CN103483435A - 参与黄瓜葫芦素c合成的基因簇及其应用 - Google Patents

参与黄瓜葫芦素c合成的基因簇及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明首次在黄瓜基因组中发现参与葫芦素C合成的基因簇，共由8个基因组成，其中5个基因均位于6号染色体35kb的范围内。利用酵母体系解析了葫芦素C合成的第1至第4步反应，并在烟草体系中共表达了这8个基因，可实现葫芦素C的合成。本发明进一步揭示了黄瓜苦味形成的分子机制，为无苦味黄瓜育种提供了理论依据和分子辅助育种目标；同时为葫芦素的体外人工合成提供了宝贵经验。

Description

参与黄瓜葫芦素C合成的基因簇及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及参与黄瓜葫芦素C合成的基因簇及其应用。
背景技术
黄瓜的苦味是由一类称为葫芦素C的三萜化合物导致的。黄瓜果实中积累葫芦素C会严重影响黄瓜的口感及品质。早期的经典遗传学试验发现黄瓜的苦味由Bi和Bt两个基因控制。CN103013966中发现Bi基因编码氧化角鲨烯环化酶，它催化生成葫芦2烯醇，是葫芦素C合成的第一步，也是合成中最关键的一步。葫芦素C的合成除了第一步生成葫芦2烯醇，还需要经过一系列的催化修饰，然而，葫芦2烯醇在植物体内是如何被修饰，最终合成葫芦素C，目前尚不清楚。
大部分葫芦素科植物都具有葫芦素，例如，葫芦素C来源于黄瓜，葫芦素E来源于甜瓜，葫芦素B来源于西瓜。但是它们的合成路径尚不清楚，相关合成基因也没有被克隆获得。因此，葫芦素主要从植物中提取获得，不能体外直接合成。
发明内容
本发明的目的是提供参与黄瓜葫芦素C合成的基因簇及其应用。
为了实现本发明目的，本发明提供参与黄瓜葫芦素C合成的蛋白，包括Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890和Csa6G088700，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1-8所示。
本发明还提供参与黄瓜葫芦素C合成的基因簇，所述基因簇共由8个基因组成，Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890和Csa6G088700，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID No.12-19所示。
本发明还提供含有所述参与黄瓜葫芦素C合成的基因簇的载体、工程菌、宿主细胞及转化的植物。
本发明还提供所述参与黄瓜葫芦素C合成的基因簇在调控黄瓜苦味合成中的应用。
本发明还提供所述参与黄瓜葫芦素C合成的基因簇在调控葫芦素体外合成中的应用。
本发明还提供所述参与黄瓜葫芦素C合成的基因簇在无苦味黄瓜分子育种中的应用。
本发明还提供一种转基因植物的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有所述参与黄瓜葫芦素C合成的基因簇的载体转入植物体（例如烟草等）中，筛选获得转基因植物。
在之前的研究中，对114份黄瓜核心种质材料进行重测序分析，同时对这114份材料进行苦味表型鉴定。采用全基因组关联分析（GWAS）的方法和群体作图，快速找到了控制叶片苦味的Bi候选基因。Bi编码一个葫芦2烯醇环化酶基因，是葫芦素C合成的关键酶。葫芦2烯醇还需要进一步被氧化和乙酰化才能生成葫芦素C。为了解析葫芦素C合成的其他步骤，对黄瓜转录组数据（RNA-Seq）进行分析，寻找与Bi基因共表达的P450基因和乙酰转移酶基因，在黄瓜基因组中一共找到了6个P450基因（Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550和Csa1G044890）和1个乙酰转移酶基因（Csa6G088700）。这7个基因与Bi（Csa6G088690）基因在黄瓜各个组织中的表达状态非常相似，只在叶片中大量表达。此外，除了3个P450基因（Csa3G903540、Csa3G903550和Csa1G044890），其他基因与Bi基因均位于6号染色体35kb的范围内，形成一个类似基因簇的结构。目前，以基因簇的形式参与重要次生代谢产物合成在高等植物中被广泛发现，因此推测本发明发现的这7个候选基因很可能与Bi基因一起形成葫芦素C合成基因簇，在黄瓜叶片中合成苦味物质。
进一步利用酵母表达体系，在酵母中表达这些候选基因，用GC-MS或UPLC-Q-TOF仪来检测酵母提取物，解析苦味合成中间产物。首先，用GC-MS在表达Bi、辅酶CPR和Csa3G903540的酵母中发现了一个特异的产物。该产物的MS检测结果与葫芦2烯醇相比，检测到大的离子碎片少了2个氢原子，这意味着葫芦2烯醇很有可能被Csa3G903540氧化。进一步将该产物从酵母中纯化分离出来，利用核磁共振（UMR）解析其结构，发现葫芦2烯醇的19号碳原子发生羟基化，进而证明Csa3G903540催化葫芦2烯醇的氧化，是苦味合成的第二步。继续利用酵母表达体系，表达更多的候选基因，用UPLC-Q-TOF分析产物的精确分子量，推测可能发生的氧化反应产物。通过该方法，仅在表达Bi、CPR、Csa3G903540和Csa6G088160酵母提取物中发现分子量为459.3833[M+H]的产物，与Csa3G903540催化生成的产物（C30H50O2）的分子量相比，刚好多了一个氧原子的质量，而在表达其他候选P450基因的酵母中无任何特异产物出现，由此推测Csa6G088160参与葫芦素C合成的第三步。采用同样的方法，发现在表达Bi、CPR、Csa3G903540、Csa6G088160和Csa3G903550的酵母提取物中发现分子量为497.3601[M+Na]的产物，与Csa6G088160催化生成的产物（C30H50O3）的分子量相比，刚好又多了一个氧原子，推测Csa3G903550参与葫芦素C合成的第四步。
除了解析葫芦素C的合成路径，本发明还将找到的7个候选基因加上之前发现Bi基因以及已报道的HMGR和FPS基因在烟草中同时表达。烟草叶片中本身是不存在葫芦素C的，但在成功表达基因簇基因后，烟草叶片中检测到了葫芦素C的合成，证明了该基因簇的功能。此外，利用同样的实验体系，还发现缺少7个候选基因中任意一个基因，烟草叶片均不能生成葫芦素C，因而从另一个方面验证了在黄瓜基因组中找到的基因簇在黄瓜叶片中协同表达，共同参与苦味物质的合成。
本发明首次在黄瓜基因组中发现参与葫芦素C合成的基因簇，共由8个基因组成，其中5个基因均位于6号染色体35kb的范围内。利用酵母体系解析了葫芦素C合成的第1至第4步反应，并在烟草体系中共表达了这8个基因，可实现葫芦素C的合成。本发明进一步揭示了苦味形成的分子机制，为无苦味黄瓜育种提供了理论依据和分子辅助育种目标，可用于大规模筛选育种材料，大大加快高营养黄瓜的育种进程；同时还为葫芦素的体外人工合成提供了宝贵经验，本发明可替代传统的从植物材料中提取苦味素（葫芦素）的方法，实现体外合成苦味素。
附图说明
图1为本发明通过分析RNA-Seq数据，从黄瓜基因组中发现与苦味素（葫芦素C）合成相关的基因簇。
图2为本发明利用GC-MS检测参与苦味素合成第二步反应的结果；其中，A为GC-MS检测到的Csa5G903540的特异产物，B为该特异产物的MS检测结果，虚线小框为葫芦素2烯醇的MS检测结果。
图3为本发明利用UPLC-Q-TOF检测参与苦味素合成第三步反应的结果。
图4为本发明用UPLC-Q-TOF检测参与苦味素合成第四步反应的结果。
图5为本发明利用烟草瞬时表达***共表达与苦味素合成相关的基因簇以及HMGR和FPS基因后，用UPLC-Q-TOF检测烟草叶片提取物的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1参与黄瓜葫芦素C合成的基因簇的挖掘与获得
1基因簇的挖掘
Bi基因在黄瓜叶片中大量表达，以此为线索，分析黄瓜转录组数据（RNA-Seq）寻找与Bi共表达的P450基因和乙酰转移酶基因，在黄瓜基因组中一共找到了6个P450基因（Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550和Csa1G044890）和1个乙酰转移酶基因（Csa6G088700）。这7个基因与Bi（Csa6G088690）基因在黄瓜各个组织中的表达状态非常相似，只在叶片中大量表达（图1）。此外，除了3个P450基因（Csa3G903540、Csa3G903550和Csa1G044890），其他基因与Bi基因均位于6号染色体35kb的范围内，形成了一个类似基因簇的结构（图1）。葫芦素C在黄瓜各个组织的中分布与该基因簇的表达模式很相似（图1），都是叶片中最高，因此认为该基因簇参与苦味物质的合成。
2黄瓜Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550和Csa1G044890基因的获得
首先制备黄瓜叶片cDNA文库，然后利用正向引物和反向引物进行PCR扩增（引物序列见表1）。
表1引物序列（5′-3′）
Csa6G088690-TVector-F AGATTAAAAGTGGGAAAAG
Csa6G088690-TVector-R CAGTTTTGAGCTACCC
Csa6G088700-TVector-F ATGGCTCTAAAAGTAGATATC
Csa6G088700-TVector-R GACTTCTTGTAAACCTAAT
Csa6G088160-TVector-F GGAAGACTCTATCTTACAA
Csa6G088160-TVector-R CGTGATACATTTCGTTC
Csa6G088170-TVector-F AGGGCAATGAGAGCTATTACCAAACCA
Csa6G088170-TVector-R TGCTTGCTTCTTTGTCGCCAAGA
Csa6G088710-TVector-F TCACCGGCGTCGACATTACTGA
Csa6G088710-TVector-R TCATGTCAGCTTCTCAGCAAAAGCT
Csa3G903540-TVector-F TGCAACACACAAAGCTATCAAAGAATGG
Csa3G903540-TVector-R AGGCCCATTGGCTTGGCACT
Csa3G903550-TVector-F ATTGGAGTTGTTTTAGGGGTTTGTTTGTTG
Csa3G903550-TVector-R AATAATTTTGCAAAGGCAATTTTCTGGCCG
Csa1G044890-TVector-F GCCTCGTCATTCCGAGCTCGTCT
Csa5G044890-TVector-R CCATTCAATCATTCCTTGGGAGTGAAGT
PCR反应体系以20μl计为：10-20ng/μl模板1μl，10pmol/μl正向、反向引物各1μl，10mmol/L dNTP mix0.4μl，0.5U/μL高保真Taq DNA聚合酶1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为水。
PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃2分30秒，35个循环；72℃10分钟。
将扩增得到的片段与T-载体（TAKARA）连接，测序确认没有突变。黄瓜Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550和Csa1G044890基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13-18所示。
实施例2利用酵母表达***验证苦味合成候选基因的功能
将Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890基因以及辅酶CPR基因分别构建到表达载体pYES2（Invitrogen）上，并转化酵母菌。诱导酵母表达蛋白，收集酵母。裂解后用正己烷抽提化合物。样品制备好后用GC-MS（Agilent）或UPLC-Q-TOF进行检测。结果分别如图2-图4所示。
CPR基因（SEQ ID No.20）是P450基因在氧化底物中的一个辅酶基因，加入CPR有利于提高氧化反应效率。
实施例3利用农杆菌介导的烟草瞬时表达方法验证黄瓜苦味基因簇的的功能
将Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890和Csa6G088700基因构建到双元载体pBIN-Plus上。利用化学转化分别导入农杆菌EA105中。将分别含有Bi（Csa6G088690）、HMGR、FPS、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890和Csa6G088700基因的农杆菌培养至OD600约1.0，然后等量混合到一块，用注射器将农杆菌注入6周左右的烟草中。一周后收集烟草叶片，用甲醇提取叶片中的化合物，然后进行UPLC-Q-TOF（Agilent）检测。结果如图5所示。
由于HMGR基因（SEQ ID No.21）和FPS基因（SEQ ID No.22）参与合成Bi基因的底物氧化角鲨烯，将这两个基因共同注射烟草，提高了烟草中氧化角鲨烯的含量，有利于提高终产物的产量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列说明：
SEQ ID No. 1-11分别为Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890、Csa6G088700、CPR、HMGR和FPS蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID No. 12-22分别为基因Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890、Csa6G088700、CPR、HMGR和FPS的碱基序列。
SEQ ID No. 23-38为本发明中涉及的引物序列。
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Figure IDA0000372268140000011
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Claims (10)

1.参与黄瓜葫芦素C合成的蛋白，包括Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890和Csa6G088700，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1-8所示。
2.参与黄瓜葫芦素C合成的基因簇，其特征在于，所述基因簇由以下8个基因组成，Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890和Csa6G088700，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID No.12-19所示。
3.含有权利要求2所述基因簇的载体。
4.含有权利要求2所述基因簇的工程菌。
5.权利要求2所述基因簇在调控黄瓜苦味合成中的应用。
6.权利要求2所述基因簇在调控葫芦素体外合成中的应用。
7.权利要求2所述基因簇在调控葫芦素C体外合成中的应用。
8.权利要求2所述基因簇在无苦味黄瓜分子育种中的应用。
9.一种转基因植物的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求3所述的载体转入植物体中，筛选获得转基因植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物为烟草。
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