CN103494800A

CN103494800A - 原花青素b2在制备抗氧化损伤和抑制细胞凋亡药物中的应用

Info

Publication number: CN103494800A
Application number: CN201310489251.6A
Authority: CN
Inventors: 黄翠; 关东博; 韩林; 杜习金
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2014-01-08

Abstract

本发明公开了原花青素B2在制备抗氧化损伤和抑制细胞凋亡药物中的应用。本发明采用UVB作用于HaCaT细胞，建立细胞损伤模型，研究了原花青素B2对UVB致HaCaT细胞损伤的保护作用，并研究了原花青素B2的抗氧化作用及抗凋亡作用，发现原花青素B2能够提高UVB致细胞损伤的细胞存活率，有效的抗氧化损伤，减少活性氧的生成，明显减少细胞凋亡从而具有保护皮肤细胞的作用，对于UVB所致皮肤氧化损伤具有显著的治疗功效。这些结果表明原花青素B2可用于制备抗氧化损伤、抑制细胞凋亡和治疗紫外线致皮肤氧化损伤药物，是一个具有良好开发前景的化合物。

Description

原花青素B2在制备抗氧化损伤和抑制细胞凋亡药物中的应用

技术领域

本发明涉及原花青素B2的医药用途，具体涉及原花青素B2在制备抗氧化损伤和抑制细胞凋亡药物中的应用。

背景技术

紫外线是皮肤损伤最主要的有害环境因素，按其波长可分为长波紫外线（UVA，320-400nm）、中波紫外线（UVB，280-320nm）和短波紫外线（UVC，200-280nm）。其中，几乎全部的UVC被大气平流层中的臭氧吸收，对机体产生作用的主要是UVA和UVB。研究表明，UVB是引起皮肤损伤的重要原因，是对皮肤产生光化学反应的最活跃的部分，其能量大于UVA，相同剂量UVB对皮肤的损伤约比UVA大800-1000倍。被UVB照射部位皮肤血管扩张，皮肤可出现红肿、水泡等症状。长久照射皮肤会出现红斑、炎症、皮肤老化，严重者可引起皮肤癌。氧化损伤是UVB所致皮肤损伤的重要机制。其中，活性氧（ROS）起着关键性的作用。UVB可以导致皮肤中的ROS过量产生，大量的ROS引起氧化应激反应及生物大分子（如蛋白质、脂肪、核酸等）的氧化损伤。机体受到UVB的有害刺激，体内产生大量的ROS，氧化***与抗氧化***失衡，氧化程度超出氧化物的清除，反应倾向于氧化过程，发生氧化应激反应，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。此外，ROS产生过多导致不饱和脂肪酸的过氧化，生成α、β-不饱和醛类如4-羟基壬烯醛和丙二醛，这些乙醇脂质过氧化的二次产物通常被认为是氧化应激的标志物；蛋白质与ROS反应后，激发氨基酸自由基转移，蛋白质氨酰基变成自由基后，自由基会沿着变性蛋白质上的氨基酸继续转移，诱发蛋白变性；UVB所致DNA损伤除了与ROS生成过多有关外，DNA分子还可以直接吸收UVB光子，造成DNA的直接损伤效应。由此可见，过量ROS的产生是UVB致皮肤损伤的关键因素。严重的氧化应激和生物大分子的氧化损伤可直接造成细胞的凋亡。UVB作用于细胞引起一系列信号转导通路活化，产生生长因子或细胞因子刺激反应。已证明ROS可以引起多种生长因子受体和细胞因子受体的活化，例如表皮生长因子受体（EGFR）、成纤维细胞生长因子受体（FGFR）、TNF-α、IR-1等。其中EGFR的激活在众多信号通路中其关键作用，EGFR是一个180kDa的跨膜信号蛋白，与配体结合形成同源或异源二聚体，使得特异性酪氨酸残端磷酸化，再形成信号传导复合体，目前认为ROS导致此过程的发生。细胞表面细胞因子和生长因子受体的活化导致相应细胞内信号蛋白的募集，从而介导级联信号转导，引起MAPKs、PI-3激酶和NF-κB通路等信号通路的活化，引起一系列炎症反应、免疫反应和细胞凋亡。

综上所述，ROS所致细胞的氧化损伤是UVB致皮肤光老化的一个重要机制。ROS通过以上几种反应导致光老化的发生发展。

原花青素类化合物，是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是高效的辅助因子，是目前国际上公认的、活性最强的、清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂、自由基清除剂，具有非常强的体内活性。原花青素主要分布于以下的植物中：葡萄、英国山楂、单子山楂、花生、银杏、日本的罗汉柏、北美的崖柏、土耳其的侧柏、花旗松、白烨树、野生刺葵、番荔枝、野草萄、日本莽草、扁桃、高粱、耳叶番泻、两谷椰子、可可豆、贯叶金丝桃、头状胡枝子、粘胶乳香树、海岸松、洋萎陵菜和大黄等。实验证明，原花青素类化合物的抗自由基氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍，并且吸收迅速完全，代谢半衰期达7小时之久。原花青素广泛存在于植物中，按其聚合度可分为原花青素单体（主要是儿茶素和表儿茶素）、低聚原花青素（单体的二、三、四聚体）和高聚原花青素（五聚体以上）。最基本的原花青素单体为儿茶素和表儿茶素，这两种单体聚合形成寡聚体和多聚体。二聚体在各类原花青素中分布最广，抗氧化活性最强。二聚体因2个单位的构象或缩合键位不同，有多种异构体。其中，原花青素B2由表儿茶素聚合而成，分子小而灵活，易于吸收，活性最强。其结构如下：

迄今为止，未有原花青素B2具有抗UVB所致皮肤细胞氧化损伤作用和治疗皮肤光老化的有关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供原花青素B2的新的医药用途，其可用于制备抗氧化损伤、抑制细胞凋亡和治疗紫外线致皮肤氧化损伤药物。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明从抗光老化损伤的角度出发，采用UVB作用于HaCaT细胞，建立细胞损伤模型，研究原花青素B2对UVB致HaCaT细胞损伤的保护作用。结果发现，原花青素B2能够提高UVB致细胞损伤的细胞存活率，有效的抗氧化损伤。针对细胞损伤模型进一步深入研究了ROS水平变化及细胞凋亡情况，发现原花青素B2能够减少ROS的生成，明显减少细胞凋亡从而具有保护皮肤细胞的作用，对于UVB所致皮肤氧化损伤具有显著的治疗功效。

原花青素B2在制备抗氧化损伤药物中的应用。

一种抗氧化损伤药物，包含原花青素B2。

原花青素B2在制备抑制细胞凋亡药物中的应用。

一种抑制细胞凋亡药物，包含原花青素B2。

原花青素B2在制备治疗紫外线致皮肤氧化损伤药物中的应用；所述的紫外线为中波紫外线。

一种治疗紫外线致皮肤氧化损伤药物，包含原花青素B2。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：本发明首次发现了原花青素B2能够有效的抗氧化损伤，减少活性氧的生成，明显减少细胞凋亡从而具有保护皮肤细胞的作用，对于UVB所致皮肤氧化损伤具有显著的治疗功效，是一个具有良好开发前景的化合物。

附图说明

图1是细胞存活实验检测原花青素B2对UVB致HaCaT细胞损伤的保护作用结果图。

图2是利用DCFH-DA检测原花青素B2的抗氧化作用结果图。

图3是AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测原花青素B2的抗凋亡作用结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1通过细胞存活实验测定原花青素B2对UVB致HaCaT细胞损伤的保护作用

HaCaT细胞购自南京凯基生物，细胞培养用DMEM培养基中含有10%（v/v）胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL庆大霉素，细胞于5%CO₂，37℃进行培养。分组为对照组（未经原花青素B2和UVB处理）、照射组（照射组进一步分组为分别用0、6.25、12.5、25、50μΜ原花青素B2处理组）。取对数生长期HaCaT细胞，以5000每孔密度的密度铺入96孔板，每孔100μL。每组样本设3个复孔，于5%CO₂，37℃培养24h，照射组加入不同浓度原花青素B2预处理1h，然后UVB处理，剂量为50mJ/cm²，继续培养24h后，加入MTT（5mg/mL）后培养4h，吸弃含MTT的培养基，150μL DMSO溶解结晶产物，使用酶标仪在570nm波长测量吸光度值。

细胞存活率（%）=照射组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

统计学处理

实验数据采用SPSS19.0软件进行统计，组间数据采用ANOVA进行分析，实验结果以均值±方差表示，P<0.05为统计学有显著性差异。

UVB照射细胞建立细胞紫外损伤模型，筛选原花青素B2有效浓度，结果如图1所示：HaCaT细胞经UVB照射后24h，照射组细胞存活率较对照组显著降低；而用原花青素B2预处理细胞1h，可以逆转UVB导致的细胞存活率下降。当原花青素B2浓度大于12.5μΜ时对UVB致HaCaT细胞有明显的保护作用，其细胞存活率显著高于未用原花青素B2（0μΜ）预处理的照射组（P<0.05，*表示与对照组有显著差异，#表示与未用原花青素B2（0μΜ）预处理的照射组有显著差异）。

实施例2通过实验证实原花青素B2的抗氧化作用

UVB照射后立即测定细胞内ROS水平，2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA）是检测ROS的特异性荧光探针，DCFH-DA具有脂溶性，它可以穿越细胞膜并与细胞内的酯酶反应生成DCFH。因后者不能穿过细胞膜，可使荧光探针装载在细胞内，并被细胞内的ROS氧化成具有荧光的DCF。利用DCFH-DA可以检测细胞内ROS水平变化。分组情况为：对照组（未经原花青素B2和UVB处理）、原花青素B2组（未经UVB处理）、UVB照射组（未加原花青素B2）、原花青素B2+UVB组。将对数生长期的HaCaT细胞以1×10⁶每孔密度接种于6孔板，于5%CO₂，37℃培养24h，25μΜ原花青素B2预处理1小时后用10μΜ的DCFH-DA探针孵育细胞20分钟，PBS（pH7.4）洗涤3遍，然后UVB照射，剂量为50mJ/cm²，胰酶消化收集细胞。流式细胞仪测定荧光强度，激发光波长为488nm，发射光波长530nm。结果如图2所示，UVB照射后细胞ROS水平显著增高，为对照组5倍；利用原花青素B2预处理细胞，ROS水平显著降低，为对照组2.5倍，相较于UVB照射组，ROS水平显著降低（P<0.05，*表示与对照组有显著差异，#表示与UVB照射组有显著差异）。

实施例3通过实验证明原花青素B2的抗凋亡作用

采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。实验分组同实施例2，UVB照射后HaCaT细胞继续培养24h，胰酶消化收集细胞，PBS（pH7.4）洗涤2次后加入400μL Bingding Buffer（上海贝博生物）悬浮细胞；加入5μL AnnexinⅤ-FITC混匀后，加入5μL PI，混匀；室温避光反应15分钟，流式细胞仪检测凋亡细胞百分率。PI用氢离子激发荧光，激发波长为488nm，发射波长大于630nm，产生红色荧光。结果如图3所示，细胞经UVB照射后相较于对照组细胞凋亡率显著增高，细胞凋亡率增至46.37%；而原花青素B2预处理1h相对于UVB照射组能够显著的减少细胞凋亡率，细胞凋亡率下降至28.7%，表明原花青素B2具有显著的抗细胞凋亡作用（P<0.05，*表示与对照组有显著差异，#表示与UVB照射组有显著差异）

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.原花青素B2在制备抗氧化损伤药物中的应用。

2.一种抗氧化损伤药物，其特征在于：包含原花青素B2。

3.原花青素B2在制备抑制细胞凋亡药物中的应用。

4.一种抑制细胞凋亡药物，其特征在于：包含原花青素B2。

5.原花青素B2在制备治疗紫外线致皮肤氧化损伤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的紫外线为中波紫外线。

7.一种治疗紫外线致皮肤氧化损伤药物，其特征在于：包含原花青素B2。