CN103472231A

CN103472231A - 检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN103472231A
Application number: CN2013104490221A
Authority: CN
Inventors: 王爱萍; 周景明; 张改平; 祁元明; 张守涛; 祁艳华; 李永欣; 席宇; 栗宁; 段倩倩; 郑伟; 王新洲; 何文博
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2013-09-28
Filing date: 2013-09-28
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-09-28
Also published as: CN103472231B

Abstract

本发明涉及一种用于检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其制备方法。试剂盒内设有用汞离子包被抗原包被的酶标板、抗汞离子单克隆抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、汞离子标准溶液、洗液浓缩液和样品处理液。本发明的试剂盒能痕量检测汞离子，用于检测环境、土壤、水、食品、药物、化妆品等中的汞离子，具有快速、简便、敏感、特异和经济等特性，检测步骤少，节省检测时间，降低操作误差，时效性强，可进行现场检测。该试剂盒对样品的前处理要求低且处理过程简单，既可用于大批样品的筛检，又可进行小批样品的快速检测，不仅为环境、食品安全提供技术支撑，也为食品进出口检验、食品检验、环境污染监测评价等提供有效的技术手段。

Description

检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及酶联免疫和离子检测，特别是涉及一种用于检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其制备方法。

背景技术

汞，俗称水银，是在常温、常压下唯一以液态存在的金属，化学性质稳定，汞常温下即可蒸发，汞蒸汽和汞的化合物多有剧毒。汞在自然界中普遍存在，我国是汞的生产、使用和排放大国，汞污染防治形势十分严峻。重金属汞是环境污染持久的剧毒物质，毒性高，损害人类健康，汞污染已成为全球性的重大环境问题，亦引起我国政府的高度重视，汞污染防治已被列为“十二五”规划重大专项。汞中毒以慢性为多见，主要是在生产或使用过程中长期吸入汞蒸汽和汞化合物粉尘所致。汞蒸汽较易透过肺泡壁细胞膜，与血液中的脂质结合，很快分布到全身组织。汞在红细胞和其它组织中被氧化成Hg²⁺，并与蛋白质结合而蓄积。金属汞在胃肠道几乎不吸收。慢性汞中毒主要症状表现为精神异常、齿龈炎、震颤和肾炎等；急性汞中毒主要表现为急性腐蚀性口腔炎和胃肠炎，严重时可发生急性肾功能衰竭、肝脏损害。皮肤接触汞及其化合物可引起接触性皮炎，具有***反应性质。

由于汞的污染和危害性较大，我国制定了土壤、食品、水体、化妆品等涉汞领域中的国家限量标准，食品中牛乳汞允许量标准（GB2762-94）为≤0.01mg/kg，地下水质量标准（GB7468-2012）中规定，主要适用于集中式生活饮用水水源及农田灌溉水的汞离子限量≤0.001mg/L。

目前，检测环境汞离子的方法主要有（1）物理和化学分析方法，包括分光光度法、原子吸收光谱法（AAS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）、原子荧光光谱法（AFS）等。这些方法各有优缺点，分光光度法操作简单，快速，干扰小，但其灵敏度不高；原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、原子荧光光谱法具有选择性好、测定精度高、简单、快速等优点，但所用仪器比较昂贵，只能在实验室进行检测，且对操作人员技术要求较为严格，限制了其广泛使用。（2）免疫学分析法：包括酶联免疫吸附法（ELISA）和胶体金免疫层析法。酶联免疫吸附法（ELISA）以竞争性酶联免疫反应为检测原理，反应显色后用酶标仪测定吸光值（OD）值进行结果判定，该方法缩短了检测时间，可以对重金属进行定性定量检测。但ELISA方法需要配套的酶标仪和配套试剂，操作过程较复杂，而且国内现处在研发阶段，进口国外产品价格昂贵，因而ELISA方法的应用受到了较大限制。而商品化的快速检测仪器，其灵敏度低（检测下限为0.1mg/L），达不到国标规定的限值（污水0.05mg/L，饮用水0.001mg/L），且选择性差，无法满足灵敏、准确的检测要求。

因此，研究一种可以简便、敏感、特异、经济、筛检量大的汞离子快速检测产品，是当前迫切需要解决的技术问题，对于减少环境污染、保障食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题：针对现有检测汞离子技术的不足，制备出抗汞离子的高敏感性、高亲和力、高特异性的单克隆抗体，以此为基础制备用于检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其组建方法，该试剂盒能够快速、简便、敏感、特异的检测样品中的汞离子。

本发明的技术方案：

一种检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒，包括盒体，盒体内设有用汞离子包被抗原包被过的酶标板、抗汞离子的单克隆抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、汞离子标准溶液、洗液浓缩液和样品处理液。

所述酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP，浓度均为100 ng/mL；所述底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化脲，显色剂B为四甲基联苯胺（TMB）；所述终止液为2 mol/L的硫酸溶液；所述汞离子标准溶液为汞离子溶解于0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）得到的系列浓度溶液；所述洗液浓缩液为0.1 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20（PBST）；所述样品处理液为0.1 mol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液；用于制备所述酶标板的固相材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

所述的汞离子包被抗原是由以下方法制备的：

（1）称取20 mg 卵清蛋白（OVA）溶于1 mL浓度为0.01 mol/L、pH值为9.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

（2）称取10mg 异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸鳌合剂（ITCBE）溶于1mL 二甲基亚砜（DMSO）中形成金属螯合剂溶液；

（3）将0.5mL金属螯合剂溶液逐滴加到载体蛋白溶液中，混匀后加入100uL、1.5moL/L的三正丁胺，摇床室温反应24h，制成OVA-ITCBE溶液；

（4）取11.25mg硝酸汞溶于100uL蒸馏水中，形成均匀的Hg²⁺溶液；将Hg²⁺溶液加入到OVA-ITCBE溶液中，调节pH值至7.4，在室温下摇床孵育4h，然后移入透析袋中用PBS透析10d，即形成Hg²⁺-ITCBE-OVA包被抗原，收集分装，－20℃冻存。

所述酶标板按如下方法包被：包被抗原为Hg²⁺-ITCBE-OVA，包被浓度为2 μg/mL，包被溶液为0.05 moL/L 的pH 为9.6的碳酸盐缓冲液，包被剂量为100 μL/孔，37 ℃温育2 h或室温8 h，用洗液浓缩液PBST洗涤3次，然后用5%的猪血清封闭，每孔250 μL，37 ℃温育1 h，再用PBST洗涤3次。

所述的抗汞离子单克隆抗体是按以下方法制备的：

（1）人工免疫抗原合成：称取20mg牛血清白蛋白（BSA）溶于1mL、浓度为10mmol/L、pH为9.0的HEPES缓冲液中，形成BSA载体蛋白溶液；

称取10mg ITCBE溶于1mL 二甲基亚砜（DMSO）中形成金属螯合剂溶液；将0.5mL金属螯合剂溶液逐滴加到BSA载体蛋白溶液中，混匀后，加入100uL浓度为1.5moL/L的三正丁胺，摇床室温反应24h，制成BSA-ITCBE溶液；取11.25mg硝酸汞溶于100uL蒸馏水中，形成均匀的Hg²⁺溶液；将Hg²⁺溶液加入到BSA-ITCBE溶液中，调节pH值至7.4，在室温下摇床孵育4h，然后移入透析袋中用PBS透析10d，即形成免疫抗原Hg²⁺-ITCBE-BSA，收集分装，－20℃冻存；

（2）免疫动物：以Hg²⁺-ITCBE-BSA为免疫抗原，以6周龄雌性Balb/c小鼠5只作为免疫动物，背部皮下分点注射，免疫剂量为每只每次蛋白质含量50 μg、体积0.2mL，首免用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔2周免疫一次，共免疫5次；

（3）选择细胞融合备用小鼠：间接ELISA检测抗血清中Hg²⁺-EDTA螯合物的多克隆抗体（Hg²⁺-EDTA pAb）效价，阻断ELISA法检测Hg²⁺-EDTA对Hg²⁺-ITCBE-BSA的半数抑制浓度IC ₅₀，挑选效价最高、IC ₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合；

（4）制备阳性杂交瘤细胞：取NS0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞用PEG进行细胞融合，用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选，对筛选的细胞进行3次有限稀释克隆化；分别于冻存15d、30d 和60d后复苏杂交瘤细胞，培养后取上清液，间接ELISA测定抗体效价，考察杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的稳定性，获得一株杂交瘤细胞株；

（5）制备单克隆抗体：采用体内诱生腹水法制备抗Hg²⁺-EDTA单克隆抗体（Hg²⁺-EDTA mAb），取8周龄健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂（FIA）0.5mL/只，10～15天后使用；将培养的阳性杂交瘤细胞1000r/min离心10min弃上清，收集细胞沉淀；用灭菌的PBS将细胞沉淀悬浮、混匀，将细胞数调至10⁶/mL，腹腔注射0.5mL/只，接种细胞7-10天后产生腹水，进行收集腹水，于37℃水浴30min，4℃放置过夜，12000r/min离心5min，弃去上层脂肪、FIA和下层沉淀物，用饱和硫酸铵盐析法进行纯化，测定IgG含量和效价，－20℃保存备用。

一种检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒的组建方法，试剂盒包括Hg²⁺-ITCBE-OVA包被并用5%的猪血清封闭的酶标板；C1号液：工作浓度为1∶10000的抗汞离子的单克隆抗体；C2号液：工作浓度为1∶1000的羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP，其中酶为辣根过氧化物酶（HRP）；C3号液：显色剂A，为过氧化脲；C4号液：显色剂B，为四甲基联苯胺（TMB）；C5号液：终止液，为2moL/L的硫酸溶液；汞离子标准溶液为硝酸汞用2%的硝酸稀释得到的系列浓度的溶液；洗液浓缩液PBST为0.1mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20；样品处理液为0.1 mol/L的 EDTA溶液。

所述的抗汞离子单克隆抗体是按以下方法制备的：

（2）免疫动物：以Hg²⁺-ITCBE-BSA为免疫抗原，以6周龄雌性Balb/c小鼠5只作为免疫动物，背部皮下分点注射，免疫剂量为每只每次50 μg，首免用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔2周免疫一次，共免疫5次；

（4）制备阳性杂交瘤细胞：取NS0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞用PEG进行细胞融合，用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选，选择强阳性、抑制率较高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化；分别于冻存15d、30d 和60d后复苏杂交瘤细胞，培养后取上清液，间接ELISA测定抗体效价，考察杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的稳定性，获得一株杂交瘤细胞株；

（5）制备单克隆抗体：采用体内诱生腹水法制备抗Hg²⁺-EDTA单克隆抗体（Hg²⁺-EDTA mAb），取8周龄健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂（FIA）0.5mL/只，10～15天后使用；将培养的阳性杂交瘤细胞1000r/min离心10min弃上清，收集细胞沉淀；用灭菌的PBS将细胞沉淀悬浮、混匀，将细胞数调至10⁶/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5mL/只，接种细胞7-10天后产生腹水，收集腹水，于37℃水浴30min，4℃放置过夜，12000r/min离心5min，弃去上层脂肪、FIA和下层沉淀物，用饱和硫酸铵盐析法进行纯化，测定IgG含量和效价，－20℃保存备用。

本发明的积极有益效果：

1. 本发明试剂盒的组建方法，制备了汞离子的人工抗原，得到了适宜分子结合比的人工免疫抗原和包被抗原，并获得了高效价、敏感和特异的抗血清，为试剂盒的组建提供了必要条件。

2. 本发明试剂盒的组建方法，制备了抗汞离子的单克隆抗体，抗体的腹水效价为1∶6.9×10⁵，亲和常数Ka为1.52×10¹⁰ L/mol，与其它重金属离子的交叉反应率小于1%，该抗体具有高效价、高亲和力、特异性强等特性，为汞离子的痕量快速检测提供了保障。

3. 本发明的汞离子间接竞争酶联免疫试剂盒，能痕量检测汞离子，具有快速、简便、敏感、特异和经济等特性，检测步骤少，节省检测时间，降低操作误差。快速，45～50 min出结果，比理化检测方法（3 d）大大节省时间；简便，不需要任何附加仪器和试剂，人人均可操作；敏感，检测灵敏度为0.5 ng/mL，符合国家限量标准要求，与理化检测方法灵敏度相当；特异，与其它重金属离子无交叉反应；经济，与理化检测方法相比，检测成本不到理化分析方法的1/20；检测的时效性强，可进行现场检测。

4. 本发明的汞离子间接竞争酶联免疫试剂盒，可用于检测环境、土壤、水、食品、药物、化妆品等中的汞离子，对样品的前处理要求低且处理过程简单，既可用于大批样品的筛检，又可进行小批样品的快速检测，不仅为环境、食品安全提供技术支撑，也为食品进出口检验、食品检验、环境污染监测评价等提供有效的技术手段和检测方法，对于提高食品安全、保障人民身心健康、保持环境友好与可持续发展具有重要现实意义，该技术的推广将具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为人工免疫抗原Hg²⁺-ITCBE-Protein合成的技术路线图；

图2 为检测汞离子酶联免疫试剂盒的标准曲线图。

具体实施方式

以下用实施例具体说明本发明，但是并不表示对本发明的任何限制，如没有特别说明，其中的百分含量均为重量百分含量。

实施例一、汞离子人工免疫抗原的制备

采用异硫氰酯法制备人工完全抗原，包括免疫抗原Hg²⁺-ITCBE-BSA和包被抗原Hg²⁺-ITCBE-OVA。以包被抗原Hg²⁺-ITCBE-OVA为例，其制备方法如下。

（1）称取20 mg 卵清蛋白OVA溶于1 mL浓度为0.01 mol/L、pH值为9.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

同法制备免疫抗原Hg²⁺-ITCBE-BSA。

实施例二、汞离子人工免疫抗原鉴定

采用二喹啉甲酸法测定Hg²⁺-ITCBE-BSA中载体蛋白BSA浓度。以BSA作为标准蛋白，配成0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL的浓度梯度，用二喹啉甲酸法构建浓度检测标准曲线。BSA浓度标准曲线的线性方程为：y=0.0035x＋0.0065，R²＝0.9981，其中y为样品在波长为562nm处的吸光度，x为样品蛋白浓度。

采用ICP-AES法测定Hg²⁺-ITCBE-BSA中Hg²⁺的浓度。将100μg/mL的Hg²⁺-ITCBE-BSA中Hg²⁺标准储备液用2%的硝酸稀释成0μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程Y=0.0174X+0.0019，相关系数0.9989；在253.7nm波长的最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果。

实施例三、抗汞离子单克隆抗体的制备

（1）免疫动物。用Hg²⁺-ITCBE-BSA免疫Balb/c小鼠5只，免疫剂量为50μg·0.2 mL/只，背部皮下多点注射。首免，用灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释Hg²⁺-ITCBE-BSA，与等量弗氏完全佐剂（CFA）混合乳化；加强免疫，用灭菌PBS稀释Hg²⁺-ITCBE-BSA，与等量弗氏不完全佐剂（IFA）混合乳化，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔3周免疫一次，共免5次，第三次免疫后10天断尾取血，37 ℃水浴30 min，4 ℃放置过夜，800 r/min 4 ℃离心5 min，取上清后－20℃保存备用。

（2）细胞融合备用小鼠选择。间接ELISA检测抗血清中Hg²⁺与乙二胺四乙酸（EDTA）螯合物Hg²⁺-EDTA 的多克隆抗体（pAb）效价，阻断ELISA检测Hg²⁺-EDTA pAb对Hg²⁺-EDTA的半数抑制浓度（IC ₅₀），挑选效价最高、IC ₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合。

（3）细胞融合和阳性杂交瘤细胞株的筛选。细胞融合，将PEG溶液、GNK溶液预热至40 ℃，将制备好的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10∶1的比例混合于50 mL离心管中，加GNK溶液至40 mL，1000 r/min离心10 min，弃上清，打散细胞团，将此融合管移入40 ℃水浴中。用1 mL吸管将预热的50% PEG（pH 8.0）滴加到融合管中，边加边轻轻摇动融合管，1 min内加完，并继续在水浴中缓缓摇动融合管1.5 min；然后慢慢补加GNK溶液至40 mL，37℃水浴静置5 min，1000 r/min离心10 min，弃上清；打散细胞团，加40 mL HAT吹打混匀，加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，每孔100 μL，置37 ℃、5% 的CO₂培养箱中培养。

阳性杂交瘤细胞的筛选，用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，分别于冻存15 d、30 d 和60 d后复苏杂交瘤细胞，培养后取上清液，间接ELISA法测定抗体效价，考察杂交瘤细胞分泌的抗Hg²⁺离子单克隆抗体（Hg²⁺-EDTA mAb）的稳定性。

（4）单克隆抗体的制备。采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，取8周龄健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射FIA 0.5 mL/只，10～15天后使用。将培养的阳性杂交瘤细胞1000 r/min离心10min，弃上清，收集细胞沉淀。用灭菌的PBS将细胞沉淀悬浮、混匀，将细胞数调至10⁶个/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5 mL/只。接种细胞7～10天后产生腹水，进行收集，于37 ℃水浴30 min，4 ℃放置过夜，12000 r/min离心5 min，弃去上层的脂肪、IFA和下层的沉淀，饱和硫酸铵盐析法提纯后测定IgG含量和效价，－20 ℃保存备用。

实施例四、抗汞离子单克隆抗体的鉴定

（1）腹水效价测定。给腹腔注射液体石蜡10 d后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株10⁷个细胞，7 d后抽取腹水，饱和硫酸铵盐析法提纯，间接ELISA测定效价。测定结果，单克隆抗体的腹水效价为1∶6.9×10⁵。

（2）亲和力鉴定。饱和ELISA测定亲和常数（Ka），用浓度分别为3.4μg/mL和1.7μg/mL的Hg²⁺-ITCBE-OVA包被，加入倍比稀释的Hg²⁺-ITCBE mAb，再加入GaMIgG-HRP，TMB显色测A _450nm值，以Hg²⁺-ITCBE mAb浓度为横坐标，以A _450nm值为纵坐标，绘出相应的2条反应曲线，以每条曲线上部平坦段的A _450nm值作为100%，在曲线上算出50% A _450nm值时对应的Hg²⁺-ITCBE mAb浓度，按照公式Kaff＝（n－1）/2（n[Ab']t－[Ab]t）计算Ka。单克隆抗体的Ka为1.52×10¹⁰ L/mol。

（3）敏感性鉴定。用阻断ELISA测定Hg²⁺-EDTA mAb对不同浓度Hg²⁺-EDTA的抑制率，以抑制率B/B₀为纵坐标，以不同浓度Hg²⁺-EDTA的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，进行相关回归分析，计算Hg²⁺-EDTA mAb对Hg²⁺-EDTA的IC ₅₀。鉴定结果，IC ₅₀为10.31ng/mL。

（4）特异性鉴定。采用交叉反应试验鉴定其特异性。交叉反应试验选择汞、铬、铅、锌、铜、铯、钴、钼、铁与EDTA的鳌合物(鳌合方法同上)和EDTA溶液做为抑制剂，用阻断ELISA测定各抑制物的IC ₅₀，以Hg²⁺-EDTA mAb对Hg²⁺-EDTA的IC ₅₀和Hg²⁺-EDTA mAb对各竞争物的IC ₅₀之比的百分数为其交叉反应率(CR％)。鉴定结果，与其它重金属离子交叉反应小于1%。

实施例五、汞离子酶联免疫试剂盒的制备

（1）酶标二抗和单克隆抗体工作浓度的确定：采用方阵法筛选确定酶标二抗（RaRIgG-HRP）和单克隆抗体的工作浓度，分别为1∶1000和1∶10000。

（2）汞离子酶联免疫试剂盒组装：

试剂盒包括：Hg²⁺-ITCBE-OVA包被并用5%猪血清封闭的8×12（96孔）或4×12（48孔）酶标板；C1号液：工作浓度为1∶10000的抗汞离子的单克隆抗体；C2号液：工作浓度为1∶1000的羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP，其中酶为辣根过氧化物酶；C3号液：显色剂A，为过氧化脲；C4号液：显色剂B，为四甲基联苯胺（TMB）；C5号液：终止液，为2moL/L的硫酸溶液；汞离子标准溶液为硝酸汞用2%的硝酸稀释成0ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL、32ng/mL、64ng/mL、128ng/mL、256ng/mL得到的系列浓度溶液；洗液浓缩液PBST为0.1mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20；样品处理液为0.1 mol/L的 EDTA溶液。

（3）汞离子酶联免疫试剂盒的标准曲线：阻断ELISA测定单克隆抗体对不同浓度Hg²⁺标准品的抑制率，以抑制率B/B₀%（B是Hg²⁺不同标准浓度的A ₄₅₀值，B₀是Hg²⁺ 0标准浓度的A ₄₅₀值）为纵坐标，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，推导回归方程，进行回归分析。标准曲线见附图2。线性回归方程为y = -35.16x + 85.632，R² = 0.9928，IC ₅₀为10.31μg/L。

实施例六、汞离子酶联免疫试剂盒的性能测定

（1）灵敏性测定。按照阻断ELISA最低检测限为B/B₀＝120%的方法，根据曲线回归方程计算出试剂盒的灵敏度，确定检测限。测定结果，检测限为0.5 ng/mL。

（2）检测范围测定。按照阻断ELISA检测范围为B/B₀＝20%～80%的方法，根据曲线回归方程计算出试剂盒的灵敏度，确定检测范围，检测范围为0.5～73.62 ng/mL。

（3）准确性测定。将Hg²⁺标准品以终浓度分别为1、2、4、8、10 ng/mL添加到饲料、牛乳中，设6个重复，以回收率和变异系数（CV）确定其准确度。饲料样的回收率在91.2%～98.41%，平均96.1%，变异系数（CV）在10.9%～14.8%，平均13.09%；牛乳的回收率在89.7%～98.1%，平均95.43%，CV在11.2%～13.9%，平均13.46%；饲料和牛乳的平均CV小于15%，表明试剂盒具有较高准确度。见表2。

表2 汞离子酶联免疫试剂盒的添加回收试验（n＝6）

（4）特异性测定。采用交叉反应试验，选择钼、铅、镉、铜、锌、铬、钴、铁等金属离子与EDTA的螯合物、EDTA为抑制物，用阻断ELISA测定各抑制物的IC ₅₀，以Hg²⁺ mAb对Hg²⁺的IC ₅₀和对其它各竞争物的IC ₅₀的百分率为其交叉反应率（CR％)。见表3。

表3 Hg²⁺ -EDTA mAb与其它金属螯合物的交叉反应

（5）稳定性：取同一批次的试剂盒保存于4 ℃，测定保存6个月中各月份的A ₄₅₀值、IC ₅₀、R²变化情况，确定其稳定性。结果显示，随着试剂盒保存期延长，各标准品的A_450nm值有所减小，但其IC₅₀、R²变化不大，曲线拟合良好，说明该试剂盒在4℃、6个月保存期内质量稳定。见下表4。

表4 试剂盒的保存期

Claims

1. 一种检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒，包括盒体，其特征在于：盒体内设有用汞离子包被抗原包被过的酶标板、抗汞离子的单克隆抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、汞离子标准溶液、洗液浓缩液和样品处理液。

2. 根据权利要求1所述的间接竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于：

所述酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP，浓度均为100 ng/mL；所述底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化脲，显色剂B为四甲基联苯胺；所述终止液为2 mol/L的硫酸溶液；所述汞离子标准溶液为汞离子溶解于0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液得到的系列浓度溶液；所述洗液浓缩液为0.1 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20；所述样品处理液为0.1 mol/L的乙二胺四乙酸溶液；用于制备所述酶标板的固相材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

3. 根据权利要求1或2所述的间接竞争酶联免疫试剂盒，其特征是：所述的汞离子包被抗原是由以下方法制备的：

（1）称取20 mg 卵清蛋白溶于1 mL浓度为0.01 mol/L、pH值为9.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

（2）称取10mg 异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸鳌合剂溶于1mL 二甲基亚砜中形成金属螯合剂溶液；

4. 根据权利要求3所述的间接竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶标板按如下方法包被：包被抗原为Hg²⁺-ITCBE-OVA，包被浓度为2 μg/mL，包被溶液为0.05 moL/L 的pH 为9.6的碳酸盐缓冲液，包被剂量为100 μL/孔，37 ℃温育2 h或室温8 h，用洗液浓缩液PBST洗涤3次，然后用5%的猪血清封闭，每孔250 μL，37 ℃温育1 h，再用PBST洗涤3次。

5. 根据权利要求1-4任一项所述的间接竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的抗汞离子单克隆抗体是按以下方法制备的：

（1）人工免疫抗原合成：称取20mg牛血清白蛋白溶于1mL、浓度为10mmol/L、pH为9.0的HEPES缓冲液中，形成BSA载体蛋白溶液；

称取10mg ITCBE溶于1mL 二甲基亚砜中形成金属螯合剂溶液；将0.5mL金属螯合剂溶液逐滴加到BSA载体蛋白溶液中，混匀后，加入100uL浓度为1.5moL/L的三正丁胺，摇床室温反应24h，制成BSA-ITCBE溶液；取11.25mg硝酸汞溶于100uL蒸馏水中，形成均匀的Hg²⁺溶液；将Hg²⁺溶液加入到BSA-ITCBE溶液中，调节pH值至7.4，在室温下摇床孵育4h，然后移入透析袋中用PBS透析10d，即形成免疫抗原Hg²⁺-ITCBE-BSA，收集分装，－20℃冻存；

（3）选择细胞融合备用小鼠：间接ELISA检测抗血清中Hg²⁺-EDTA螯合物的多克隆抗体效价，阻断ELISA法检测Hg²⁺-EDTA对Hg²⁺-ITCBE-BSA的半数抑制浓度IC ₅₀，挑选效价最高、IC ₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合；

（5）制备单克隆抗体：采用体内诱生腹水法制备抗Hg²⁺-EDTA单克隆抗体，取8周龄健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只，10～15天后使用；将培养的阳性杂交瘤细胞1000r/min离心10min弃上清，收集细胞沉淀；用灭菌的PBS将细胞沉淀悬浮、混匀，将细胞数调至10⁶/mL，腹腔注射0.5mL/只，接种细胞7-10天后产生腹水，进行收集腹水，于37℃水浴30min，4℃放置过夜，12000r/min离心5min，弃去上层脂肪、FIA和下层沉淀物，用饱和硫酸铵盐析法进行纯化，测定IgG含量和效价，－20℃保存备用。

6. 一种权利要求1-3任一项检测汞离子的间接竞争酶联免疫试剂盒的组建方法，其特征在于：所述试剂盒包括Hg²⁺-ITCBE-OVA包被并用5%的猪血清封闭的酶标板；C1号液：工作浓度为1∶10000的抗汞离子的单克隆抗体；C2号液：工作浓度为1∶1000的羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP，其中酶为辣根过氧化物酶；C3号液：显色剂A，为过氧化脲；C4号液：显色剂B，为四甲基联苯胺；C5号液：终止液，为2moL/L的硫酸溶液；汞离子标准溶液为硝酸汞用2%的硝酸稀释得到的系列浓度的溶液；洗液浓缩液PBST为0.1mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20；样品处理液为0.1 mol/L的 EDTA溶液。

7. 根据权利要求6所述的酶联免疫试剂盒的组建方法，其特征在于：所述酶标板按如下方法包被：包被抗原为Hg²⁺-ITCBE-OVA，包被浓度为2 μg/mL，包被溶液为0.05 moL/L 的pH 为9.6的碳酸盐缓冲液，包被剂量为100 μL/孔，37 ℃温育2 h或室温8 h，用洗液浓缩液PBST洗涤3次，然后用5%的猪血清封闭，每孔250 μL，37 ℃温育1 h，再用PBST洗涤3次。

8. 根据权利要求7所述的酶联免疫试剂盒的组建方法，其特征在于：所述的抗汞离子单克隆抗体是按以下方法制备的：

（5）制备单克隆抗体：采用体内诱生腹水法制备抗Hg²⁺-EDTA单克隆抗体，取8周龄健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只，10～15天后使用；将培养的阳性杂交瘤细胞1000r/min离心10min弃上清，收集细胞沉淀；用灭菌的PBS将细胞沉淀悬浮、混匀，将细胞数调至10⁶/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5mL/只，接种细胞7-10天后产生腹水，收集腹水，于37℃水浴30min，4℃放置过夜，12000r/min离心5min，弃去上层脂肪、FIA和下层沉淀物，用饱和硫酸铵盐析法进行纯化，测定IgG含量和效价，－20℃保存备用。