CN103487575A - 细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法，属于化学发光酶联免疫检测技术领域。该检测试剂盒采用间接竞争法，试剂盒包括包被有细交链孢菌酮酸抗原的化学发光酶标板，细交链孢菌酮酸标准品，细交链孢菌酮酸抗体，酶标抗抗体，化学发光液和洗涤液。该试剂盒的使用方法包括如下步骤：（1）待测样品的前处理；（2）顺序加入细交链孢菌酮酸标准品溶液或样品、细交链孢菌酮酸抗体，竞争反应后加入酶标抗抗体，最后加入化学发光液通过化学发光免疫分析仪进行细交链孢菌酮酸的定量检测；（3）结果处理与分析。本发明提供的检测试剂盒灵敏度高、稳定性好，适合大量样品的筛查，具有重要的实际应用推广意义。

Description

细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及一种细交链孢菌酮酸的检测方法，更具体地，涉及一种细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法。
背景技术
细交链孢菌酮酸（Tenuazonic acid，TeA）是由链格孢菌、稻瘟病菌等产生的一种毒性代谢物，结构见图1。它是一种无色粘性液体，易溶于甲醇、乙醇、二甲亚砜等有机溶剂，而在氯仿、苯、丙酮中溶解度小，具有抗肿瘤、抗病毒、抗细菌以及杀虫等生物活性。同时，细交链孢菌酮酸也是污染农业食品、饲料等自然污染物之一，广泛存在于谷物、蔬菜、水果以及田间作物，是毒性最高的链格孢菌毒素，长期食用累积可引起慢性中毒，导致哺乳动物胃肠道大面积出血及循环衰竭以至死亡等。食用被细交链孢菌酮酸污染的食物能引起真菌毒素中毒现象，对食品安全带来一定的隐患。
    TeA已在世界各地的番茄、小麦、葵花籽等食品中均频繁检出。可见，食品中TeA污染的普遍性已对食品安全带来隐患。目前检测TeA主要采用气相色谱法（GC）、液相色谱法（HPLC）、薄层层析法（TLC）及同位素薄弱化分析（SIDA）等。TLC是最初检测细交链孢菌酮酸常用的方法，操作简单，但准确度和灵敏度较差。仪器分析法的灵敏度和准确度高，但设备投资大，操作技术要求高，前处理繁琐，检测成本高，难以满足现场的、大批量样品的快速检测，不易推广；而且，由于TeA在化学性质上表现为强酸性，且易与金属发生螯合，已建立的仪器检测方法均存在一定缺陷。ELISA方法虽具有特异性强、快速、灵敏等优点，也适宜大批量样品的筛查，但其灵敏度有一定的制约。近年来，化学发光免疫分析（CLIA）以其独特的优势，在农业、医药和食品安全检测领域有很大的应用前景。化学发光免疫分析（CLIA）是化学发光和免疫分析结合的产物,将发光物质直接标记到抗原或抗体上，与抗体或抗原发生特异性免疫反应后，通过测定标记物的化学发光强度确定被测抗体或抗原的含量。具有灵敏度高、分析速度快、检测范围宽等优点，是免疫分析的重要发展方向。 
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒。
    本发明的另一目的在于提供上述细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法。
    本发明提供一种细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒，，所述检测试剂盒包括包被有细交链孢菌酮酸抗原的化学发光酶标板、细交链孢菌酮酸标准品、细交链孢菌酮酸抗体、酶标抗抗体、化学发光液和洗涤液。
所述的化学发光酶标板为96孔可拆不透明白色发光板，所述的细交链孢菌酮酸抗原为TeAHGA与OVA的偶联物，所述的细交链孢菌酮酸抗原的包被浓度为0.3μg/L。包被TeAHGA-OVA的包被液优选为将1.69g碳酸钠和 2.95g碳酸氢钠溶于1L双蒸水中得到，TeAHGA-OVA的包被浓度为0.3μg/L；封闭液优选为取0.1g BSA（牛血清白蛋白）、5g甘氨酸溶于100mL PBS（0.01mol/L pH7.4）溶液得到。
其中TeAHGA是采用水合肼和乙醛酸依次对细交链孢菌酮酸(Tenuazonic acid,TeA)进行衍生化,设计合成了含有氮杂共轭双键偶联手臂,可增强免疫效果的半抗原TeAHGA.
    所述的细交链孢菌酮酸标准品的浓度为1mg/mL。使用时用0.01 mol/L PBS（配方为 NaH2PO4·12H2O 2.9g、NaCl 8.5g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g，定容至1L）将标准品稀释成浓度为0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L的一系列细交链孢菌酮酸标准品溶液。
    所述的细交链孢菌酮酸抗体为细交链孢菌酮酸多克隆抗体，其原浓度为1mg/mL。使用时优选为0.01 mol/L PBST（配方为 NaH2PO4·12H2O 2.9g、NaCl 8.5g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Tween-20 0.5mL，定容至1L）稀释32000倍。
    所述的酶标抗抗体为辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG，其原浓度为10mg/mL。使用时优选为0.01 mol/L PBST 稀释5000倍。
    所述化学发光液由底物液和底物缓冲液组成，底物液为将20mg对碘苯酚、8mg鲁米诺、1.21gTris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至8.4得到底物缓冲液为将体积分数0.40% H2O2、1.21gTris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至7.0得到；所述化学发光液为底物液和底物缓冲液按体积比1: 1的比例混合。
     所述的洗涤液为含有体积浓度0.5% Tween-20的pH7.4 0.4mol/L的磷酸盐缓冲液。
    根据需求再提供一种上述的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，
    S1. 将试剂盒置于15～35℃平衡30 min以上；将所述的细交链孢菌酮酸标准品溶液稀释成一系列的浓度梯度；
    S2. 取出化学发光酶标板，往标准孔中加入不同浓度的细交链孢菌酮酸标准品溶液，样品孔中加入待测样品，然后每孔加入细交链孢菌酮酸抗体，盖上盖板膜振摇混匀，孵育；
    S3. 吸除板孔中的反应液，加入洗涤液洗涤，将酶标板拍干；
    S4. 往各孔中加入酶标抗抗体，轻拍混匀，孵育；
    S5. 每孔加入化学发光液，轻拍混匀，盖上盖板膜，1～2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU；
    S6. 检测结果计算与分析，即得样品中细交链孢菌酮酸的含量。
    再同一种优选的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，
    S1. 将试剂盒置于室温平衡30 min以上，用0.01 mol/L PBS将细交链孢菌酮酸标准品稀释成浓度分别为0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L的细交链孢菌酮酸标准品溶液；
    S2. 取出化学发光酶标板，在标准孔加入50 μL不同浓度的细交链孢菌酮酸标准品溶液，样品孔加入50 μL待测样品，使用0.01 mol/L PBST将细交链孢菌酮酸单克隆抗体稀释32000倍，然后每孔加入50μL稀释好的细交链孢菌酮酸单克隆抗体，盖上盖板膜置于37℃ 孵育30 min；
    S3. 吸除板孔中的反应液，各孔加入洗涤液约300μL，静置20秒左右，除去其中液体，如此共洗5次，最后一次将板拍干；也可用自动洗板机洗板5次，洗完后将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体；
    S4. 使用0.01 mol/L PBS将辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG酶标抗抗体稀释5000倍，往各孔中加入100 μL稀释好的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG酶标抗抗体，轻拍混匀后，置于37℃ 孵育20 min；
    S5. 每孔加入 100μL 底物液与底物缓冲液等体积混合后的化学发光液，轻拍混匀，盖上盖板膜，1～2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU，保存数据；
S6. 检测结果计算与分析，即得样品中细交链孢菌酮酸的含量。
    所述的待测样品为液番茄或液面粉，其处理方法如下：
    液番茄：称取1g已匀浆的番茄样品于离心管中，除空白组外其它组直接添加2.5，10和20ng/g浓度水平的TeA，煮沸，使维生素C失活；加入2mL×2氯仿振荡萃取，以4000r/min离心10min，有机相加入10μL 98%水合肼，振荡反应30min后，减压蒸干溶剂，残余物用1mL PBS复溶，稀释一倍后，以4000r/min离心10min，吸取上清液进行检测。
液面粉：称取1g面粉样品于离心管中，除空白组外其它组直接添加2.5，10和20ng/g浓度水平的TeA，然后加入5mL蒸馏水混匀，加入2mL×2氯仿振荡萃取，以4000r/min离心10min，有机相加入10μL 98%水合肼，振荡反应30min后，减压蒸干溶剂，残余物用1mL PBS复溶，稀释一倍后，以4000r/min离心10min，吸取上清液进行检测。
本发明的所得到的试剂盒的优点在于，
1. 所述的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒最大检测范围为 0.0069～1.1766 ng/mL，灵敏度0.09 ng/mL，检出限0.0016 ng/mL。
2. 环保经济：与ELISA试剂盒相比，不需要使用具有腐蚀性的硫酸、以及大部分有毒或含致癌物质的底物，更加经济环保。
3. 高精密度、高稳定性：采用包被抗原进行酶标板的包被，相对于抗体包被，更有利于达到较好的包被效果与较长的保存时间，从而提高了试剂盒检测的精密度与稳定性。
4. 高灵敏度、高特异性：与ELISA试剂盒相比，克服了试剂盒检测过程中易受到内源性酶干扰以及多种外在因素的影响的弊端，本发明检测细交链孢菌酮酸的化学发光酶免疫试剂盒灵敏度高，可达到0.09 ng/mL。
5. 快速、准确：前处理方法简单快速、符合试剂盒的快速、准确的检测要求。
6. 本发明的试剂盒保存时间长。
附图说明
图1是细交链孢菌酮酸标准曲线图。
具体实施方式
     下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所使用试剂如下：
包被液：将1.69g碳酸钠和 2.95g碳酸氢钠溶于1L双蒸水中得到。
20倍浓缩洗涤液：体积分数0.5% Tween-20的pH7.4 0.4mol/L的磷酸盐缓冲液，使用时用去离子水稀释成1倍。
封闭液：取0.1g BSA（牛血清白蛋白）、5g甘氨酸溶于100mL PBS溶液（0.01mol/L pH7.4）得到。
细交链孢菌酮酸标准溶液：用细交链孢菌酮酸标准品（1mg/mL）用0.01 mol/L PBS稀释为浓度分别为0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L的细交链孢菌酮酸标准品溶液，4℃保存。
化学发光液：化学发光液由底物液和底物缓冲液组成，底物液为将20mg对碘苯酚、8mg鲁米诺、1.21gTris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至8.4得到；底物缓冲液为将体积分数0.40%H2O2、1.21gTris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至7.0得到；使用时将底物液和底物缓冲液按体积比1: 1的比例混合。
细交链孢菌酮酸多克隆抗体（1mg/mL）：实验室前期制备。
辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG（10mg/mL）：购自武汉博士得生物工程有限公司。 
实施例1细交链孢菌酮酸多克隆抗体、包被抗原的制备
    （1）包被抗原的制备
采用活泼酯法制备包被原TeAHGA-OVA。
（2）细交链孢菌酮酸多克隆抗体的制备
以免疫原TeAHGA-BSA作为免疫原分别免疫3 只兔子，先进行基础免疫，免疫剂量为1 mg/kg体重。免疫抗原用生理盐水稀释后，加等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，采用背部皮下多点免疫，3周后加强免疫，免疫剂量为1.5mg/kg，改用弗氏不完全佐剂，此后每两周加强免疫1次。从第3次加强免疫开始，免疫后第8 d耳静脉取血，采用间接竞争ELISA法测定效价。取得较高效价后用半抗原直接在大腿肌肉注射，8 d后颈动脉采全血，分离抗血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，制成冻干粉后于- 20℃保存备用。
实施例2 化学发光酶免疫方法的建立
（1）包被抗原与抗体浓度的优选
1）将包被抗原按0.1 μg/L、0.2 μg/L、0.3 μg/L、0.4μg/L、0.6 μg/L用包被液（0.05 mol/L pH 5.0碳酸盐缓冲液）稀释并纵向包被不透明白色发光板，100 μL/孔，37℃ 24 h，用洗液洗涤2次，在吸水纸上拍干。
2）加入配制好的封闭液150 μL /孔进行封闭，37℃过夜，甩干后放入烘箱烘干。
3）加入50 μL /孔用0.01 mol/L PBS稀释的细交链孢菌酮酸标准品系列溶液
4）加入50 μL /孔用0.01 mol/L PBST系列稀释的细交链孢菌酮酸单克隆抗体（1: 28000、1: 30000、1: 32000、1: 34000、1: 36000），37℃ 30min，洗板5次，在吸水纸上拍干。
5）加入100 μL /孔已稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG，37℃ 20 min，用洗液洗板5次，在吸水纸上拍干。
6）加入现配的化学发光反应液，100 μL /孔，用化学发光免疫分析仪测定发光值。以发光值随包被抗原浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。得到包被抗原最佳浓度为0.3μg/L，抗体（浓度1 mg/mL）稀释倍数为1: 32000。
    （2）抗体灵敏度的测定
以包被抗原浓度为0.3μg/L，细交链孢菌酮酸多克隆抗体（浓度1mg/mL）稀释倍数为1:32000，进行抗体灵敏度的测定。
1）取96孔不透明白色发光板，将包被抗原用包被液稀释至0.3μg/L，每孔内加入100 μL，37℃过夜，用洗涤液洗涤2次，在吸水纸上拍干。
2）加入封闭液150μL /孔进行封闭，37℃过夜，甩干后放入烘箱烘干。
3）加稀释倍数为1:32000的细交链孢菌酮酸多克隆抗体50 μL/孔与不同浓度的细交链孢菌酮酸溶液50μL/孔于相应孔内，37℃ 30min，洗板5次，在吸水纸上拍干。
4）加入100 μL/孔稀释度为1: 5000的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG，37℃ 20 min，洗板5次，在吸水纸上拍干。
5）加入现配的化学发光反应液，100 μL/孔，测定发光值。
检测结果以抑制率计算，抑制率（%）=B/B0×100（%），B是不同浓度标准溶液竞争的发光值，B0是不加标准品的发光值。计算50%抑制率时标准品的浓度即为细交链孢菌酮酸多克隆抗体的灵敏度，为0.09ng/mL。 
实施例3 细交链孢菌酮酸化学发光酶联免疫检测试剂盒
（1）试剂盒的组成
1）包被有细交链孢菌酮酸抗原的化学发光酶标板：酶标板为96孔可拆不透明白色发光板，已包被细交链孢菌酮酸抗原和封闭液；细交链孢菌酮酸抗原为TeAHGA与卵清蛋白（OVA）的偶联物，包被浓度为0.3μg/L。
酶标板的制备：取96孔可拆不透明白色发光板，包被抗原用包被液稀释至0.3μg/L，每孔内加入100μL，37℃过夜，倾去孔内液体，洗涤液洗涤2次，在吸水纸上拍干。然后每孔加入封闭液150μL，37℃孵育过夜，倾去孔内液体，置于37℃烘箱中烘干后用铝箔袋真空密封4℃保存。
2）细交链孢菌酮酸系列标准品溶液（浓度0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L）。
3）细交链孢菌酮酸多克隆抗体1mg/mL，其工作浓度为1: 32000。 
4）辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG 10mg/mL：其工作浓度为1: 5000。 
5）化学发光液：由底物液和底物缓冲液组成。
6）20倍浓缩洗涤液。
（2）试剂分装：将各试剂测定合格后无菌分装，稀释好的细交链孢菌酮酸标准品l mL/瓶，已稀释的细交链孢菌酮酸多克隆抗体7mL/瓶，已稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG 7mL/瓶，底物液 7mL/瓶，底物缓冲液 7mL/瓶，20倍浓缩洗涤液50mL/瓶。分装后贴标签，注明批号和有效期，4℃保存。
（3）试剂盒的组装：分别将步骤（1）的包被有细交链孢菌酮酸抗原的化学发光酶标板1块和细交链孢菌酮酸标准品、细交链孢菌酮酸多克隆抗体、辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG、底物液、底物缓冲液、20倍浓缩洗涤液各1瓶及使用说明书1份置试剂盒内指定位置，试剂盒检验合格后封装，4℃保存。
实施例4 细交链孢菌酮酸化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法
（1）样品前处理 
1）番茄：称取1g已匀浆的番茄样品于离心管中，除空白组外其它组直接添加2.5，10和20ng/g浓度水平的TeA，煮沸，使维生素C失活；加入2mL×2氯仿振荡萃取，以4000r/min离心10min，有机相加入10μL 98%水合肼，振荡反应30min后，减压蒸干溶剂，残余物用1mL PBS复溶，稀释一倍后，以4000r/min离心10min，吸取上清液进行检测。
2）面粉：称取1g面粉样品于离心管中，除空白组外其它组直接添加2.5，10和20ng/g浓度水平的TeA，然后加入5mL蒸馏水混匀，加入2mL×2氯仿振荡萃取，以4000r/min离心10min，有机相加入10μL 98%水合肼，振荡反应30min后，减压蒸干溶剂，残余物用1mL PBS复溶，稀释一倍后，以4000r/min离心10min，吸取上清液进行检测。
（2）试剂盒的检测方法
1）取出试剂盒，置于室温（20～24℃）平衡30 min以上，取出化学发光酶标板，用0.01 mol/L PBS将细交链孢菌酮酸标准品稀释成一系列不同浓度的细交链孢菌酮酸标准品溶液（0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L）。
2）在标准孔加入50 μL不同浓度的细交链孢菌酮酸标准品溶液，样品孔加入50 μL待测样品，然后每孔加入50μL 用0.01 mol/L PBST稀释好的细交链孢菌酮酸多克隆抗体，盖上盖板膜置于37℃ 孵育30 min。
3）吸除板孔中的反应液，各孔加入洗涤液约300μL，静置20秒左右，除去其中液体，如此共洗5次，最后一次将板拍干；也可用自动洗板机洗板5次。洗完后将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每轮洗板拍打3次）以保证完全除去孔中的液体。
4）在酶标板中加入100 μL稀释好的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG，轻拍混匀后，置于37℃ 孵育20 min。
5）每孔加入 100 μL底物缓冲液与底物液等体积混合后的化学发光反应液，轻拍混匀，盖上盖板膜，1～2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU，保存数据。
（3）检测结果计算与分析
抑制率（%）=B/B0×100（%）
式中：B—不同浓度标准溶液孔（或样品孔）的发光值；B0—0浓度标准溶液发光值。
以抑制率为纵坐标，细交链孢菌酮酸标准品溶液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而确定样品中细交链孢菌酮酸的含量。
实施例5 试剂盒精密度与准确度试验
（1）细交链孢菌酮酸标准品溶液的重复性试验
从3批按照实施例3中的方法制备的酶标板中，各抽出20个微孔，按照实施例4中试剂盒的检测方法测定 0.1 μg/L细交链孢菌酮酸标准溶液的发光值，重复20次，计算变异系数CV%，结果见表1。
表1细交链孢菌酮酸标准溶液重复性试验
Figure 2013103919494100002DEST_PATH_IMAGE001
（2）样本重复性与准确度试验
准确度是指测得值与真值的符合程度，在酶联免疫测定中，准确度常以回收率表示，精密度常以变异系数来表示。在空白番茄或面粉样品中，添加细交链孢菌酮酸至终浓度为20、10、2.5μg/L，每个浓度各10个平行，测定3批。计算平均值、添加回收率及批内与批间变异系数。结果见表2。
Figure 2013103919494100002DEST_PATH_IMAGE002
Figure 2013103919494100002DEST_PATH_IMAGE003
表2样本重复性与准确度试验结果
Figure 2013103919494100002DEST_PATH_IMAGE004
结果表明番茄、面粉样本的添加回收率在86.4～112%之间，批内变异系数在3.2～8.7%之间，批间变异系数在6.2～10.4%之间，符合国家对于试剂盒各项指标的标准。
实施例6 保存期试验
（1）将实施例3的试剂盒放置于2～8℃，分别取放置0、2、4、6、8、9、10、11和12个月的试剂盒，对细交链孢菌酮酸标准样品（0.1 μg/L）的发光值、50%抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。
（2）将试剂盒在37℃保存的条件下放置12天，每天对细交链孢菌酮酸标准样品0.1 μg/L 的发光值、50%抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。
（3）将试剂盒在-20℃冰箱保存12天，每天对细交链孢菌酮酸标准样品（0.1 μg/L）的发光值、50%抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。
结果表明，经过三种条件保存试验，该试剂盒各项指标完全符合要求，因此，从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃保存12个月。
    上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括包被有细交链孢菌酮酸抗原的化学发光酶标板、细交链孢菌酮酸标准品、细交链孢菌酮酸抗体、酶标抗抗体、化学发光液和洗涤液。
2.根据权利要求1所述的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光酶标板为96孔可拆不透明白色发光板，所述的细交链孢菌酮酸抗原为TeAHGA与OVA的偶联物，所述的细交链孢菌酮酸抗原的包被浓度为0.3μg/L。
3.根据权利要求1所述的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的细交链孢菌酮酸标准品的浓度为1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的细交链孢菌酮酸抗体为细交链孢菌酮酸多克隆抗体，其原浓度为1mg/mL。
5.根据权利要求1所述的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标抗抗体为辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG，其原浓度为10mg/mL。
6.根据权利要求1所述的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光液包括底物液和底物缓冲液，底物液为将20mg对碘苯酚、8mg鲁米诺、1.21gTris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至8.4得到；底物缓冲液为将体积分数0.40% H2O2、1.21gTris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至7.0得到；所述化学发光液为底物液和底物缓冲液按体积比1: 1的比例混合。
7.根据权利要求1所述的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液为含有体积浓度0.5% Tween-20的pH7.4 0.4mol/L的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1至7任一所述的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于，
    S1. 将试剂盒置于15～35℃平衡30 min以上；将所述的细交链孢菌酮酸标准品溶液稀释成一系列的浓度梯度；
    S2. 取出化学发光酶标板，往标准孔中加入不同浓度的细交链孢菌酮酸标准品溶液，样品孔中加入待测样品，然后每孔加入细交链孢菌酮酸抗体，盖上盖板膜振摇混匀，孵育；
    S3. 吸除板孔中的反应液，加入洗涤液洗涤，将酶标板拍干；
    S4. 往各孔中加入酶标抗抗体，轻拍混匀，孵育；
    S5. 每孔加入化学发光液，轻拍混匀，盖上盖板膜，1～2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU；
    S6. 检测结果计算与分析，即得样品中细交链孢菌酮酸的含量。
9.根据权利要求8所述的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于，
    S1. 将试剂盒置于室温平衡30 min以上，用0.01 mol/L PBS将细交链孢菌酮酸标准品稀释成浓度分别为0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L的细交链孢菌酮酸标准品溶液；
    S2. 取出化学发光酶标板，在标准孔加入50 μL不同浓度的细交链孢菌酮酸标准品溶液，样品孔加入50 μL待测样品，使用0.01 mol/L PBST将细交链孢菌酮酸单克隆抗体稀释32000倍，然后每孔加入50μL稀释好的细交链孢菌酮酸单克隆抗体，盖上盖板膜置于37℃ 孵育30 min；
    S3. 吸除板孔中的反应液，各孔加入洗涤液约300μL，静置20秒左右，除去其中液体，如此共洗5次，最后一次将板拍干；也可用自动洗板机洗板5次，洗完后将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体；
    S4. 使用0.01 mol/L PBS将辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG酶标抗抗体稀释5000倍，往各孔中加入100 μL稀释好的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG酶标抗抗体，轻拍混匀后，置于37℃ 孵育20 min；
    S5. 每孔加入 100μL 底物液与底物缓冲液等体积混合后的化学发光液，轻拍混匀，盖上盖板膜，1～2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU，保存数据；
S6. 检测结果计算与分析，即得样品中细交链孢菌酮酸的含量。
10.根据权利要求8所述的细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的待测样品为液番茄或液面粉，其处理方法如下：
    液番茄：称取1g已匀浆的番茄样品于离心管中，除空白组外其它组直接添加2.5，10和20ng/g浓度水平的TeA，煮沸，使维生素C失活；加入2mL×2氯仿振荡萃取，以4000r/min离心10min，有机相加入10μL 98%水合肼，振荡反应30min后，减压蒸干溶剂，残余物用1mL PBS复溶，稀释一倍后，以4000r/min离心10min，吸取上清液进行检测；
    液面粉：称取1g面粉样品于离心管中，除空白组外其它组直接添加2.5，10和20ng/g浓度水平的TeA，然后加入5mL蒸馏水混匀，加入2mL×2氯仿振荡萃取，以4000r/min离心10min，有机相加入10μL 98%水合肼，振荡反应30min后，减压蒸干溶剂，残余物用1mL PBS复溶，稀释一倍后，以4000r/min离心10min，吸取上清液进行检测。
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