CN103497948A - 与大白菜PHYB基因启动子等位变异类型phyB1/B2紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与大白菜PHYB基因启动子等位变异类型phyB1/B2紧密连锁的分子标记：与phyB1检测相关的标记命名为ASM-phyB1，片段大小762bp，如SEQ ID No.1所示；与phyB2检测相关的标记命名为ASM-phyB2，片段大小317bp，如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了一种用于检测该分子标记的引物，序列如SEQ ID NO.3、4所示。本发明还公开了该分子标记和引物在选择含有ASM-phyB1或ASM-phyB2的突变类型的大白菜种质材料或转育后代中的应用，该应用可大大简化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。

Description

与大白菜PHYB基因启动子等位变异类型phyB1/B2紧密连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一对与大白菜抽薹时间紧密连锁的分子标记，尤其涉及一对基于光受体基因PHYB启动子区域突变的分子标记及其应用，该标记为选育含相应类型耐抽苔大白菜材料和新品种提供辅助选择的工具，可以提高选择效率，属于生物技术领域。

背景技术

大白菜(Brassica rapa L.ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物，原产于中国，在世界各地尤其是东南亚广泛种植。目前，已经育成了适合春、夏、秋不同季节栽培的大白菜新品种，使得大白菜实现了周年供应，对保证蔬菜市场供应、稳定物价起到了积极的作用。

在不同季节栽培的大白菜品种中，春白菜对品种耐抽苔性的要求最高，主要是因为春白菜栽培季节面临前期环境低温和后期环境高温双重压力的影响。如果春白菜品种的耐抽苔能力不强，则前期低温极易使幼苗通过春化，导致后期叶球内短缩茎较长、甚或已经抽薹，从而影响产品的商品价值和品质。所以，春白菜育种的关键是拥有极耐抽薹的育种材料以及获得与耐抽苔特性紧密连锁的分子标记，以提高春白菜的育种效率。

目前，已经有与大白菜抽薹开花相关的分子标记报道【卓祖闯.大白菜耐抽薹性状遗传规律分析及其分子标记的筛选.西北农林科技大学硕士学位论文；郁有健.大白菜抽薹开花相关基因SNP分析与晚抽苔开花性状QTL定位.东北农业大学硕士学位论文；高颖,罗双霞,王彦华,顾爱侠,赵建军,陈雪平,申书兴.大白菜抽薹开花时间与SSR和InDel标记的关联分析.园艺学报.2012,39(6):1081-1089】，但所得到的标记要么是数量性状位点，要么连锁程度不够紧密，很难用于育种辅助选择。因此，有必要寻找基于抽薹开花途径相关基因突变的位点特异性分子标记，以提高选择的精准度。

大白菜与模式植物拟南芥亲缘关系较近，同属于芸薹属，因此拟南芥抽薹开花机制研究的有关结果可以为大白菜相关研究提供借鉴。对模式植物拟南芥的研究结果表明：植物开花受四条途径控制，即自主途径、赤霉素途径、春花途径和光周期途径。四条途径并非彼此相互独立，而是通过一些整合基因形成一个复杂的调控网络，协同控制拟南芥的开花【徐雷,贾飞飞，王利琳.拟南芥开花诱导途径分子机制研究进展.西北植物学报.2011,31(5):1057-1065】。在光周期控制的开花途径中，起关键作用的是光受体及其介导的信号传导，拟南芥基因组中的光受体有3类，即光敏色素、隐花色素和向光色素，其中光敏色素和隐花色素参与光周期调节的植物开花【赵淑清,罗志鹏,李昱.拟南芥光周期调控开花的研究进展.山西大学学报(自然科学版).2009,32(2):308-314】。在拟南芥基因组中有两个隐花色素(CRY1和CRY2)和五个光敏色素(从PHYA到PHYE)，CRY1有促进开花的作用，cry1突变体在短日照下推迟开花【Mockler TC,Guo H,Yang H,Duong H,Lin C..Antagonistic actions ofArabidopsis cryptochromes and phytochrome B in the regulation of floral induction.Development.1999,126(10):2073-2082.】；CRY2在长日照下促进开花,cry2基因突变或过量表达均能导致对光周期的敏感性下降[Guo H,Yang H,Mockler TC,Lin C.Regulation of flowering time by Arabidopsis photoreceptors.Science.1998,27;279(5355):1360-1363]。光敏色素中PHYA和PHYB在接收光信号中发挥重要作用【MengChen and Joanne Chory.Phytochrome signaling mechanisms and the control of plantdevelopment.Trends Cell Biol.2011,21(11):664–671】。PHYA在黑暗和远红光条件下积累而在红光下迅速降解，它在拟南芥中具有促进开花的作用，该基因突变导致植株晚开花；PHYB则在红光下相对稳定，在长日照和短日照条件下均有抑制开花的作用，phyB单基因突变体在长日照和短日照条件下均比野生型明显提早开花【Goto N,Kumagai T,Koornneef M.Flowering responses to light-breaks in photomorphogenic mutants of Arabidopsisthaliana,a long-day plant.Plant Physiol.1991,83:209-215】。由此可见，植物体内的光受体决定了光周期的信号传导，从而决定植物在感受光信号后的发育状态。

大白菜全基因测序工作已经完成【Wang et al.,2011，the genome of the mesopolyploidcrop species Brassicarapa.Nature Genetics.43(10):1035-103)】，通过与拟南芥全基因比较，其相关功能基因的预测和注释也已完成并制作成数据库【Cheng F,Liu S,Wu J,FangL,Sun S,Liu B,Li P,Hua W,Wang X.BRAD,the genetics and genomics database forBrassica plants.BMC Plant Biol.2011,11:136】，其中对开花基因的注释有专门的检索菜单。在大白菜基因组中，CRY1有两个拷贝、分别位于A08和A10染色体上；CRY2是单拷贝、位于A09上；PHYA是双拷贝、位于A06和A09上；PHYB则是单拷贝、位于A05上。没有发现PHYC-PHYE的同源基因。

我国有适合不同季节栽培的大白菜种质资源，其抽薹开花性状差异较大，其中不乏长、短日照条件下开花时间存在显著差异的材料，但至今未见有关光受体突变与开花时间有关的报道。鉴于在模式植物拟南芥中发现的光受体对抽薹开花时间影响的相关结果，推测在大白菜中也存在光受体控制的晚开花突变体资源，因此，有必要对我国丰富的大白菜资源在CRY1、CRY2、PHYA和PHYB位点进行筛查，以发现各位点可能存在的突变类型；同时针对突变位点与野生型的序列差异，开发与突变体检测有关的位点特异性分子标记。有以下几个方面的潜在益处：①可以将该标记用于筛查大白菜种群，提高晚开花大白菜资源的检测效率；②当其他位点发现突变类型时，可以采用同样的方法开发标记；③当多个位点的突变位于不同的材料中时，可以通过标记辅助选择手段将多位点突变聚合在一起，创造极耐抽薹的大白菜新种质；④在培育耐抽苔大白菜新品种时，可以实现标记辅助选择，提高育种效率。由于这种标记直接位于功能基因内部，因此选择的准确率达100%。

发明内容

针对上述现有技术，针对目前大白菜在光受体基因位点突变体鉴定方面的空白，本发明首先获得了PHYB基因启动子区域发生突变的两种等位变异基因phyB1和phyB2，与BRAD数据库中大白菜基因组序列相比，phyB1仅有数个SNP和单碱基InDels的差异，而phyB2除了有SNP和小片段InDel差异外，还存在较大片段的缺失。其次根据等位变异基因在较大片段缺失部位两侧的保守区域设计引物，开发了区分两种突变体的ASM共显性标记并用于标记辅助选择。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种与大白菜PHYB基因启动子等位变异类型phyB1/B2紧密连锁的分子标记（区分大白菜PHYB基因启动子区域较大片段缺失突变的共显性ASM标记）：与phyB1检测相关的标记命名为ASM-phyB1，片段大小762bp，如SEQ ID No.1所示；与phyB2检测相关的标记命名为ASM-phyB2，片段大小317bp，如SEQ ID No.2所示。

用于鉴别上述位点特异性共显性分子标记的引物是：

正向引物PF：5'-CTCATCCATCCCTACGACCTT-3'；

反向引物PR1：5'-TGTGGATGGTTGTGAGTTAGGTAT-3'；

如SEQ ID NO.3、4所示。

本发明采用同源克隆技术从两份开花时间存在显著差异的大白菜自交系材料He102(长、短日照下开花早)和06-247(长、短日照下开花晚)中分别克隆到了PHYB基因上游约1.5kb区域内(启动子区域)的一段DNA序列，将来自两份材料的DNA片段与BRAD数据库中的相应序列进行比对发现：来自晚开花材料06-247的DNA片段与BRAD数据库中的序列同源性高达99%以上，仅有6个SNP和5个单碱基***缺失的差异，我们称此种突变类型为phyB1，而来自极易开花材料He102中的序列则在上游存在较大片段的缺失，称其为phyB2。在缺失部位两侧的保守区域设计引物，开发了区分两种等位变异的共显性标记。为了验证该标记的可用性，我们用设计的引物扩增了He102和06-247构建的F2群体，结果表明该标记对纯合phyB1、phyB2以及杂合型鉴别的准确率达100%。

所述ASM标记的筛选过程如下：

(1)以长/短日照下大白菜早花自交系He102与晚花自交系06-247为材料，采用CTAB法，提取两者的基因组DNA。

(2)在BRAD数据库中查找PHYB基因所在的物理位置，下载上游2kb区域的DNA序列，设计引物对各自基因组DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行测序，得到了各自启动子区域的部分DNA序列。

(3)将两者所得序列进一步与已知序列进行比对发现，06-247(晚花表型)与BRAD数据库中的序列同源性高达99%，仅有几处SNP和单碱基InDels差异，称为phyB1；He102(早花表型)的序列与已知序列相比，除了多处SNPs、小片段InDels外，还有一处大片段InDels突变，称为phyB2。

(4)启动子区域控制着基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，有很多顺式作用元件。在植物顺式作用元件数据库(Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements，简称PLACE，http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)中分析发现，缺失区域包含多处Myb类转录因子的结合元件或Myb核心序列，推测该区域与Myb类转录因子调控PHYB基因的表达有关。

(5)在缺失部位两侧保守区域设计引物，开发了能区分两种等位变异的共显性标记。该引物组合在phyB1基因型中能扩出762bp的条带，命名为ASM-phyB1，在phyB2基因型中，能扩出317bp的条带，命名为ASM-phyB2。如果能够扩出两条带，则该材料是杂合型。

所述分子标记可以作为分子标记应用于大白菜种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有ASM-phyB1或ASM-phyB2的突变类型的种质材料或转育后代。具体应用方式为：利用ASM标记的一套引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段大小，如果扩增出762bp的条带，则为晚抽薹类型；扩出317bp的条带，则为早抽薹类型；如果同时扩出762bp和317bp的两条带，则为杂合型。对于杂合型个体应视情况而定：如果杂合型材料是一份资源，则表明该资源在次位点不纯，需要继续自交分离，直至在其后代中获得纯合ASM-phyB1晚抽苔类型；如果是回交转育后代，则继续选择杂合型个体为母本，用纯合ASM-phyB1晚抽苔类型的花粉给其授粉，经过6～8代转育后，最后再自交一次，即可将早抽薹类型的材料改造成晚抽苔类型。如果扩不出条带，可能是基因组DNA提取的不纯或该材料在此位点发生了其它类型的突变。

本发明的有益效果是：由于大白菜光敏色素受体PHYB基因的表达受启动子序列的影响，启动子一般位于转录起始位点上游2kb的范围内。本发明通过扩增起始密码上游约1.5kb的序列，发现了两种PHYB基因启动子等位变异突变体phyB1和phyB2，二者在5’段存在较大片段的***/缺失差异。根据缺失区域两侧保守序列设计一对引物，通过PCR扩增，在琼脂糖凝胶上就能很容易地区分两种突变类型。该标记不仅可用于对大白菜种质资源进行筛查，以寻找遗传背景更加丰富的突变体材料，还可以用于对杂交后代进行标记辅助选择，以转育晚花性状。

本发明优点具体如下：

1.本发明获得的与PHYB基因两种等位变异突变体直接相关的标记，结果准确、稳定、操作简便。适用于不同遗传背景大白菜材料的筛选，是一个普遍性标记。它能够准确鉴定大白菜种质资源在该位点的基因型，极大地提高了大白菜种质资源在PHYB位点等位变异的鉴定效率。

2.在大白菜PHYB基因序列及突变体研究方面，国内外未见相关报道。本发明鉴定了两种PHYB基因启动子区域的等位变异突变类型，其中与晚花有关变异类型的标记可以为培育耐抽苔大白菜提供辅助选择的工具，同时也可以用于大白菜种质资源鉴定。本发明的应用可大大简化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。

附图说明

图1：特异引物在06-247和He102中的扩增结果，M为DNA分子量标准DL5000。

图2：来自06-247的序列与BRAD数据库中Chiifu-401的PHYB基因同源序列的比对结果。

图3：来自He102的序列与BRAD数据库中Chiifu-401的PHYB基因同源序列的比对结果。

图4：来自06-247(phyB1)和He102(phyB2)的序列的比对结果(二者不仅在5'端有445bp的大片段***/缺失差异，在3'端还有较多小的***/缺失差异和SNPs差异)。

图5：ASM标记的开发即标记所述引物在He102和06-247中的扩增结果，其中M是DNA分子量标准DL2000。

图6：ASM标记的应用－对He102×06-247构建的F2群体部分单株的检测结果，其中P1和P2分别是双亲He102和06-247，1-16是16个F2单株。图中单株2、3、4、7、15是亲本P1即He102中等位变异类型phyB2，单株5、9、11、12、13、16是亲本P2即06-247中的等位变异类型phyB1，其余单株是杂合型；M是DNA分子量标准DL2000。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、不同大白菜自交系材料中PHYB基因启动子序列的克隆

1.1大白菜基因组DNA提取

（1）将大白菜幼苗叶片放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

（2）待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入0.6ml预热至65℃的CTAB提取液，融化后，剧烈振荡混匀样品，65℃水浴放置40-60分钟使细胞裂解；

（3）裂解结束后，取出样品使其完全冷却至室温。加入等体积的氯仿(chloroform)，轻轻颠倒使混匀，室温放置10分钟；

（4）室温，12000rpm离心15分钟；

（5）用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(按1:1体积比例)，充分混匀，室温沉淀10min；

（6）在4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

（7）DNA沉淀用1ml的75%乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

（8）重复用75%乙醇洗涤一次DNA沉淀；

（9）去上清，DNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，DNA略显透明，加入适当体积（30-50μl）的10mM的Tris.HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐），pH8.0使沉淀溶解(可放于4℃冰箱溶解过夜)；

（10）紫外分光光度计及1% Agrose（琼脂糖）凝胶电泳检测DNA浓度及质量。

1.2PHYB基因启动子序列的克隆及序列分析

(1)检索BRAD数据库中注释为PHYB的基因所在的染色体物理位置并下载起起始密码上游2kb的序列。设计上、下游引物：

正向引物PF：5'CTCATCCATCCCTACGACCTT3'

反向引物PR2：5'GTGAGCTTTTATAGATATTATGCT3'，委托华大基因有限公司合成。

引物序列如SEQ ID NO.3和5所示。

(2)PCR扩增：在20μl反应体系中，包含1×TransStart FastPfu buffer；20ng的基因组DNA；0.4μM正反向引物；0.25mM dNTPmix;1个标准单位的TransStart FastPfu DNA聚合酶(TransGen AP221)。PCR循环条件：95℃预变性5分钟;接着是95℃变性30秒，57.5℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35-38个循环，最后72℃延伸10分钟。

(3)PCR产物的电泳检测：

PCR结束后，取10μlPCR扩增产物加入1μl10×loading buffer，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后EB染色，自动凝胶成像***观察拍照。结果如图1。

(4)PCR产物的克隆测序

电泳确认目的条带被扩增后，取1μlPCR扩增产物加1μl pEasy-Blunt(TransGen CB101)载体室温连接10分钟，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(TransGen：CD501)，转化菌在含Kan50μg/ml的LB固体平板上37℃倒置培养16小时左右。菌落PCR检测后挑取阳性克隆委托北京华大基因有限公司进行DNA序列的测定。

(5)所克隆的大白菜PHYB基因启动子序列分析及命名

BRAD数据库中(Chiifu-401)PHYB基因启动子区域上述两引物之间的已知序列长度是1464bp，而06-247的所得序列长度为1469bp，序列如Seq ID No.6所示，有五处SNPs和5个InDels，如图2所示；He102的所得序列仅有1026bp，序列如Seq ID No.7所示，除了多处SNPs和小的InDels外，5'端有445bp的一个大片段缺失，如图3所示。因为启动子是完整基因的组成部分，启动子发生突变也是基因突变的一种类型，所以我们把06-247的PHYB基因启动子的突变类型称为phyB1(小写是基因突变的标识，序号1是突变类项编号)、把He102的相关序列称为phyB2，它们都是PHYB的等位变异类型。phyB1和phyB2的比对发现，除了二者在5'端有445bp的一个大片段缺失外，在3'端还有很大差异（图4所示）。

(5)缺失部位生物信息学分析

因为启动子区域是基因转录调控的核心区域，有很多顺式作用元件[张春晓,王文棋,蒋湘宁,陈雪梅.植物基因启动子研究进展.遗传学报，2004,31(12):1455～1464]，在PLACE(Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements，简称PLACE，http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)数据库中，收集了已经报到的所有植物基因顺式作用元件。我们将所得的phyB1和phyB2序列在该数据库中检索，发现了众多的顺式作用元件，其中缺失区域是Myb类转录因子结合元件或Myb核心序列，推测该区域与Myb类转录因子调控PHYB基因的表达有关。鉴于此，有必要开发鉴别缺失区域的共显性分子标记，以便于用标记辅助选择的手段对晚花表型进行选择，这可以用于大白菜新的育种材料创制和新品种选育过程。

实施例2共显性ASM标记的开发

2.1引物设计

仔细比较PHYB基因两种等位变异phyB1和phyB2的基因组序列，其差异主要5'端445bp的一个大片段缺失（如图3所示）。正向引物采用扩增启动子的引物PF，在缺失的大片段下游(3'端)保守区域设计了一个反向引物PR1，序列Seq ID No.4，委托华大基因有限公司合成。

2.2ASM标记的获得

(1)以He102和06-247的基因组DNA为模板，采用普通taq酶进行一次PCR扩增PCR循环参数为：95℃预变性5分钟;接着是95℃变性20秒，58.5℃退火20秒，72℃延伸40秒，35-38个循环，最后72℃延伸5分钟。

(2)扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测、EB染色后照相，结果如图5所示。从图中可以看出，引物PF和PR1从具有phyB1类型的06-247(晚花表型)中扩出762bp的条带，从具有phyB2类型的He102(早花表型)中扩出了317bp的条带。此即共显性ASM标记。前者称为ASM-phyB1，如SEQ ID No.1所示；后者称为ASM-phyB2，如SEQ ID No.2所示。

实施例3ASM标记对He102×06-247构建的F2群体的检测。

(1)F2群体不同单株基因组DNA提取如1.1所述。

(2)PCR扩增：PCR反应液的配制及扩增条件如2.2第(1)条所述。

(3)PCR产物的检测如2.2第(2)条所述。检测结果如图6所示：P1和P2分别是双亲He102和06-247，1-16是16个F2单株。图中单株2、3、4、7、15是亲本P1即He102中等位变异类型phyB2，单株5、9、11、12、13、16是亲本P2即06-247中的等位变异类型phyB1，其余单株是杂合型。M是DNA分子量标准DL2000。从扩增结果可以看出这对引物能够100%鉴定纯合野生型、纯合突变体，完全可以用于种质资源的筛选和育种辅助选择。

Claims (6)

1.一种与大白菜PHYB基因启动子等位变异类型phyB1/B2紧密连锁的分子标记，其特征在于：与phyB1检测相关的标记命名为ASM-phyB1，片段大小762bp，如SEQ ID No.1所示；与phyB2检测相关的标记命名为ASM-phyB2，片段大小317bp，如SEQ ID No.2所示。

2.一种用于鉴别权利要求1所述的分子标记的引物，其特征在于：序列如下：

正向引物PF：5'-CTCATCCATCCCTACGACCTT-3'；

反向引物PR1：5'-TGTGGATGGTTGTGAGTTAGGTAT-3'；

如SEQ ID NO.3、4所示。

3.权利要求1所述的分子标记在选择含有ASM-phyB1或ASM-phyB2的突变类型的大白菜种质材料或转育后代中的应用。

4.权利要求2所述的引物在选择含有ASM-phyB1或ASM-phyB2的突变类型的大白菜种质材料或转育后代中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：具体应用方式为：利用权利要求2的引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段大小，如果扩增出762bp的条带，则为晚抽薹类型；扩出317bp的条带，则为早抽薹类型；如果同时扩出762bp和317bp的两条带，则为杂合型。

6.根据权利要求3或4或5所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增具体为：在20μl反应体系中，包含1×TransStart FastPfubuffer；20ng的基因组DNA；0.4μM正反向引物；0.25mM dNTPmix;1个标准单位的TransStart FastPfu DNA聚合酶(TransGenAP221)；

PCR循环条件：95℃预变性5分钟;接着是95℃变性30秒，57.5℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35-38个循环，最后72℃延伸10分钟。

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