CN103476424A - Cyaa携带的多肽及其在诱导治疗性和预防性免疫应答中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是基于CyaA-携带的多肽的方法，用于通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答来对哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗，和用于通过诱导针对包含在所述多肽中的第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态，所述免疫应答通过将所述载体携带的多肽给药于所述寄主后获得，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。
Description
技术领域
本发明的目的是一种基于CyaA-携带的多肽的方法，用于通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答来对哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗，和用于通过诱导针对包含在所述多肽中的第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态，所述免疫应答通过将所述载体携带的多肽给药于所述寄主后获得，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。在一个具体实施方式中，本发明的目的是一种基于CyaA-携带的多肽的方法，用于(i)通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答来对所述哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗，和(ii)通过诱导针对包含在所述多肽中的第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态；和(iii)通过诱导针对包含在所述多肽中的所述第一组表位的T细胞记忆性免疫应答来防止所述第一确定的病理状态的复发，所述免疫应答通过将所述载体携带的多肽给药于所述寄主获得，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。
背景技术
导致百日咳的病原体，百日咳博代杆菌(Bordetella pertussis)产生的关键毒素是腺苷酸环化酶(CyaA)。小鼠模型显示：在肺部定植的早期阶段，CyaA对于细菌是必须的(Goodwin and Weiss 1990)。CyaA在入侵真核细胞中展示了独特的机制，它通过特定模式把它的催化区递送到细胞质溶胶中(Simsova，Sebo et al.2004)。解毒并重组的CyaA蛋白作为疫苗载体显示了精确导向表达CD11b/CD18的抗原呈递细胞(APC)，例如树突状细胞或朗格汉斯细胞的能力(Guermonprez et al.2001)。这些常驻APC是在皮下免疫途径随后启动的抗原特异性T细胞应答的关键天然细胞(Merad，Ginhoux et al.2008)。和CD11b+APC特异性结合后，携带病毒性抗原或肿瘤性抗原的CyaA以特定的方式递送它的抗原性物质(Preville，Ladant et al.2005)。基于这个独特的技术，本发明申请人已经研制了临床阶段的用于治疗已感染HPV病人的二价疫苗：ProCervix。ProCervix是二价治疗性疫苗，通过两种不同CyaA疫苗的混合物制备而成：一种疫苗嵌有HPV16的E7蛋白，另一种带有HPV18的E7蛋白。
事实上，人***瘤病毒(HPV)感染一般是长期持续存在的，而且受损的寄主免疫应答可能导致***，特别是高风险的HPV时，如HPV18和HPV16。HPV的E7肿瘤蛋白在病毒的整个复制周期中都会表达，因此选择它们作为T细胞介导的免疫治疗的靶标(lwasaki 2010)。B细胞介导的针对病毒衣壳蛋白的免疫显示其足以实现预防HPV感染(Stanley 2010)。然而，先天性的和T细胞介导的免疫对于治疗已感染病毒的病人是非常关键的(Frazer 2009)。此外，目前已有的HPV预防性疫苗对于治疗已感染HPV的病人和治愈疾病是非常低效的，因此，要增加研发能够诱导针对HPV抗原的抗原特异性T细胞应答的治疗性疫苗的重要性(Trimble and Frazer 2009)。
预防性疫苗是基于B细胞介导的免疫研发的。相比之下，治疗性疫苗目的在于通过诱导强有效的促炎CD4+和CD8+T细胞应答，以获得对慢性感染(病毒、细菌等)或癌症的有效治疗(Bachmann and Jennings 2010)。在小鼠模型和病人中的很多研究结果表明：诱导抗原特异性的T细胞免疫和预防病变细胞、已感染的细胞或肿瘤细胞是相关联的(Pulendran，Li et al.2010；Sallusto，Lanzavecchia et al.2010)。通过定性和定量测量患有肿瘤的小鼠在接种治疗性疫苗后的CD8+T细胞应答，可以预测治疗结果，即：肿瘤在个体动物中的进化或退化(Rosato，Zoso et al.2006)。成功的治疗性疫苗接种可以完全消除病变细胞，这种免疫治疗处理的关键方面是它能够产生长期记忆性T淋巴细胞的潜力以保护病人免于第二次病原体感染。记忆性T淋巴细胞可以分为两个主要的细胞亚群：TEM(效应记忆性T细胞)和TCM(中枢记忆性T细胞)。TEM是适合消灭病原体的免疫应答的克隆收缩(clonal contraction)阶段产生的第一类记忆性T细胞。TEM是CD62L-CCR7-T并偏好存在于外周组织，如皮肤、肠和肺部，在那里它们为寄主提供第一道防线(Woodland andKohlmeier 2009)。最后，TEM逐渐朝向TCM表型分化：CD62L+CCR7+。这些T淋巴细胞优先位于次级淋巴器官中(Kaech，Hemby et al.2002；Ahmed，Bevan et al.2009)。然而，TEM和TCM在血液循环中都被发现过。CD8记忆性应答功效的关键方面是CD8+记忆性T淋巴细胞获得裂解潜力的速度，并因此通过相同病原体的新的感染消灭感染的细胞以防止感染扩散和相应的疾病发展。已显示：小鼠能够通过抗原特异性CD8+T细胞应答的发展来清除淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)急性感染，成熟的记忆性CD8+T细胞能够快速清除已感染的细胞(Barber et al.，2003)。
基于这些认识，发明人把涉及T细胞介导的免疫应答的治疗性疫苗接种方法扩展到设计了治疗性和预防性治疗病理状态的新概念，通过以设计的含有载体表位的多价免疫组合物的形式联合给药活性成分。
特别地，发明人设计的多价治疗性疫苗适合在单个病人中，诱导针对所诊断的病理状态进行免疫治疗，并增加针对抗原或和所述治疗的病理不相关的表位强有力的预防应答，和可选地增加针对所述治疗的病理复发的保护性和预防性应答。
事实上，使用基于CyaA的多价治疗方法突出了CyaA携带的多肽具备治疗以及可能消除已确定的感染或癌症的潜能，并同时为相同的病人提供针对所述预防性保护寻求的包含在多肽中的靶表位的强大的免疫应答，优选的是保护性T细胞记忆性应答，以及可选地，针对所述已确定的感染或癌症复发的保护性和预防性应答。
附图说明
图1百日咳博代杆菌(B.pertussis)、副百日咳博代杆菌(B.parapertussis)和支气管败血性博代杆菌(B.Bronchiseptica)中腺苷酸环化酶(CyaA)的蛋白序列(SEQ ID NO：1到3)，和百日咳博代杆菌(B.pertussis)、副百日咳博代杆菌(B.parapertussis)和支气管败血性博代杆菌(B.Bronchiseptica)中腺苷酸环化酶(CyaA)的核苷酸序列(SEQ ID NO：4到6)。
图2百日咳博代杆菌(B.pertussis)、副百日咳博代杆菌(B.parapertussis)和支气管败血性博代杆菌(B.Bronchiseptica)中腺苷酸环化酶(CyaA)的蛋白序列比对。
图3pkTRACE5的示意图，其中，它相关的限制性位点和被***的序列表示为CyaA-HPV16E7D30-42(A)和CyaA-HPV18E7D32-42(B)。
图4(A)pTRACE5的示意图，其中，它相关的限制性位点和被***的序列表示为CyaA-CysOVA；(B)pkTRACE5的示意图，其中，它相关的限制性位点和被***的序列表示为CyaA-MAGEA397-178/190-295。*MAGE-A3190-295代表融合到MAGE-A3的第242到295位氨基酸残基的第190到221位残基。编号97、178、190、221、242和295表示MAGE-A3全部序列中的氨基酸残基位点；(C)CyaA-MAGE A3载体的蛋白序列(SEQ ID NO：7)。MAGEA3序列已用下划线标出。限制性位点已加粗：Nhel(AS)、KpnlA(GT)、Agel(TG)和Spel(TS)。
图5在第11天接种含有佐剂的ProCervix治疗性免疫疫苗消除了确定的TC-1诱导的实体瘤。在监控后期：接种PBS+AldaraTM的一组小鼠显示3/10的小鼠出现肿瘤退化(A)，只接种8μg ProCervix疫苗的一组小鼠显示0/10的小鼠出现肿瘤退化(B)。接种ProCervix疫苗联合AldaraTM佐剂(外用咪喹莫特)(C)或Poly-ICLC(D)显示7/10的小鼠出现肿瘤退化。
图6在第50天接种含有佐剂的ProCervix治疗性免疫疫苗能够同时导致小鼠的存活率高和高比例的不成瘤小鼠。在第50天，接种ProCervix+AldaraTM或ProCervix+Poly-ICLC的小鼠显示没有肿瘤(A)。关于在第50天的存活率：在第11天时接受ProCervis+AldaraTM和ProCervix+Poly-ICLC的小鼠的存活率分别为100％和70％(B)。
图7无肿瘤的小鼠免疫接种含有佐剂的ProCervix疫苗治疗六天后，显示具有功能性的HPV16E749-57和HPV18E7AS43-49特异性记忆性CD8+T细胞。在第60天把在不同组的不成瘤的小鼠以1∶1∶1比例静脉注射CFSEhiHPV16E749-57脉冲靶细胞，CFSEin非脉冲靶细胞和CFSEloHPV18E7AS43-49脉冲靶细胞。过夜后，小鼠被施以安乐死，收集脾脏并通过FACS分析检测抗原特异性体内细胞毒性。每个点代表从单个小鼠获得的结果；空心圆代表HPV18 E7AS43-49脉冲靶细胞杀伤的比例；实心圆代表HPV16 E749-57脉冲靶细胞杀伤的比例。横线代表每组小鼠的平均值。
图8接种疫苗的总体示意图(D代表天数)；该表格总结所接种的细胞和疫苗的性质和位置(/：没有接种)。
图9接种嵌有HPV16E7抗原的CyaA双价疫苗联合AldaraTM佐剂的治疗性疫苗，导致消除了TC-1诱导产生的实体瘤。从第0天(D0)到第100天(D100)，记录每组10只小鼠右腋(right flank)的肿瘤样TC1细胞的体积(mm3)。第1组小鼠接种安慰剂，第2组小鼠接种安慰剂+AldaraTM，第3组小鼠接种CyaA-MAGEA397-178/190-295/CyaA-HPV16 E7疫苗联合AldaraTM佐剂，第4组小鼠接种CyaA-cysOVA/CyaA-HPV16 E7疫苗联合AldaraTM佐剂，第5组和第6组小鼠接种ProCervix疫苗联合AldaraTM佐剂。每幅图右侧的编号对应每组中每只小鼠指定的编号。
图10接种基于CyaA的二价疫苗使得含有TC1诱导产生的肿瘤获得痊愈的小鼠，能够以抗原特异性模式获得预防其他不相关的肿瘤攻击。对于从TC1攻击中存活的小鼠，从第60天(D60)到第100天(D100)记录其左腋中肿瘤样细胞B16 MAGE A3的体积(a和c)或肿瘤样细胞EG7-OVA的体积(b和d)。每幅图右侧的编号对应在TC1攻击中每只小鼠之前指定的编号。
发明内容
本发明的目的是方法，用于(i)对哺乳动物寄主第一确定的病理状态的进行免疫治疗；和(ii)预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态；和(iii)可选地，防止所述第一确定的病理状态的复发。该免疫应答(i)通过诱导针对包含在作为活性成分的多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答来治疗所述经诊断的病理状态；(ii)通过诱导针对包含在作为活性成分的多肽中的第二组表位的T细胞记忆性免疫应答以预防所述第二确定的状态的发生或发展；(iii)可选地，通过诱导针对所述第一组表位中的T细胞记性忆免疫应答来防止所述第一确定的病理状态的复发，所述免疫应答通过将所述载体携带的多肽给药于所述寄主获得，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。这些途径包括：
(1)作为活性成分的载体携带的多肽，其中所述携带多肽的载体包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中；
(2)包含或者含有这种活性成分的组合物，包括包含如(1)中定义的载体携带的多肽以及药学上可接受的载体或配方的组合物；和
(3)组合物包含含有第一组表位的第一载体携带的多肽和含有第二组表位的的第二另外的载体携带的多肽。
因此，在第一个实施方式中，本发明涉及载体携带的多肽，其中所述携带多肽的载体包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中，用于(i)通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答来对所述哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗，和(ii)通过诱导针对包含在所述多肽中的第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态和(iii)可选地，通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞记忆性免疫应答来防止所述第一确定的病理状态的复发，所述免疫应答通过将所述载体携带的多肽给药于所述寄主获得，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定病理状态的所述预防。
该发明涉及一种组合物，包含与药学上可接受的载体联用的载体携带的多肽，其中所述携带多肽的载体包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中，用于(i)通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答来对所述哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗，和(ii)通过诱导针对包含在所述多肽中的第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态，和(iii)可选地，通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞记忆性免疫应答来防止所述第一确定的病理状态的复发，所述免疫应答通过将所述组合物给药于所述寄主获得，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的组合物含有的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。
本发明同样涉及一个组合物，可选地结合药学上可接受的载体，包含：
(a)第一载体携带多肽，所述携带多肽的第一载体包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中，其中第一组表位包含在所述第一载体中的所述多肽中；
(b)第二另外载体携带的多肽，其中所述携带多肽的第二载体包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中，其中第二组表位包含在所述第二载体中的所述多肽中；和
(c)可选地，一种或多种与(a)和(b)不同的另外的载体携带的多肽，
用于(i)和所述第一组表位相关的病理联合免疫治疗中；和(ii)和所述第二组表位相关的免疫预防治疗和(iii)可选地，预防所述第一确定的病理状态的复发，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的组合物含有的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。
在具体实施方式中，所述含有(a)，(b)和(c)的组合物用于(i)通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答来对所述哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗，和(ii)通过诱导针对包含在所述多肽中的第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态，和(iii)可选地，通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞记忆性免疫应答来防止所述第一确定的病理状态的复发，所述免疫应答通过将所述组合物给药于所述寄主获得。
术语“CyaA”源自博代杆菌属(Bordetella)，特别是源自百日咳博代杆菌(Bordetella.pertussis)、副百日咳博代杆菌(Bordetella.parapertussis)和支气管败血性博代杆菌(Bordetella.bronchiseptica)的腺苷酸环化酶(或腺苷酸环化酶)。百日咳博代杆菌(Bordetella.pertussis)的腺苷酸环化酶蛋白是有1706个残基(SEQ ID NO：1)的毒素，包含有400个氨基酸残基的N端催化结构域和有1306个残基的C末端。C末端负责把毒素结合到靶细胞膜上并随后将催化部分递送到目标细胞质溶胶中。百日咳博代杆菌(Bordetella.pertussis)中CyaA的序列见图1。副百日咳博代杆菌(B.parapertussis)和支气管败血性博代杆菌(B.bronchiseptica)的CyaA蛋白含有1740个氨基酸，它们各自的序列(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)见图1。
术语“CyaA片段”是指CyaA蛋白中的一部分，可选地，包含CyaA蛋白全长序列中的C端的全部或一部分，所述片段能够将所述多肽呈递到哺乳动物寄主中的免疫***中，即，能够导致诱导针对包含在载体携带的多肽中的表位的特异性免疫应答或者有助于所述应答。特别地，所述CyaA片段能够特异性地结合到表达CD11b的细胞和可选地，将所述多肽递送到细胞质溶胶中。所述片段包含一个截短的(从N端和/或C端末端删除)CyaA蛋白，或内部删除氨基酸残基的全长蛋白。因此，根据本发明，CyaA蛋白中的特定片段包含百日咳博代杆菌(B.pertussis)CyaA蛋白第372到1706位氨基酸残基(删除前371位氨基酸残基)。另一特定片段是百日咳博代杆菌(B.pertussis)CyaA蛋白中的第225到234位氨基酸残基被删除，因此获得包含第1到第224位氨基酸残基和第235到1706位氨基酸残基(内部删除)的片段。术语“特异性地”在本发明中指，腺苷酸环化酶或它的片段当用作载体分子时，优选导向表达CD11b的细胞，因此，相比其他细胞(不表达CD11b)，以一种选择性方式提供导向位于所述细胞表面或细胞内部的多肽的方式。
术语“CyaA”也包含CyaA蛋白或它的修饰后片段，优选通过一个或多个氨基酸替换，氨基酸内部***或氨基酸内部删除，以获得解毒的或无毒的产品或没有酶活性的产品(侵入性和细胞毒性)。因此，这样的CyaA蛋白(或它的片段)没有催化活性，但是其将所述多肽呈递到哺乳动物寄主的免疫***中，和可选地特异结合到CD11b/CD18受体和/或把初始CyaA蛋白的催化区域易位的过程没有受到影响。无毒的CyaA蛋白已知的例子是百日咳博代杆菌(Bordetella.pertussis)的CyaA，其中将二肽Leu-Gln***到天冬氨酸188和异亮氨酸189位氨基酸残基(催化位点的必要部分)之间的框中。根据Ladant et al.(1992)所述的方法，可以检测该CyaA蛋白(或它的片段)中缺失的毒性或酶活性。特别是根据EP 03291486或WO 02/22169中所述的方法，可以检测该CyaA蛋白(或它的片段)靶向CD11b/CD18细胞的能力。此外，通过WO 02/22169中所述的方法可以检测该CyaA蛋白(或它的片段)将抗原多肽转运到靶细胞的胞质溶胶内的能力。
在进一步具体的实施方式中，术语“CyaA”同样包含：经翻译后修饰的CyaA蛋白(或它的片段)，例如通过翻译后软脂酰化(palmitoyation)其至少一个残基，特别是两个内在赖氨酸残基(860位和983位赖氨酸)。这些翻译后修饰可以通过cyaA基因和cyaC基因共同表达获得。因此，包含在载体携带的多肽中的CyaA蛋白或它的片段，可能是细胞中，特别是在重组细胞中，cyaA和cyaC基因共表达获得的CyaA蛋白或它的片段。
在本申请中用到的术语“载体”或“载体分子”包含此处描述的修饰的或没有修饰的的全长CyaA蛋白，或它的片段。
术语“CD11b表达细胞”是指其表面表达CD11b/CD18受体的细胞(CD11b+)。具体的，这些细胞是粒细胞/中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、T CD8+的亚类、B细胞的亚类、朗格汉斯细胞、树突状细胞和髓样树突状细胞。
术语“载体携带的多肽”是指CyaA蛋白(或它的片段)其携带至少一种与CyaA蛋白异种的多肽，特别是和文中定义的CyaA片段不同的多肽，尤其是不能和CyaA产生免疫交叉反应的多肽。术语“至少一种”是指一种或多种多肽，具体是：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种多肽，优选1、2或3种多肽。
术语“携带”包含与根据本发明的CyaA蛋白或它的片段以及多肽相关的多种多样的结构。这些结构可以通过以下方法实现：
-根据本发明，把至少一种多肽化学耦联到CyaA蛋白或它的片段。化学耦联多肽到CyaA或它的片段的方法在本领域是已知的，包括例如通过二硫键，优选通过使用N-吡啶磺基活化的巯基的二硫键。由于天然的CyaA蛋白的一级序列中没有半胱氨酸残基，半胱氨酸残基被基因导入CyaA蛋白，特别是它的催化区域，优选导入到如下定义的许可位点中(例如235位)或者CyaA的一个末端；和
-把至少一种多肽通过基因连接或基因融合到CyaA蛋白或它的片段。该基因连接或基因融合包括把编码至少一种根据本发明的多肽的核苷酸通过基因***整合到到编码CyaA蛋白或它的片段的核苷酸中(即CyaA蛋白的构架没有移动)，优选地，***到CyaA蛋白的催化区域，从而获得重组蛋白。因此，至少一种多肽能够***到CyaA蛋白的任意许可位点(见WO 93/21324)。此处所用到的术语“许可位点”是指多肽可以***同时基本不会影响腺苷酸环化酶的预期功能特性的位点，即不会影响CyaA蛋白呈递所述多肽到哺乳动物寄主的免疫***的能力，特别是不会影响与CD11b/CD18受体特异性结合的能力，和可选地，不会影响把多肽转移到靶细胞细胞质溶胶的能力。百日咳博代杆菌(Bordetella.pertussis)腺苷酸环化酶的许可位点包括但不限于：107-108(甘氨酸-组氨酸)，132-133(甲硫氨酸-丙氨酸)，137-138(缬氨酸-丙氨酸)，224-225(精氨酸-丙氨酸)，228-229(谷氨酸-丙氨酸)，232-233(甘氨酸-亮氨酸)，235-236(精氨酸-谷氨酸)，317-318(丝氨酸-丙氨酸)和335-336(甘氨酸-谷氨酰胺)(Sebo et al.，1985；Glaser et al.，1988)。对于另外的博代杆菌属(Bordetella sp.)，相应的许可位点可以通过比对序列来定义并决定相应的残基(图2)。根据另一个实施方式，基因连接也包括将编码至少一种多肽的核苷酸融合到CyaA蛋白或它的片段的一个末端和/或其它末端。
当一种CyaA蛋白(或它的片段)携带超过一种多肽时，这些多肽可能全部通过化学耦联携带，或全部通过基因连接携带(优选全部为基因***)，或它们中的一种是通过化学耦联携带的，而其他的则通过基因连接携带。在具体的实施方式中，当全部的多肽都通过基因***到CyaA，优选***到CyaA的许可位点时，这些多肽***到不同的位点，优选***到不同的许可位点。在另一个具体的实施方式中，当全部的多肽都通过基因***到CyaA，优选***到CyaA的许可位点时，这些多肽***到相同的位点，优选***到相同的许可位点。
术语“多肽”是指氨基酸连接在一起而形成的，并且至少有9个氨基酸残基，特别是长度为9到500个残基，9到200个残基，9到100个残基，9到50个残基，或长度为30或50到500个或到200个残基，或100到500个残基，或100到200个氨基酸残基。在本发明中，术语“多肽”是指多肽一旦被载体分子携带，能够诱导针对包含在该多肽中的表位的免疫应答，特别是T细胞免疫应答。包含在载体分子中的多肽可能源自肿瘤抗原，即肿瘤或癌细胞表达的多肽，不论该肿瘤是自体诱导或经病原体诱导产生的；肿瘤抗原可以是自体(特别是来自人类)或来自诱导产生肿瘤的病原体。
术语“肿瘤抗原”包含以下几组肿瘤抗原，本发明中包含在载体分子中的多肽从以下几组中选择至少一组：(a)瘤胎肿瘤抗原，(b)肿瘤病毒(oncoviral)肿瘤抗原，(c)过表达/累积肿瘤抗原，在正常组织中广泛表达和在肿瘤中过表达，(d)肿瘤特异性共享抗原或癌-睾丸共享抗原，在很多肿瘤中表达但不在正常组织中表达(包括BAGE家族、GAGE家族、MAGE家族、SAGE家族和XAGE家族)，(e)细胞系限制性肿瘤抗原，(f)突变的肿瘤抗原，由在机体中广泛表达的基因点突变造成的；和(g)肿瘤抗原分化，在肿瘤起源但非肿瘤特异性的正常组织中表达。
在具体的实施方式中，当超过一种多肽在单个载体分子中用于诱导免疫治疗应答，或在单个的载体分子中用于诱导免疫预防应答时，所有的多肽都源自于肿瘤抗原。
在另一个实施方式中，包含在载体分子中的多肽可能或是源自病原体的抗原，即由已感染的哺乳动物寄主中的病原体产生的抗原，也可能是在所述已感染的哺乳动物寄主细胞处理而成或是所述病原体的成分。病原体抗原可以是细菌抗原，病毒抗原，真菌抗原或寄生虫抗原。在这些例子中，作为具体的实施方式，可以区分涉及肿瘤发生(致癌病原体)的病原体以及不涉及肿瘤发生的病原体。病原体的例子是细胞内病原体，特别是可以在它们的寄主体内诱导T细胞免疫应答的病原体。因此，这些多肽可能源自但不限于：衣原体(Chlamydia)、疟原虫(Plasmodium)、利什曼虫(Leishmania)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人***状瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、腺病毒(adenoviruses)、埃博拉病毒(EBV)、疱疹病毒(herpes virus)、人体T细胞白血病病毒(HTLV.1)和巨细胞病毒(CMV)。在具体的实施方式中，包含在载体分子中的多肽可能源自病原体的表面蛋白(如HIV的包膜蛋白)或源自可以和已感染的细胞的***相互作用的多肽。(例如人***状瘤病毒(HPV)的E6或E7蛋白)。
在具体的实施方式中，当超过一种多肽用于单个载体分子或和载体的组合中时，全部的多肽都源自病原体的抗原，可能是截然不同的病原体、属或种。
在具体的实施方式中，包含在载体分子中的多肽全部源自细菌抗原，全部源自病毒抗原，全部源自真菌抗原或全部源自寄生虫抗原。在另一个实施方式中，包含在此处描述的载体分子中的不同的多肽独立地源自细菌抗原，病毒抗原，真菌抗原或寄生虫抗原。在另一个实施方式中，在单个载体分子或载体的组合中的多肽，源自肿瘤和源自病原体。
术语“源自”是关于由载体分子携带的多肽，意思是全长抗原蛋白或抗原蛋白的片段，或由抗原蛋白的若干部分融合形成的合成的、非天然的携带表位的多肽，或由一个或若干个来自若干蛋白的部分融合形成的合成的、非天然的多肽，条件是该片段或该合成的、非天然的多肽，一旦由载体分子携带，能够诱导针对包含在该片段或多肽中的抗原决定簇的免疫应答，特别是T细胞免疫应答。根据该定义，由载体分子携带的多肽是或包含独特的表位，或是或包含一组表位。术语“表位组”包含至少一种表位，即一种或多种表位，特别是10到500种表位，50到200种表位，80到150种表位。在具体的实施方式中，术语“表位组”指1，2，3，4，5，6，7，8，9或10种表位。在具体的实施方式中，由载体分子携带的多肽是或包含多表位，即多肽含有至少两个表位，特别是至少两个T细胞表位。本发明中的表位是线性或构象的，优选线性的，是涉及诱导细胞介导的免疫应答，特别是T细胞免疫应答的任意氨基酸序列。相应地，此处描述的载体携带的多肽中的表位包含由寄主中的抗原呈递细胞处理过的表位，特别是可以与主要组织相容性复合体I型分子结合被识别的T表位，例如靶细胞是CD8+T淋巴细胞的表位，或可以与主要组织相容性复合体II型分子结合被识别的T表位，例如靶细胞是CD4+T淋巴细胞的表位。在具体的实施方式中，多肽也包含涉及体液应答的B表位。在具体的实施方式中，载体分子携带多肽由若干不同的或若干相同的表位组成，或包含若干不同的或若干相同的表位。
根据本发明，载体携带的多肽包含至少两组不同的表位，即一组表位能够诱导T细胞免疫反应用于对哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗，然而第二组表位能够诱导T细胞记忆性免疫应答用于预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态。在具体的实施方式中，第一组表位除了诱导T细胞应答，从而为哺乳动物寄主经诊断的第一确定的病理状态提供免疫治疗，可选地，还可以诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞记忆性免疫应答，从而防止第一确定的病理状态复发。
根据本发明，所述载体携带的多肽中缺失第二组表位时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。这意味着文中定义的第二组表位对于获得预防第二确定的病理状态是必须的。
在具体的实施方式中，第二组表位(存在于载体携带的多肽中)是必须的也足以获得对第二确定的病理状态的预防；在这个实施方式中，唯一的第二组表位在诱导免疫应答中的贡献足以获得对第二确定的病理状态的预防。换句话说，给药于所述第二组表位和所述预防应答之间的关系之间存在因果关系。
在另一个实施方式中，第二组表位(存在于载体携带的多肽中)对于获得针对第二确定的病理状态的预防是必须的，但仅第二组表位不足以获得该预防或需要借助第一组表位的贡献，意思是针对第二确定的病理状态的预防可以通过以下由第二组表位诱导的免疫应答和由第一组表位诱导的免疫应答产生的协同作用获得。在后一个例子中，两组表位的贡献对于获得预防第二确定的病理状态时必须的。
第二组表位对于预防[术语预防定义见下文]第二确定的病理状态的必要贡献可以通过本发明中载体携带的多肽的给药对以下两组哺乳动物特别是以下两组小鼠的第二确定的病理状态的效应对比来证明：(1)给药本申请中不包含第二组表位的载体携带的多肽的哺乳动物和(2)给药本申请中包含第二组表位的载体携带的多肽的哺乳动物。
“其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防”，正如上述表述所理解的，它排除了文中定义的第一组表位足以(即单独的)获得针对第二确定的病理状态的预防。
因此，在具体的实施方式中，第一组表位的氨基酸序列(或由第一组表位组成的多肽)和第二组表位的氨基酸序列(或由第二组表位组成的多肽)是不同的。术语“不同”是指双方序列，通过计算多肽的全长序列(总体对比计算，例如通过Needleman和Wunsch算法)相差至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％。在另一种定义或具体的实施方式中，所述“不同的序列”至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％的第一组表位的序列不同于第二组表位的序列。在进一步具体的实施方式中，第一和第二组表位(或由第一组表位组成的多肽和由第二组表位组成的多肽)没有共同的表位序列。在具体的实施方式中，针对第一组表位的T细胞免疫应答能够有效预防和所述第一组表位相关的病理状态，但不能有效预防或不能特别有效预防和第二组表位相关的病理状态。因此，在具体的实施方式中，针对一组表位产生的T细胞免疫应答对该组表位是特异性的，即针对此组表位产生的免疫应答涉及的T细胞不能识别其他组的表位。
在具体的实施方式中，该多肽包含至少一种源自人***状瘤病毒株(HPV)的表位，特别是选自以下的HPV株：α-***状瘤病毒属(Alpha-papillomavirus)、β-***状瘤病毒属(Beta-papillomavirus)、γ-***状瘤病毒属(Gamma-papillomavirus)、δ-***状瘤病毒属(Delta-papillomavirus)、ζ-***状瘤病毒属(Zeta-papillomavirus)、η-***状瘤病毒属(Eta-papillomavirus)、θ-***状瘤病毒属(Theta-papillomavirus)、ι-***状瘤病毒属(lota-papillomavirus)、κ-***状瘤病毒属(Kappa-papillomavirus)、λ-***状瘤病毒属(Lambda-papillomavirus)、μ-***状瘤病毒属(Mu-papillomavirus)、ν-***状瘤病毒属(Nu-papillomavirus)、ξ-***状瘤病毒属(Xi-papillomavirus)、ο-***状瘤病毒属(Omikron-papillomavirus)和π-***状瘤病毒属(Pi-papillomavirus)。在具体的实施方式中，首选具有人类趋向性的***状瘤病毒，例如α-***状瘤病毒属(Alpha-papillomavirus)、β-***状瘤病毒属(Beta-papillomavirus)、γ-***状瘤病毒属(Gamma-papillomavirus)、μ-***状瘤病毒属(Mu-papillomavirus)或ν-***状瘤病毒属(Nu-papillomavirus)。在更具体的实施方式中，多肽包含至少一种来自α-***状瘤病毒属(Alpha-papillomavirus)，特别是来自α-***状瘤病毒属(Alpha-papillomavirus)的第7和第9种人***状瘤病毒株(HPV)的表位(de Villiers et al.Virology 2004)。因此，多肽包含至少一种源自人***状瘤病毒株(HPV)高度致癌型种型的表位，例如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52或HPV58。在这些种型中，对HPV18和HPV16特别感兴趣的。在实施方式中，文中描述的载体分子携带的多肽源自从上述提及的类型中选出的不同的HPV株或HPV种型。在另一个具体的实施方式中，其源自L1、L2、E1、E2、E4、E5、E6或E7蛋白的多肽，无论来自哪种HPV株或HPV种型，对于含有源自HPV株或HPV种型的E6或E7蛋白的表位的多肽都特别感兴趣。在具体的实施方式，如文中描述的载体分子携带的多肽源自相同的HPV蛋白，但是源自从上述提及的类型中选出的不同的HPV株或HPV种型。在本发明的具体的实施方式中，HPV16的E6或E7蛋白和HPV18的E6或E7蛋白，优选HPV16和HPV18的HPV模式种的E7蛋白用于设计多肽。根据本发明的具体的实施方式，载体分子携带若干多肽，优选基因***的多肽，每个都包含源自至少两种截然不同HPV株或HPV种型中的一种或若干种HPV蛋白中的一种至若干种表位，或由源自至少两种截然不同HPV株或HPV模式中的一种或若干种HPV蛋白中的一种至若干种表位组成。因此，具体的实施方式是载体分子携带的多肽是由携带一种多肽或若干多肽的CyaA蛋白或它的片段组成，其多肽包含源自HPV16和HPV18两种HPV种型中的E6或E7蛋白表位。在另一个实施方式中，本发明涉及一种组合物，包含携带一到若干种多肽的第一载体分子，其多肽包含源自HPV16的E6或E7蛋白表位(第一载体携带的多肽包含第一组表位)和另一种包含一到若干种多肽的载体分子，其多肽包含源自HPV18的E6或E7蛋白表位(另一种载体分子携带的多肽包含第二组表位)。当单个的载体分子携带若干多肽时，这些多肽可能由相同蛋白的不同部分组成，如E7或E6蛋白，这些部分***载体分子不同的位点，特别是许可位点。
因此，本发明中使用的组合物包含载体携带的源自HPV16的E7蛋白的多肽，以及载体携带的源自HPV18的E7蛋白的多肽。该组合物的例子包含：
(a)第一载体分子携带第一多肽，该第一多肽是包含第1到29位残基的片段，或是由源自HPV16的E7蛋白的第1到29位残基组成的片段，该载体分子还携带第二多肽，该第二多肽是包含第43到98位残基的片段，或是由源自HPV16的E7蛋白的第43到98位残基组成的片段。在优选的实施方式中，为HPV16的E7蛋白的前29位氨基酸残基的第一多肽***到CyaA第319位和320位密码子之间，由HPV16的E7蛋白的第43到98位残基组成的第二多肽***到CyaA第224位和235位密码子之间(例如：pKTRACE5-HPV16E7Δ30-42载体)；和
(b)分离的载体分子携带第一多肽，该第一多肽是包含HPV18的E7蛋白的第1到31位残基的片段或是由HPV18的E7蛋白的第1到31位残基组成的片段，该载体分子还携带第二多肽，该第二多肽是包含HPV18的E7蛋白的第43到105位残基的片段或是由HPV18的E7蛋白的第43到105位残基组成的片段。在优选的实施方式中，为HPV18的E7蛋白的前31位氨基酸残基的第一多肽***到CyaA第319位和320位密码子之间，由HPV18的E7蛋白的第43到105位氨基酸残基组成的第二多肽***到CyaA第224位和235位密码子之间(例如：pKTRACE5-HPV18E7Δ32-42载体)。
在另一个实施方式中，包含至少一种源自MAGE A3肿瘤抗原表位的多肽，例如由MAGE A3的第97到178位残基组成的多肽(SEQ ID NO：8)，或例如由MAGE A3的第190到221位残基与第242到295位残基(SEQ ID NO：9)融合而成的多肽。在具体的实施方式中，本发明中载体携带的多肽(或组合物中包含的多肽)由CyaA蛋白，优选百日咳博代杆菌(Bordetella.pertussis)的CyaA组成，其中源自MAGE A3的两个多肽***到两个不同的位点。这种载体携带的多肽由百日咳博代杆菌(Bordetella.pertussis)的CyaA组成，其中(1)由MAGE A3的第97到178位残基组成的第一多肽***到CyaA第319位和320位密码子之间，和(2)由MAGE A3的第190到第221位残基与第242到第295位残基融合组成的第二多肽***到CyaA第234位和235位之间。CyaA-MAGE A3载体的具体的例子见图4C(SEQ ID NO：7)。
文中定义的载体携带的多肽，所述多肽或包含在组合物中，用于在相同的哺乳动物寄主，特别是人类寄主中：(i)通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答来对所述哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗，和(ii)通过诱导针对包含在所述多肽中的第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态和(iii)可选地，通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞记忆性免疫应答来防止所述第一确定的病理状态的复发，所述免疫应答通过将所述载体携带的多肽给药于所述寄主获得，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定病理状态的所述预防。根据本发明的实施方式，由载体分子携带的文中定义的多肽，根据所需求的表位类型而被选择，表位可以分为以下两组：
-第一组表位涉及源自抗原的多肽，该抗原能够被表达或呈递给感染特定病原体的哺乳动物寄主的免疫***，发育成为特定的肿瘤或呈现第一确定的病理状态，在给药载体携带的多肽或文中定义的组合物之前，所述哺乳动物寄主已经被诊断所述特定感染、所述特定肿瘤或所述第一确定的病理状态；和
-第二组表位涉及源自抗原的多肽，该抗原能够被表达或呈递给感染另一特定病原体的哺乳动物寄主的免疫***，发育成为另一种特定的肿瘤或呈现第二确定的病理状态，在给药载体携带的多肽或或此定义的组合物之前，所述哺乳动物寄主没有感染或没有已经感染所述另一种特定病原体，没有发展成所述另一种特定类型的肿瘤或没有呈现所述第二确定的病理状态。
该发明源于以下观察：
(i)通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答来对所述哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗；
(ii)通过诱导针对包含在所述多肽中的第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态；
(iii)可选地，通过诱导针对包含在所述由载体分子携带的多肽中的第一组表位的T细胞记忆性免疫应答来防止所述第一确定的病理状态的复发；
由相同的载体分子携带或由不同的载体分子携带的所述第二组表位，和第一载体分子在相同的组合物中同时被给药。
因此，文中定义的载体分子或存在于组合物中的载体分子，或组合物中的载体分子携带至少一种，优选一种，包含第一组表位的多肽和至少一种包含第二组表位的多肽。在其他实施方式中，文中定义的载体分子或组合物中的载体分子，或组合物中的载体分子携带(a)一种包含第一组表位的多肽和至少一种包含第二组表位的多肽，(b)一种包含第一组表位的多肽和至少一种包含第二组表位的多肽，该至少一种多肽可以选自1种、2种、3种、4种、5种或6种多肽，(c)至少一种包含第一组表位的多肽，该至少一种多肽可以是2种或3种多肽，和至少一种包含第二组表位的多肽，和(d)至少一种包含第一组表位的多肽，该至少一种多肽可以是2种或3种多肽，和至少一种包含第二组表位的多肽，该至少一种多肽可以是1种、2种、3种、4种、5种或6种多肽。
当一种载体分子携带的多肽使用或用于组合物中时，该载体可能携带一种包含第一组表位和第二组表位的多肽，即所述第二组表位包含在和第一组表位相同的多肽中。
在另一个实施方式中，所述第一和第二组表位包含在不同的多肽中。包含第一组表位的多肽和包含第二组表位的多肽可能是由相同的载体分子携带。在另一个实施方式中，包含第一组表位的多肽和包含第二组表位的多肽可能由不同的载体分子携带，并包含在同一组合物中。当使用包含第一和第二不同的载体携带的多肽的组合物时，第一载体分子携带至少一种包含第一组表位的多肽，是指包含最低含量的第一组表位的多肽是由所述第一载体分子携带。在相同的组合物中，第二载体分子携带至少一种包含第二组表位的多肽，是指包含最低含量的第二组表位的多肽是由所述第二载体分子携带。最终，不管这些载体携带的多肽含有多少组表位，所述组合物可能可选地包含一种或多种(例如：1、2、3、4、5或6种)载体携带的多肽。
术语“免疫应答”，是指细胞介导的免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答。在具体的实施方式中，所述T细胞介导的免疫应答是细胞介导的细胞毒性免疫应答(CTL)，特别是CD8+免疫应答。例子是源于肿瘤抗原的多肽，该免疫应答优选是肿瘤特异性细胞毒性免疫应答，涉及肿瘤特异性的细胞毒性淋巴细胞。在具体的实施方式中，所述T细胞介导的免疫应答是CD4+免疫应答，特别是辅助T细胞免疫应答。在具体的实施方式中，在给药载体携带的多肽或文中定义的组合物之后产生的免疫应答，特别是针对第二组表位(如文中定义的)的免疫应答，是一种记忆性T细胞免疫应答。除了上述定义的细胞介导的免疫应答，术语“免疫应答”可能还包括体液免疫应答(产生抗体)。本申请中讨论的免疫应答是通过本发明中载体携带的多肽或组合物中载体携带的多肽给药于寄主中获得。
术语“免疫治疗”是指，通过诱导针对包含在所述被给药的载体分子携带的多肽中的第一组表位的特别是T细胞免疫应答用于治疗哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态。使用所述的载体携带的多肽或组合物的目的在于改善哺乳动物寄主的临床状态，该哺乳动物寄主已被诊断感染病原体或正处于病理状态，例如肿瘤，或目的在于消除或降低该病的致病抗原或有机体。在感染病原体的情况下，免疫治疗将导致感染部位或病原体复制部位的病原体数量显著降低，特别是寄主的血浆或粘膜部位，也可能导致病原体数量，例如血浆数量，少于之前检测的数量，或者可能导致肿瘤大小降低或延缓肿瘤增长。
术语“免疫预防”或“预防”是指通过诱导针对文中定义的被给药的载体分子携带的多肽中包含的第二组表位的特别是T细胞的免疫应答，预防或保护机体免于暴露、感染、发生或发展相同哺乳动物寄主第二确定的病理状态、疾病或临床症状。使用文中定义的载体携带的多肽或组合物导致了针对未来感染、未来病情恶化或疾病的预防性免疫应答，从而相应的防止所述哺乳动物寄主的病理状态发生。
应答对于预防的功效可以通过检测病理状态的标记物检测。在具体的实施方式中，选定相应的功效标准以满足统计相关性，。
术语“防止复发”是指通过诱导免疫应答使得机体免于未来新的暴露，未来新的感染，第一确定的病理状态未来新的开始或未来新的发展，该第一确定的病理状态之前已经诊断并已通过给药文中定义的载体携带的多肽或组合物治疗。
术语“哺乳动物”包含全部的哺乳动物，特别是灵长类和人类(例如病人)。
应该理解，给药文中定义的载体携带的多肽或组合物后，能够在同一个哺乳动物寄主在特定的时间窗内诱导针对第一组表位的T细胞免疫应答和针对第二组表位的T细胞记忆性免疫应答和针对第一组表位可选地应答。因此，至少给药一次文中定义的载体携带的多肽或组合物，导致诱导针对第一表位的T细胞免疫应答和针对第二组表位的T细胞记忆性免疫应答和针对所述第一组表位可选地记忆性T细胞免疫应答，这可以通过检测给药后1到12个月或更久时间(特别是2、3、6、9或12个月)证实，虽然涉及这两种免疫应答中的一种或两种的T细胞在给药若干年后仍可以被证实。术语“至少给药一次”或“给药一次”是指将文中定义的载体携带的多肽或组合物给药到哺乳动物寄主，尤其是病人，给药一次或多次，优选1到2次。每次给药至少一种载体携带的多肽连同第二组表位中的至少一种表位同时给药哺乳动物寄主，其中至少一种载体分子携带的至少一种多肽中包含第一组表位和第二组表位。在适当的情况下，第二次和随后可能的给药(加强免疫)可以采用与第一次给药中载体携带的多肽或组合物中相同的多肽。以下报导的实验表明免疫治疗、预防和可选地防止复发，都可能通过单次给药文中定义的载体携带的多肽或组合物获得。
在具体的实施方式中，本发明涉及文中定义的载体携带的多肽或组合物，可以用于(i)感染病原体，特别是感染细菌或病毒后，哺乳动物寄主所诊断的第一确定的病理状态的免疫治疗；(ii)感染不同的病原体，特别是感染不同的细菌或病毒(或它们的不同株)后，针对第二病理状态的预防；(iii)可选地，防止所述第一确定的病理状态的复发，其中当与所述不同病原体(例如：不同的细菌或不同的病毒)的相关的第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。在感染不同病毒株的具体的实施方式中，特别是不同的人***瘤病毒(HPV)株和不同的人***瘤病毒(HPV)型种类，本发明涉及文中定义的载体携带的多肽或组合物用于(i)对哺乳动物寄主中诊断的随感染第一个病毒、第一个人***瘤病毒(HPV)株或第一个人***瘤病毒(HPV)型种类而来的第一病理状态进行的免疫治疗；(ii)预防随感染第二种不同的病毒、第二种不同的HPV株或第二种不同的HPV型菌株而来的第二病理状态；(iii)可选地，防止第一的病理状态的复发，其中，当与所述第二种不同的病毒、第二种不同的HPV株或第二种不同的HPV型菌株相关的第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。在优选的实施方式中，本发明涉及如文中定义的载体携带的多肽或组合物，包含源自HPV16的E7蛋白的多肽和源自HPV18的E7蛋白的多肽，可以用于(1)(i)对哺乳动物寄主中诊断的随感染HPV16而来的第一病理状态进行的免疫治疗；(ii)预防随感染HPV18而来的第二病理状态的预防；(iii)可选地，防止所述第一病理状态的复发，其中，当源自HPV18的E7蛋白的多肽没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防；或(2)(i)对哺乳动物寄主中诊断的随感染HPV18而来的第一病理状态进行的免疫治疗；(ii)预防随感染HPV16而来的第二病理状态；(iii)可选地，防止所述第一病理状态的复发；其中，当源自HPV16的E7蛋白的多肽没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。
在具体的实施方式中，本发明涉及文中定义的载体携带的多肽或组合物，可以用于(i)对哺乳动物寄主中诊断的随感染第一种肿瘤细胞而来的第一病理状态进行的免疫治疗；(ii)预防随感染第二种肿瘤细胞而来的第二病理状态，其中该第二种肿瘤细胞的起源或组织学不同于第一种肿瘤细胞；和(iii)可选地，防止所述第一病理状态的复发；其中，当与所述第二种肿瘤细胞相关的第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。
在具体实施方式中，本发明涉及文中定义的载体携带的多肽或组合物，可以用于(i)对哺乳动物寄主中诊断的随感染病原体，特别是感染细菌或病毒而来的第一病理状态进行的免疫治疗；(ii)预防随肿瘤细胞发展而来的第二病理状态和(iii)可选地，防止所述第一病理状态的复发，其中，当与所述肿瘤细胞相关的第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。
在具体的实施方式中，本发明涉及文中定义的载体携带的多肽或组合物，可以用于(i)对哺乳动物中诊断的随肿瘤细胞发展而来的第一病理状态；(ii)预防随病原体感染，特别是细菌或病毒感染而来的第二病理状态；(iii)可选地，防止所述第一病理状态的复发，其中，当与所述不同病原体(例如：不同的细菌或不同的病毒)相关的第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。
本发明同样涉及一种方法在相同哺乳动物中获得，(i)特别是通过诱导针对第一组表位的T细胞免疫应答来对哺乳动物寄主所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗和(ii)特别是通过诱导针对第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防第二确定的病理状态，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防，所述方法包括向哺乳动物寄主给药至少一次：
(1)载体携带的多肽，所述携带多肽的载体包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中，所述第一组表位和第二组表位包含在由所述载体携带的至少一种多肽中，所述第二组表位中的至少一种表位和第一组表位中的表位不同；
(2)组合物包含如(1)定义的载体携带的多肽以及药学上可接受的载体；或
(3)组合物包含(a)第一载体携带的多肽，其中所述携带多肽的第一载体包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中，所述第一组表位包含在由所述第一载体携带的至少一种多肽中，和(b)第二另外的载体携带的多肽，其中所述携带多肽的第二载体分子包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中，所述第二组表位包含在由所述第二载体携带的至少一种多肽中。
在具体的实施方式中，本发明涉及在相同哺乳动物中获得的方法，(i)特别是通过诱导针对第一组表位的T细胞免疫应答来对哺乳动物寄主所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗，(ii)特别是通过诱导针对第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防第二确定的病理状态和(iii)可选地，特别是通过诱导针对第一组表位的T细胞记忆性免疫应答来防止所述第一确定的病理状态的复发，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防，所述方法包括向哺乳动物寄主给药至少一次：
(1)载体携带的多肽，其中所述携带多肽的载体包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中，所述第一组表位和第二组表位包含在所述载体携带的至少一种多肽中，所述第二组表位中的至少一种表位和第一组表位中的表位不同；
(2)组合物包含如(1)定义的载体携带的多肽以及药学上可接受的载体；或
(3)组合物包含(a)第一载体携带的多肽，其中其中所述携带多肽的第一载体包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中，所述第一组表位包含在由所述第一载体携带的至少一种多肽中，和(b)第二另外的载体携带的多肽，其中所述携带多肽的第二载体分子包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中，所述第二组表位包含在由所述第二载体携带的至少一种多肽中。
文中定义的组合物，在具体的实施方式中，包含药学上可接受的载体或配方，或生理上可接受的稀释剂，该稀释剂选自缓冲剂、盐、磷酸盐缓冲液、右旋糖、甘油、水、乙醇和类似物及组合物。
而且，用于获得免疫治疗和预防的文中定义的载体携带的多肽或组合物可能结合或混合在一起使用，或用于获得免疫治疗和预防的文中定义的组合物可能进一步包含至少一种免疫增强剂，例如至少一种佐剂，优选一种佐剂，和/或表面活性剂和/或免疫调制剂物质(例如细胞因子或趋化因子)。
本领域已知的各种佐剂包括弗氏完全佐剂(complete freund′s adjuvant-CFA)，弗氏不完全佐剂(Incomplete freund′s a djuvant)、蒙坦得(montanide)ISA(不完全seppic佐剂)、胞壁酰肽例如胞壁酰二肽(MDP)MDP-Lys(L18)(Nα-乙酰胞壁-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-Nesteoroyl-L-赖氨酸)、硫酸锌、胶体氢氧化铁、磷酸钙或氯化钙、CpG寡脱氧核苷酸(CPGODN)例如CPG ODN 1826和CPG ODN2007，MF59是在包含5％的角鲨烯(w/v)、0.5％的Tween80(w/v)、0.5％Span(w/v)(在水中)和TLR4配体(例如MPL、GLA)TLR3配位体(例如Hiltonol
)、多糖(例如菊粉)和脂质体(例如阳离子脂质体，ISCOMs)的水包油乳化液中稳定的清洁剂。
在具体的实施方式中，至少一种佐剂选自具备活化T细胞免疫应答，特别是T细胞记忆性免疫应答能力的分子。优选的佐剂是指能够结合或拮抗免疫细胞(例如APC)中的TLR(Toll样受体)3、4、7、8和/或9。在具体的实施方式中，佐剂是TLR配体，选自下组：TLR3型配体例如Poly-ICLC、TLR4配体、TLR9配体例如CpG和TLR7/8型配体例如咪喹莫特。购买的佐剂咪喹莫特为包含5％咪喹莫特(AldaraTM)的乳液状，而Poly-ICLC则为oncovir公司(Inc，WA，US)出售的Hiltonol。
术语“联合的”是指文中定义的载体携带的多肽或组合物联合免疫增强剂在不同的时间和/或以不同的给药方式，优选在同一个接触位点共同接触寄主。在具体的实施方式中，文中定义的载体携带的多肽或组合物注射到寄主，免疫增强剂(如佐剂)则在局部，例如经皮，施用到寄主(皮肤表面)。例如，文中定义的载体携带的多肽或组合物注射到寄主，免疫增强剂(如佐剂)随后施用在寄主的皮肤上的注射位点。相比而言，“混合的”是指文中定义的载体携带的多肽或组合物和免疫增强剂在给药时存在于相同的配方中。
值得注意的是在本申请中，当免疫增强剂(例如佐剂)和文中定义的载体携带的多肽或组合物是混合的或联合的时，至少每次向寄主给药本发明中的载体携带的多肽或组合物时都会用到免疫增强剂。在具体的实施方式中，本发明中载体携带的多肽或组合物每天给药两次，每次给药当天在本发明载体携带的多肽或和组合物给药的位点施用免疫增强剂(或者混合在一起或者联合在一起，优选经皮)。在另一个具体的实施方式中，本发明的载体携带的多肽和组合物每天给药两次，每次给药当天和每次给药次日在给本发明载体携带的多肽或和组合物的位点施用免疫增强剂(混合的或者联合的，优选经皮)。在具体的实施方式中，文中定义的载体携带的多肽或组合物每天给药两次，在每次给药当天和每次给药次日在给药本发明载体携带的多肽或和组合物的位点经皮施用佐剂(优选咪喹莫特，例如AldaraTM)。
此外，为获得免疫治疗和预防以及可选地预防再次发生，文中定义的载体携带多肽或组合物是指可能在给药方案中另外和其他适于治疗病原体感染、肿瘤细胞或与这个感染或肿瘤相关的病理状态，例如抗癌或抗病毒的相关的活性化合物，联合使用或混合使用。
文中定义的载体携带的多肽或组合物可以通过不同方式注射到病人体内：如皮下(s.c.)，皮内(i.d.)，肌肉(i.m.)或静脉(i.v.)注射，口服和粘膜给药，特别是鼻腔给药或鼻腔吸入。在具体的实施方式中，文中定义的载体携带的多肽或组合物通过皮内注射。
在具体的实施方式中，文中定义的载体携带的多肽或组合物和至少一种免疫增强剂混合使用或联合使用，或者没有和任何免疫增强剂混合或联合，不论采取哪种给药途径，独立于哺乳动物寄主(第一次)确定的的病理状态，都在同一个位点给药，即对于肿瘤，是在除了肿瘤发展以外的位点(例如除了粘膜)；对于病原体，是在除了病原体复制位点以外的位点。
文中定义的载体携带的多肽或组合物可以固体形式(扁囊剂、粉末、胶囊、丸状、栓剂、速释片剂、肠溶性片剂、缓释片剂)，粉状，优选冷冻干燥之后的形式(冻干的形式或冻干的粉状)，它需要在注射前使用稀释液重新配制，或液体形式，例如可注射的溶液或可注射的混悬液。
用于给药的载体携带的多肽的量(剂量)取决于被治疗的个体，包括患者的病情、个体免疫***状态，给药途径和寄主个体大小。传统的剂量范围包括1到1200μg、100到1000μg、200到1000μg、500到1000μg。具体剂量选自下组：100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000μg。在另一个实施方式中，载体携带的多肽的传统剂量范围从1到100μg、1到50μg和1到10μg。本领域的技术人员可以根据具体情况修改这些例子。
每个特定实施方式可能会结合任一个具体的实施方式。
例子
A.材料与方法
小鼠
从Charles River实验室购买六周龄雌性C57BL/6型小鼠(H-2b)。小鼠培养在无病原体环境中，可以自由饮水和摄食。动物和及其照料的步骤遵循Genticel指南，其符合国家和国际法规和政策，并经当地伦理委员会审核。
肿瘤细胞系
通过HPV16的E6和E7的致癌基因和活化的人类c-Ha-Ras致癌基因转化小鼠肺部原代细胞C57BL/6制备TC-1(组织培养一号)肿瘤细胞(Lin，Guarnieri et al.1996)。该研究使用的细胞从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)获得。TC1细胞在每次实验之前解冻，然后在至少注射10天前培养并体外扩增。
EG7是由卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)-转染EL4淋巴瘤鼠科细胞系(C57BL/6的遗传学背景)获得的，它用于诱导实体瘤表达卵清蛋白。该模型的介绍非常广泛并作为癌症的鼠科肿瘤模型(Schreiber，Deyev et al.2009)。EG7细胞在每次实验前解冻，然后在至少注射10天前培养并体外扩增。
肿瘤细胞接种
在第0天，于C57BL/6小鼠右腋皮下注射用100ul PBS 1X稀释的TC-1细胞(用于HPV_TUR008研究的每只小鼠注射0.5x106个细胞，用于其它研究的每只小鼠注射1x106个细胞)。一些实验中，小鼠在第60天右腋皮下注射稀释在100ulPBS 1X的EG7细胞。
制备载体
-重组CyaA-HPV16E7Δ30-42(C16-1)和CyaA-HPV18E7Δ32-42(C18-1)(图3A和图3B)的构建和纯化已在EP 1576967B1中介绍。在Genticel，CyaA-HPV16E7Δ30-42(C16-1)和CyaA-HPV18E7Δ32-42(C18-1)两个半成品以1∶1比例混合在一起，从而获得ProCervix，然后分装等份存储在-80℃。
-CyaA-CysOVA嵌有卵清蛋白(OVA)的OVA257-264(SIINFEKL)H-2b的限制性表位。它被编码为BTpr_103，HPV043_Cova_PB_8M批次在Genticel纯化。CyaA-CysOVA这个批次的特点是小鼠在Genticel(内部结果)表现免疫原性(图4)。
-CyaA-MAGEA397-178/190-295载体(图4C和SEQ ID NO：7)包含两种多肽：
(1)MAGE A397-178表位***到百日咳博代杆菌(B.pertussis)CyaA蛋白第319和320位残基之间：LGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISG(SEQ ID NO：8)；和
(2)由MAGEA3的第190到221位残基和MAGEA3的第242到295位残基融合的MAGE-A3190-295*的表位，***到CyaA蛋白第224位和235位残基之间：TFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIF(SEQ ID NO：9)。
接种疫苗
在第11天，肿瘤测量之后，含有可检测的实体瘤的小鼠通过皮下注射耳朵皮肤接种疫苗(两只耳朵都注射)。在一些实验中，小鼠在接种肿瘤细胞TC-1后，分别在第11天和第39天两次接种疫苗。至于ProCervix，小鼠给药5μg的CyaA-HPV16E7Δ30-42和5μg的CyaA-HPV18E7Δ32-42。
佐剂分子
AldaraTM是一种分子活化先天免疫的药剂学配方，它通过优先结合TLR7进入免疫细胞，例如APC。这个活化分子是咪喹莫特，它是一个小的合成的化合物。AldaraTM市面上是一种在250mg单剂量使用包装中含5％咪喹莫特的乳液(12.5mg的活性咪喹莫特)。诱导小鼠在接种ProCervix疫苗后出现佐剂效应的剂量是每个免疫位点接种25mg的AldaraTM，所以每个注射位点各自接种了1.25mg的活性咪喹莫特(每只小鼠接种50mg)。免疫接种当天和免疫接种24h之后在局部(经皮)施用AldaraTM。准备单个管子，每支管装有25mg AldaraTM用于耳朵皮肤上(每只小鼠准备两支管)。为了能够精细测量AldaraTM乳液在每个ProCervix注射位点(对应于每只小鼠的每只耳朵)的真实含量；每支eppendorf小管在添加乳液前后都要称量。耳朵皮肤施用AldaraTM乳液之后，重新称量eppendorf小管的重量，从而计算涂抹到皮肤中的大概乳液含量。对于每支小管中全部乳液涂抹至少15秒直到皮肤完全渗透。
Poly-ICLC(TLR3激动剂)由Oncovir公司提供(Inc，WA，US)的小瓶装，其中含有1ml的2mg/ml的乳白色的无菌溶液。Poly-ICLC留在原始的容器并保存在+4℃。用于注射的Poly-ICLC包含稳定在1.5mg/ml的聚-L-赖氨酸和0.9％氯化钠溶液中的5mg/ml羧甲基纤维素钠中的2mg/ml的Poly-IC，然后用氢氧化钠调pH值到7.6-7.8。
测量肿瘤
评估小鼠中肿瘤发展情况需要考虑多种不同参数：
-肿瘤大小：从接种肿瘤细胞第5天开始直到第60天，采用卡规一周两次人工测量肿瘤大小。肿瘤体积通过以下公式计算：体积＝(长度X宽度2)/2；
-小鼠存活率：基于伦理学原因，患有严重非正常肿瘤(最低尺寸：2000mm3)和坏死性肿瘤、或肿瘤引发活动障碍的小鼠被施以安乐死；和
-未患肿瘤的小鼠数量：该信息表明治疗性疫苗接种已经诱导了全部的肿瘤退化(没有明显的肿瘤)。
测量CD8 T细胞记忆性细胞毒性反应
检测CD8+体内细胞毒性的方法已经广泛介绍过(Barchet，Oehen et al.2000；Ingulli2007)。简单地说，取自首次接受实验小鼠的同源脾细胞用不同浓度的CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，分子探针invitrogen公司)标记，并采用相关的H-2b限制性肽体外脉冲或不脉冲。肽脉冲的靶细胞群和肽没有脉冲的靶细胞群体通过静脉过继转移到同源的接种过疫苗的寄主，肽脉冲到脾脏的靶细胞的缺失通过流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测。杀伤细胞的百分比通过脉冲过的靶细胞占未脉冲过的靶细胞百分比的比率的降低来评估，并通过初始比值修正(见下文)。细胞制剂在注射前采用流式细胞仪分析，以检测CFSE在不同靶细胞的负载并获得计算体内杀伤的参考值(每个细胞种群的实际比例)。三个靶细胞群体然后以1∶1∶1的比例通过静脉注射到每个接种过疫苗的小鼠。体内杀伤的比例通过已在其他地方介绍过的以下公式计算(Barber，Wherry et al.2003)
IFN-YELISpot(酶联免疫斑点)实验
通过IFN-γELISpot实验在离体被再次刺激的脾细胞中检测HPV16 E749-57和HPV18E7AS43-49 IFN-Y产生特异性CD8+T细胞的频率：
-ELISpot在单个小鼠中进行，而非在合并的脾脏中。
-小鼠在静脉灌输同源的带有CFSE的靶脾细胞之前收到(由于体内杀伤实验，见上文)。简单来说，从接种过疫苗的小鼠中获得的全部的脾细胞没有受到刺激或采用5％CO2和1μg/ml如下所述的多肽在37℃再次刺激20h：
-带有HPV16 E749-57肽(H-2b限制性相关的表位)的1x106个细胞/孔
-带有OVA257-264(H-2b限制性非相关的表位)的1x106个细胞/孔
-带有HPV18E7AS43-49(H-2b限制性相关的表位)0.25x106个细胞/孔
IFN-γ分泌通过夹心酶联免疫斑点监控，通过使用链霉亲和素-AKP的BCIP/NBT显示所述夹心酶联免疫斑点。数据采用Bioreader 5000-Pro S(Biosys)进行分析。
治疗性/预防性疫苗接种
如下文所述的治疗计划，已概括成图8。
在第0天，两组小鼠(组1和组2)右腋接种TC-1细胞(每只小鼠1x106个细胞)。然后，小鼠接受两次接种，在第11天第一次接种，第39天第二次接种，采用安慰剂(PBS1X+尿素)(组1)或者安慰剂+AldaraTM(组2)。组1和组2都是阴性对照。
在第0天，四组小鼠(组3至组6)右腋接种TC-1细胞(每只小鼠1x106个细胞)(组3至组6)；然后，小鼠接受两次接种，在第11天第一次接种，第39天第二次接种，采用CyaA-MAGEA397-178/190-295/CyaA-HPV16 E7(每种基于CyaA的载体5μg)联合AldaraTM(组3)，采用CyaA-cysOVA/CyaA-HPV16 E7(每种基于CyaA的载体5μg)联合AldaraTM(组4)或采用联合AldaraTM-佐剂的ProCervix疫苗(组5和组6，作为TC-1肿瘤消除的阳性对照)。监控这些小鼠的右腋一直到第100天(图9)。在第60天，存活的小鼠接种第二种肿瘤细胞系，如表达MAGEA3的B-16肿瘤细胞(组3和组5)或EG7肿瘤细胞(表达卵清蛋白的恶性同源细胞)(组4和组6)。监控这些小鼠的左腋一直到第100天。
当使用它时，AldaraTM在局部(经皮)施用在接种疫苗的位点，在接种疫苗当天以及接种疫苗次日(即第12天和第40天)。
B.结果
带有表达HP V E7的实体瘤的小鼠接种ProCervix后显示肿瘤退化率高和存活率提高
在第11天，接种PBS和AldaraTM的小鼠不能抑制肿瘤生长，10只小鼠中只有2只小鼠在第50天前完全消除了肿瘤(图5A和图6A)。该组小鼠在第50天时，有4只小鼠存活(图6B；停止监控肿瘤大小)。本研究中没有包含只用PBS治疗的小组，因此，和小鼠对抗肿瘤的自然应答相比，很难清楚确定AldaraTM的影响。然而，很明显的是AldaraTM的作用要远远低于ProCervix联合AldaraTM佐剂(见下文)。这表明即使是AldaraTM对肿瘤进展具有旁观者效应，可能是由于先天免疫激活和导致的炎症过程(促炎细胞因子等。(Schonand Schon 2008))，它不足以单独使用作为治疗方案来治疗HPV诱导的实体瘤。
在第11天采用无佐剂的ProCervix接种的小鼠，在第50天同样表现有重大的肿瘤增长，并没有小鼠消除肿瘤(图5B和6A)。该组只有两只小鼠在第50天存活(图6B)。局部应用佐剂咪喹莫特(AldaraTM)并接种ProCervix的治疗性疫苗可以诱导显著的肿瘤退化(图5D)并导致高的存活率(图6B)，在研究末期大部分小鼠都是不成瘤的(图6A)。对于ProCervix疫苗联合AldaraTM佐剂的小组，在明显控制(肿瘤大小降低到50mm3以下)一段时期之后，我们观察到10只小鼠中有3只小鼠中出现肿瘤逃逸。这种逃逸发生在第30天至第40天并伴随重大增长直到第50天。该现象可能是由于肿瘤发展的逃逸机制，在该研究中应该将此考虑到治疗方案的修改中，但是正如之前描述的TC-1细胞(Zwaveling，Farreira Mota et al.2002)，它更可能是由于肿瘤细胞表面缺失MHC-I类分子。治疗性免疫接种ProCervix联合Poly-ICLC佐剂的提供了关于肿瘤退化和存活率的类似结果(图5C和6)。这些结果表明ProCervix联合Poly-ICLC佐剂或咪喹莫特(AldaraTM)局部佐剂的治疗性免疫接种带有表达HPV 16E7实体瘤的小鼠可以获得强大的治疗效应。
ProCervix治疗性免疫接种促进HPV16 E7和HPV18 E7特异性的功能记忆性CTL(细胞毒性T淋巴细胞)的发育
根据RafieldAhmed和其同事的描述，在急性感染病毒LCMV(淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒)的小鼠动物模型中，记忆性CD8+T细胞能够在体内展示快速裂解的潜能(Barber，Wherry et al.2003)。基于这些观察，第11天给药ProCervix后，我们决定调查小鼠是否已经完全清除TC-1诱导的实体瘤，在消除肿瘤后是否显示功能性的抗原特异性的记忆性CD8+T细胞。
为此，在接种TC-1细胞之后第60天，每组中剩余的不成瘤的小鼠过继转移带有CFSE的同源脾细胞，以并行测量体内记忆性CD8+T细胞的细胞毒性(如上材料和方法部分中所述)对以下两种H-2b限制性表位：HPV16 E749-57和HPV18 E7AS43-49的抵抗。在免疫接种ProCervix联合AldaraTM佐剂或Poly-ICLC佐剂的小鼠组中，选择5只不成瘤小鼠(在该组中随机选择)进行该体内杀伤实验。在所有受测的小鼠中，全部消除肿瘤的小鼠都检测到强烈的抗HPV16 E749-57脉冲的靶细胞的细胞毒性(图7)。每组之间没有差异。在接种安慰剂联合AldaraTM的一组小鼠检测HPV16 E7特异性细胞毒性反应是由于该试验使用两只不患肿瘤的小鼠(其他小鼠由于肿瘤生长而导致在第60天时死亡)。该数据表明这两只小鼠能够产生足够强的HPV16 E7特异性免疫应答以清除TC-1诱导的实体瘤。有趣的是，只有免疫接种带有佐剂的ProCervix疫苗的小鼠同样展示HPV18 E7脉冲的靶细胞。由于TC-1细胞不表达HPV18抗原，这些数据更有意义，因此表明报导的HPV18特异性的细胞毒性只可能是由于疫苗诱导的记忆性T细胞。事实上，在只用AldaraTM佐剂治疗的小鼠中没有观察到针对HPV18E7-脉冲的靶细胞的体内细胞毒性(图7)。
总之，我们的数据表明ProCervix仅一次注射在诱导功能性的CD8-依赖的抗HPV16 E7和HPV18 E7抗原的记忆性应答是非常高效的。ProCervix疫苗一次注射能够诱导一批抗原特异性的记忆CD8+T淋巴细胞的分化，使得接种疫苗的小鼠不仅能够长期抵抗来自表达HPV16 E7的同源移植的细胞的第二次攻击(肿瘤表达的抗原)，而且能够同时保护细胞抵抗来自表达HPV18 E7的同源移植的细胞的新攻击(非肿瘤表达的抗原，仅由CyaA-HPV 18E7Δ32-42载体传递)。
CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-MAGE A3二价治疗性疫苗接种能够消除表达HPV16 E7的实体瘤，并能抵抗MAGE-A3诱导的肿瘤的发育
接种CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-MAGE A3+Aldara透皮佐剂(组3)的小鼠和接种ProCervix联合Aldara佐剂的小鼠(组5和组6)在40天内清除了TC1-诱导的实体瘤：组3中的10只小鼠中有9只(图9c)；组5中的10只小鼠中有8只，组6中的10只小鼠中有9只(图9e和f)。强大的清除肿瘤的能力证实能够保持100天。相比之下，接种安慰剂的小鼠，使用或不使用佐剂(分别为组1和组2)作为阴性对照，形成TC1-诱导的实体瘤的小鼠为：组1中的10只小鼠中有9只(图9a)和组2中的10只小鼠中有8只(图9b)。
在第60天，组3和组5中存活的小鼠在它们的左腋接种表达MAGE A3蛋白的B16-肿瘤细胞。在已清除TC1-诱导的肿瘤细胞并免疫接种CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-MAGEA3联合AldaraTM佐剂的小鼠中，没有小鼠显示在攻击后形成B16-MAGE A3肿瘤(9只小鼠中没有小鼠形成B16-MAGE A3肿瘤，图10a)，这表明这些小鼠受保护免于B16-MAGEA3诱导的实体瘤的攻击。
相比之下，已清除TC1-诱导的肿瘤细胞并免疫接种ProCervix联合AldaraTM佐剂的小鼠形成了B16-MAGE A3肿瘤(8只小鼠中有6只小鼠形成B16-MAGEA3肿瘤；图10c)，表明ProCervix(HPV16E7/HPV18 E7)不能提供针对B16-MAGE A3肿瘤细胞攻击的记忆性T细胞免疫保护。因此，组3中观察到的防止MAGE-A3诱导的肿瘤的发育是通过在免疫接种过CyaA-MAGE A3的小鼠中诱发针对MAGE A3特异性的T细胞介导的记忆性应答获得，其中组5中诱导的T细胞介导的记忆性应答是针对抗原(HPV18E7)，该抗原和B16-MAGEA3肿瘤细胞在本质上是不相关的。
总之，这些实验表明CyaA二价疫苗一次给药之后，可能用于消除TC-1细胞(HPV18E7-特异性免疫应答)，和阻止B16-MAGE A3肿瘤细胞的形成(MAGE A3-特异性T细胞介导的记忆性应答)。此外，第60天获得的结果表明针对B16-MAGE A3肿瘤细胞获得的预防效应不会损害针对TC-1细胞获得的治疗效应(第100天消除TC1细胞；图9c)。CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-cysOVA二价治疗性疫苗能够消除表达HPV16 E7的实体瘤并提供防止EG7-OVA诱导的肿瘤发育的保护
免疫接种CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-cysOVA联合AldaraTM透皮佐剂的小鼠(组4)和接种ProCervix联合Aldara佐剂的小鼠(组5和组6)在40天内清除TC1-诱导的实体瘤：组4中的10只小鼠中有9只(图9d)；组5中的10只小鼠中有8只，组6中的10只小鼠中有9只(图9e和f)。强大的清除肿瘤的能力证实能够保持100天。相比之下，接种安慰剂的小鼠，使用或不使用佐剂(分别为组1和组2)作为阴性对照，形成TC1-诱导的实体瘤的小鼠为：组1中的10只小鼠中有9只(图9a)和组2中的10只小鼠中有8只(图9b)。
在第60天，组4和组6中存活的小鼠在它们的左腋接种(表达卵清蛋白的恶性同源细胞)EG7-OVA肿瘤细胞。在第6组的小鼠6004在第60天后形成肿瘤(图9f)，以致于它同该组其他9只没有形成肿瘤的小鼠一样接种EG7-OVA了肿瘤细胞。已清除TC1-诱导的肿瘤并接种CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-CysOVA联合AldaraTM佐剂的小鼠，没有小鼠显示在攻击后形成EG7-OVA肿瘤(9只小鼠中0只形成EG7-OVA肿瘤；图10b)，表明这些小鼠被保护免于EG7-OVA肿瘤细胞的攻击。相比之下，已清除TC1-诱导的肿瘤细胞并免疫接种ProCervix联合AldaraTM佐剂的小鼠形成了EG7-OVA肿瘤(10只小鼠中有8只小鼠形成EG7-OVA肿瘤；图10d)，表明ProCervix(HPV16E7/HPV18E7)不能提供针对EG7-OVA肿瘤细胞的记忆T细胞免疫保护。因此，组4中观察到的防止EG7-OVA-诱导的实体瘤细胞的发育是通过在免疫接种过CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-CysOVA的小鼠中诱发OVA-特异性的T细胞介导的记忆性应答获得，其中，组6中诱导的T细胞介导的记忆性应答是针对抗原(HPV18E7)，该抗原和EG7-OVA肿瘤细胞在本质上是不相关的。
总之，这些实验表明二价CyaA疫苗一次给药之后，可能用于消除TC-1细胞(HPV18E7-特异性的免疫应答)，和阻止EG7-OVA诱导的实体瘤的形成。而且，第60天后获得的结果表明针对EG7-OVA肿瘤细胞的预防效果不会损害针对TC-1细胞的治疗效应(第100天消除TC1细胞；图9d)。
C.结论
本申请中引入的新概念：ProCervix二价疫苗治疗性免疫接种，在一方面能够治疗例如感染HPV16的病人并消除感染，在另一方面，提供针对HPV16 E7和HPV18 E7抗原的T细胞介导的记忆性应答，因此确保ProCervix免疫接种的病人能够长期抵抗HPV16可能造成的再次感染以及随后的HPV18感染。
通过另外两种其他的二价疫苗免疫接种(CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-MAGE A3和CyaA-HPV16E7Δ30-42/CyaA-CysOVA)已证实：一方面，治疗感染HPV的小鼠(消除TC1细胞)，另一方面，分别保护机体防止形成B16-MAGEA3肿瘤或EG7-OVA肿瘤细胞。
使用患有***的临床前小鼠模型[TC-1肿瘤细胞(Lin，Guarnieri et al.1996；Zwaveling，Ferreira Mota et al.2002)]，表明患有表达HPV16 E7的实体瘤的小鼠治疗性免疫接种ProCervix疫苗联合佐剂分子[TLR激动剂如AldaraTM(Johnston and Bystryn 2006；Heib，Becker et al.2007；Schon and Schon 2008)或Poly-ICLC(Longhi，Trumpfheller et al.2009)]会引起高效的肿瘤退化。
而且，已表明，疫苗诱导的肿瘤清除和在肿瘤已完全清除的小鼠中长期存在的HPV16E7-特异性CTL记忆性应答有关。出乎意料的是，同样证实这些不成瘤的小鼠中，ProCervix治疗性免疫接种会平行地产生功能性的HPV18 E7-特异性的CTL记忆性应答。HPV16 E7和HPV18 E7记忆性CTL都表现出体内裂解的潜力。
观察惊人地发现CyaA携带的多肽能够产生针对哺乳动物寄主中第二组表位的预防性的T细胞记忆性应答(预防性免疫应答)，同时通过诱导针对第一组表位的T细胞免疫应答来对哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗。事实上，已知不同表位之间都存在竞争，或者是关于接近APC，经APC处理或呈递以及细胞因子的可获得性。该现象导致出现优势抗原表位和亚优势表位的层级，并使得T细胞免疫应答被激活和其他T细胞免疫应答被抑制。该现象在目前环境中可以预料到，其中T细胞在给药载体携带的多肽之前能够识别已经存在病人体内的第一组表位(因为第一组中的一种至多种表位已经呈递给寄主的免疫***)，然而关于第二组表位的初始T细胞需要活化。有趣的是，本发明表明，和所预料的相比，针对包含在CyaA携带的多肽中的第二组表位的预防性的免疫应答似乎并不讨厌针对第一组表位的治疗性的免疫应答。这些结果表明第一组表位诱导的免疫应答和第二组表位诱导的免疫应答之间不存在竞争。因此，发明人表明CyaA携带的多肽足以在哺乳动物寄主所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗高效地诱导T细胞免疫应答，以及在相同的哺乳动物寄主预防第二确定的病理状态的复发中诱导T细胞记忆性免疫应答。
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Claims (22)
1.一种载体携带的多肽，其特征在于，所述携带多肽的载体包含在适合将所述多肽呈递给哺乳动物寄主的免疫***的CyaA蛋白或它的片段中，用于(i)通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答来对所述哺乳动物寄主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗，和(ii)通过诱导针对包含在所述多肽中的第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态，所述免疫应答通过将所述载体携带的多肽给药于所述寄主后获得，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。
2.如权利要求1所述的载体携带的多肽，其特征在于，可以进一步用于(iii)通过诱导针对包含在所述多肽中的所述第一组表位的T细胞记忆性免疫应答来防止所述第一确定的病理状态的复发。
3.如权利要求1或2所述的载体携带的多肽，其特征在于，所述第二组表位包含在包含第一组表位的多肽中。
4.如权利要求1或2所述的载体携带的多肽，其特征在于，所述第一组表位和第二组表位包含在不同的多肽中。
5.如权利要求1到4中任一项所述的载体携带的多肽，其特征在于，一个载体分子携带所有的多肽。
6.一种组合物，其以与药学上可接受的载体或配方的组合形式包含至少一种如权利要求1到5中任一项所述的载体携带的多肽，用于(i)通过诱导针对包含在所述多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答来对所述哺乳动物寄主中诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗，和(ii)通过诱导针对包含在所述多肽中的第二组表位的T细胞记忆性免疫应答来预防在相同哺乳动物寄主中的第二确定的病理状态，所述免疫应答通过将所述组合物给药于所述寄主后获得，其中，当所述第二组表位没有包含在所述被给药的组合物的载体携带的多肽中时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。
7.如权利要求6所述的组合物，其包含至少两种载体携带的多肽，其特征在于，第一组表位包含在第一载体携带的多肽中，第二组表位包含在另外的载体携带的多肽中。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述第一组表位包含在由所述第一载体携带的多肽所携带的另外的多肽中，和/或第二组表位包含在由所述另外的载体携带的多肽所携带的另外的多肽中。
9.如权利要求1到5中任一项所述的载体携带的多肽或如权利要求6到8中任一项所述的组合物，其特征在于，所述CyaA是博代杆菌属(Bordetella)CyaA，特别是源自百日咳博代杆菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博代杆菌(Bordetella parapertussis)或支气管败血性博代杆菌(Bordetella bronchiseptica)。
10.如权利要求1到9中任一项所述的载体携带的多肽或组合物，其特征在于，所述CyaA片段能够特异性地结合到CD11b表达细胞并可选地将所述多肽递送到细胞质溶胶中，例如由第1到224位残基和第235到1706位残基组成的百日咳博代杆菌CyaA片段。
11.如权利要求1到10中任一项所述的载体携带的多肽或组合物，其特征在于，所述CyaA蛋白或CyaA片段是解毒的、无毒的或没有酶活性的，例如百日咳博代杆菌CyaA，其中二肽Leu-Gln被***到第188位残基和第189位残基之间的框中。
12.如权利要求1到11中任一项所述的载体携带的多肽或组合物，其特征在于，所述至少一种、优选全部的多肽由所述CyaA蛋白或作为基因融合而来的CyaA片段所携带。
13.如权利要求12所述的载体携带的多肽或组合物，其特征在于，所述至少一种、优选全部的多肽被基因***到CyaA中、特别是CyaA的许可位点中。
14.如权利要求1到13中任一项所述的载体携带的多肽或组合物，其特征在于，所述至少一种、优选全部的多肽源自肿瘤抗原或源自病原体抗原。
15.如权利要求14所述的载体携带的多肽或组合物，其特征在于，所述至少一种、优选全部的抗原源自细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。
16.如权利要求15所述的载体携带的多肽或组合物，其特征在于，所述至少一种、优选全部的病毒抗原是来源于选自HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52或HPV58的HPV型种类的抗原。
17.如权利要求16所述的载体携带的多肽或组合物，其特征在于，所述第一组表位构成了HPV16的E7蛋白的抗原片段，第二组表位构成了HPV18的E7蛋白的抗原片段。
18.如权利要求8到16中任一项所述的组合物，包含：
(a)由***到CyaA第319位和320位密码子之间的HPV16-E7的前29个氨基酸残基和***到CyaA第224位和235位密码子之间的HPV16-E7的第43到98位残基组成的第一载体携带的多肽；和
(b)由***到CyaA第319位和320位密码子之间的HPV18-E7的前31个氨基酸残基和***到CyaA第224位和235位密码子之间的HPV18-E7的第43到105位残基组成的另外的载体携带的多肽。
19.如权利要求14所述的载体携带的多肽或组合物，其特征在于，所述至少一种、优选全部的多肽源自MAGEA3肿瘤抗原。
20.如权利要求19所述的载体携带的多肽或组合物，其特征在于，所述载体携带的多肽由百日咳博代杆菌(B.pertussis)CyaA组成，其中：
(1)由MAGEA3的第97到178位残基组成的第一多肽***到CyaA第319位和320位密码子之间；和
(2)由与MAGEA3的第242到295位残基融合的第190到221位残基组成的第二多肽***到CyaA第224位和235位密码子之间。
21.如权利要求17或18所述的载体携带的多肽或组合物，用于：
(1)(i)对哺乳动物寄主中诊断的随感染HPV16而来的第一病理状态进行的免疫治疗；和(ii)预防随感染HPV18而来的第二病理状态；和(iii)可选地，防止所述第一病理状态的复发，其中，当源自HPV18的E7蛋白的多肽没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到所述针对第二确定的病理状态的预防；或
(2)(i)对哺乳动物寄主中诊断的随感染HPV18而来的第一病理状态进行的免疫治疗；和(ii)预防随感染HPV16而来的第二病理状态；(iii)可选地，防止所述第一病理状态的复发；其中，当所述源自HPV16的E7蛋白的多肽没有包含在所述被给药的载体携带的多肽中时，观察不到所述针对第二确定的病理状态的预防。
22.如权利要求6到21中任一项所述的组合物，其特征在于，进一步包含至少一种佐剂，和可选地抗肿瘤或抗病毒的活性化合物。
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