1或2所述的增强型化学发光试剂，其中所述鲁米诺衍生物为鲁米诺钠盐、异鲁米诺或4-氨基已基-N-乙基异鲁诺。
4.如权利要求1或2所述的增强型化学发光试剂，其中使用时溶液A与溶液B等体积混合。
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