CN103459411A - 在细胞表面上表达的抗微生物肽多嵌段共聚物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗微生物肽多聚体，其包括由胃蛋白酶切割的一个或多个单体；抗微生物肽多嵌段共聚物，其中细胞表面表达母体与该共聚物连接；以及抗微生物微生物，其表达该抗微生物肽多嵌段共聚物；包括上述的抗微生物组合物；通过施用抗微生物组合物治疗由细菌、酵母或真菌引起的传染病的方法，和生产抗微生物微生物的方法。根据本发明，通过直接施用在细胞表面上表达抗微生物肽的微生物到活体中而不必裂解细胞或者分离和纯化抗微生物肽以抗微生物肽，展现抗微生物活性，并且因此显著降低抗微生物肽的生产成本，从而包括抗微生物肽的宽泛用途。

Description

在细胞表面上表达的抗微生物肽多嵌段共聚物
技术领域
本发明涉及抗微生物肽多聚体，其包括由胃蛋白酶消化的至少一个单体；多聚体抗微生物肽复合物，其包括该多聚体和与该多聚体连接的细胞表面锚定基序；抗微生物微生物（antimicrobialmicroorganism），其展示该多聚体抗微生物肽复合物；包括上述的抗微生物组合物；通过施用抗微生物组合物治疗由细菌、酵母或真菌引起的传染病的方法；和生产抗微生物微生物的方法。
背景技术
为了保护人类免于致病微生物，已经发现、开发和使用了许多抗生素。然而，抗生素的滥用已经导致抗生素抗性菌株的迅速增加，并且因此可用抗生素的数量已经被限制。由于该原因，对下述新物质存在需求，其具有不同于常规抗生素的活性机制，展现对抗生素抗性微生物的活性，不引起抗性问题并且不残留在体内长的时间期间。能够满足该需求的典型候选物包括抗微生物肽。
不像传统抗生素，抗微生物肽对宽范围的微生物具有有效的抗微生物活性，在热、酸或碱中是物理和化学稳定的并且由少量的氨基酸(5-50个氨基酸)组成。因此，这些抗微生物肽具有优势，在于它们在抗微生物作用之后容易降解，从而它们不残留在体内，表明它们在体内不引起毒性。因此，抗微生物肽可用作下一代抗生素物质并且非常适于工业领域，包括药学和食品领域。
本发明人之前开发了对宽范围的微生物具有有效的抗微生物活性的抗微生物肽(韩国专利登记号0441402)。
对于这些抗微生物肽的工业应用，有必要需要能够以成本有效方式生产大量抗微生物肽的方法，但是生产抗微生物肽的传统方法不能以成本有效的方式提供大量抗微生物肽。换句话说，作为用于生产肽的传统方法的化学合成方法的使用具有低的经济效率，并且当使用基因工程技术从微生物生产抗微生物肽时存在问题，该问题在于抗微生物肽以低水平表达并且显示对宿主的抗微生物活性以及在于表达的抗微生物肽容易被宿主中的蛋白酶降解。
另外，为了在微生物中高度表达抗微生物肽，现有技术中通常使用采用融合伴侣而不杀死宿主细胞的从宿主微生物生产期望的肽的方法。
在上述方法中，为了回收抗微生物肽，需要裂解宿主细胞，以获得不溶的融合蛋白，消化该融合蛋白并且使用层析或离子交换柱分离和纯化抗微生物肽。然而，上述方法具有关键的问题，该问题在于大量的抗微生物肽在回收过程期间丢失，以致其产率显著降低，导致抗微生物肽的价格显著增加。
为克服该问题，尝试融合细胞表面展示蛋白与抗微生物肽以将抗微生物肽展示在细胞表面上。结果，通过将抗微生物肽展示在细胞表面上，可省略细胞裂解过程，但是仍存在的问题在于为了分离抗微生物肽必须用单独的酶处理细胞表面展示蛋白并且在于必须使用层析或离子交换柱去除杂质。
另外，有一种方法，其中使用展示在细胞表面上的抗微生物肽而没有任何处理，以省略分离和纯化抗微生物肽的步骤。然而，该方法具有严重的问题在于附着至细胞表面的抗微生物肽的抗微生物活性明显下降。
发明内容
技术问题
所以，本发明人已经做出了大量的努力以开发抗微生物肽，其在体内展现抗微生物活性，其使用表达所述抗微生物肽的活体微生物而不用分离和纯化抗微生物肽。结果，本发明人发现，当包括由胃蛋白酶消化的单体的多聚体抗微生物肽复合物展示在大肠杆菌(E.coli)的细胞表面上时，展示的抗微生物肽在体内展现抗微生物活性，而不必从大肠杆菌细胞分离和纯化抗微生物肽，从而完成本发明。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供多聚体抗微生物肽复合物，其包括抗微生物肽多聚体和与该多聚体连接的细胞表面锚定基序，所述抗微生物肽多聚体包括由胃蛋白酶消化的至少一个单体。
本发明的另一目的是提供抗微生物肽多聚体，其包括由胃蛋白酶消化的至少一个单体。
本发明的仍另一目的是提供多核苷酸，其编码上述多聚体抗微生物肽复合物或多聚体。
本发明的仍另一目的是提供重组载体，其包括上述多核苷酸。
本发明的仍另一目的是提供抗微生物微生物，其将多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面。
本发明的仍另一目的是提供抗微生物药物组合物和抗微生物非处方(OTC)药物组合物，其包括，作为有效成分的上述多聚体抗微生物肽复合物或抗微生物肽多聚体或将上述多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面的抗微生物微生物。
本发明的仍另一目的是提供生产将上述多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面上的抗微生物微生物的方法。
本发明的仍另一目的是提供治疗由细菌、酵母或真菌引起的传染病的方法，该方法包括施用抗微生物药物组合物。
有益效果
根据本发明，生产抗微生物肽，从而当在体内施用在其细胞表面展示抗微生物肽的活体微生物时其可显示抗微生物活性，而不必裂解细胞以及分离和纯化抗微生物肽。因此，可以以显著降低的成本生产抗微生物肽，从而其可具有宽泛的用途。另外，本发明的多聚体抗微生物肽复合物或抗微生物肽多聚体在体内由酶胃蛋白酶消化，从而其分离为单体抗微生物肽单元，并且分离的单体抗微生物肽单元具有高的抗微生物活性。因此，本发明的多聚体抗微生物肽复合物或抗微生物肽多聚体可有效用于治疗由致病细菌、酵母或真菌引起的传染病，并且用作传统抗生素的替代品。
附图说明
图1显示抗微生物微生物活化的原理，其将本发明的多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面。
图2示意性显示构建展示在细胞表面上的本发明多聚体抗微生物肽复合物的过程。
图3是琼脂糖凝胶图像，显示Lpp-OmpA-Hinge2Ln DNA片段的大小。
图4是包括***其中的Lpp-OmpA-Hinge2Ln DNA片段的重组载体pLHn的示意图。
图5是显示展示在转化的大肠杆菌上的Lpp-OmpA-Hinge2Ln DNA片段大小的SDS-PAGE图像，和图6是显示展示转化的大肠杆菌细胞表面的多聚体抗微生物肽的共焦显微图。图5中的“M”表示分子量标准标记；图5和6中LH0表示IPTG诱导的仅细胞表面锚定基序的表达，并且LH1、LH2和LH3中的箭头表示IPTG诱导的连接至细胞表面锚定基序的抗微生物肽Hinge2L的单体、二聚体和三聚体的表达。
图7是显示表达多聚体抗微生物肽复合物的大肠杆菌菌株的抗微生物活性的图表，并且显示由胃蛋白酶切割的单体抗微生物肽LH0、LH1和LH3的抗微生物活性的观察结果，其中作为阴性对照的不表达抗微生物肽的大肠杆菌BL21(DE3)的活性定义为0%，并且作为阳性对照的合成的单体抗微生物肽Hinge2L的活性定义为100%。
最佳方式
为了实现上述目的，在一个方面，本发明提供多聚体抗微生物肽复合物，其包括抗微生物肽多聚体和与该多聚体连接的细胞表面锚定基序，其中抗微生物肽多聚体包括由下列式1或2表示的至少一个单体：
式1
N末端-[抗微生物肽-胃蛋白酶消化的氨基酸连接体]-C末端；和
式2
N末端-[胃蛋白酶消化的氨基酸连接体-抗微生物肽]-C末端；
其中抗微生物肽不包括连接体中使用的氨基酸。
在另一方面，本发明提供抗微生物肽多聚体，其包括由式1或2表示的至少一个单体。
如本文所使用，术语“抗微生物肽多聚体”指其中由胃蛋白酶消化的一个或多个单体通过由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体重复连接的多聚体，和术语“多聚体抗微生物肽复合物”指这样的多聚体肽复合物，其包括连接至抗微生物肽多聚体的细胞表面锚定基序，从而当在微生物中表达时其可展示在微生物的细胞表面上。
如图1中显示，本发明的多聚体抗微生物肽复合物被分离成具有抗微生物活性的单体抗微生物肽单元，因为单体抗微生物肽中由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体在体内被消化酶胃蛋白酶消化。因此，当展示多聚体抗微生物肽的活体微生物被注射在体内而没有从该微生物分离或纯化多聚体抗微生物肽时，可通过抗微生物肽的抗微生物活性直接在体内诱导比如消除病原体和活化免疫细胞的作用。
在本发明中，单体具有由胃蛋白酶消化的连接至抗微生物肽的N末端或C末端的氨基酸连接体。
抗微生物肽是这样的肽或其衍生物，其透过微生物细胞以展现对宽范围的微生物——包括细菌或真菌——的有效的抗微生物活性，并且不包括由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体的氨基酸序列，以便防止抗微生物肽被胃蛋白酶消化。
另外，抗微生物肽可以是具有抗微生物活性的肽或其衍生物。优选地，在韩国专利登记号0441402中公开的抗微生物肽中，其可以是不包括由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体的氨基酸序列的抗微生物肽或其衍生物。更优选地，其可以是具有选自SEQ ID NOS:9至24的氨基酸序列的任何一条氨基酸序列的抗微生物肽，或其衍生物。甚至更优选地，其可以是具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的抗微生物肽，或其衍生物。
由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体由一个或多个氨基酸组成。因此，其用作通过肽键将抗微生物肽彼此连接的连接体，并且被酶胃蛋白酶在体内消化，从而多聚体抗微生物肽复合物被分离成单体抗微生物肽单元。本发明的多聚体抗微生物肽复合物或抗微生物肽多聚体可包括由式1或2表示的一个或多个单体。不限制转化的微生物或载体中包括的单体的数量，但是优选地为1-4个。
本发明中，由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体的两端通过肽键连接至抗微生物肽的末端。氨基酸连接体由下述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列使得在连接体的末端和抗微生物肽的N末端之间形成的肽键通过消化酶胃蛋白酶的作用被破坏。
优选地，由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体可由选自亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)的一个或多个氨基酸组成。例如，其可由一个或多个亮氨酸、一个或多个苯丙氨酸、一个或多个酪氨酸，或其包括一个或多个氨基酸的组合组成。优选地，其可由一个亮氨酸、一个苯丙氨酸或一个酪氨酸组成。
在本发明的一个实例中，使用计算机程序预测通过任何氨基酸连接体连接至抗微生物肽C末端的抗微生物肽多聚体的胃蛋白酶消化位点。结果，显示氨基酸连接体的一个亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸末端和抗微生物肽的N末端之间形成的肽键被破坏，同时抗微生物肽多聚体可分离成单体抗微生物单体单元(实施例1)。
本发明中，细胞表面锚定基序被连接至抗微生物肽多聚体，从而使多聚体抗微生物肽复合物展示在微生物的细胞表面上。
细胞表面锚定基序可选自：外膜蛋白、脂蛋白、自体转运蛋白、和表面附器的S-层。优选地，其可以是外膜蛋白。更优选地，其可以是选自下述的外膜蛋白：大肠杆菌外膜蛋白OmpA、连接至大肠杆菌脂蛋白的前导序列的大肠杆菌外膜蛋白OmpA、大肠杆菌外膜蛋白OmpS、大肠杆菌外膜蛋白LamB、大肠杆菌外膜蛋白PhoE、大肠杆菌外膜蛋白OmpC、大肠杆菌外膜蛋白FadL、沙门氏菌(Salmonella)外膜蛋白OmpC、和假单胞菌(Pseudomonas)外膜蛋白OprF。甚至更优选地，其可以是SEQ ID NO:8的细胞表面锚定基序(Lpp-OmpA)，其由连接至大肠杆菌脂蛋白的前导序列的大肠杆菌外膜蛋白OmpA组成。
在本发明的实例中，构建抗微生物肽多聚体Hinge2L1、Hinge2L2、Hinge2L3和Hinge2L4，其每个由具有作为氨基酸连接体的一个亮氨酸的单体抗微生物肽(Hinge2L)组成，所述亮氨酸由胃蛋白酶消化、添加至抗微生物肽的C末端(实施例2)；和构建多聚体抗微生物肽复合物Lpp-OmpA-Hinge2L1、Lpp-OmpA-Hinge2L2、Lpp-OmpA-Hinge2L3和Lpp-OmpA-Hinge2L4，其每个由具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列、连接至抗微生物肽多聚体N末端的细胞表面锚定基序(Lpp-OmpA)组成(实施例3)。
在另一方面，本发明提供多核苷酸，其编码本发明的多聚体抗微生物肽复合物或抗微生物肽多聚体，和包括该多核苷酸的重组载体。
本发明中，编码多聚体抗微生物肽复合物或抗微生物肽多聚体的多核苷酸是DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)链，其是由彼此共价连接的核苷酸单体单元组成的核苷酸多聚体。
编码多聚体抗微生物肽复合物的多核苷酸可以是具有下述任一条核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO:25(Lpp-OmpA-Hinge2L2)、SEQ IDNO:26(Lpp-OmpA-Hinge2L3)和SEQ ID NO:27(Lpp-OmpA-Hinge2L4)。
另外，编码抗微生物肽多聚体的多核苷酸可以是具有下述任一条核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO:28(Hinge2L2)、SEQ ID NO:29(Hinge2L3)和SEQ ID NO:30(Hinge2L4)。
本发明中，重组载体是用于将DNA引入微生物宿主细胞以生产将本发明的多聚体抗微生物肽复合物或抗微生物肽多聚体展示在其细胞表面上的微生物的工具。可通过使用已知的表达载体制备用于本发明的重组载体，比如质粒载体、黏粒载体或噬菌体载体。本领域技术人员可容易地根据使用DNA重组技术的已知方法制备载体。
本发明中使用的重组载体可以是pGEM T-easy载体或pET21c载体，优选地是pET21c载体。
本发明的重组载体是与编码本发明的多聚体抗微生物肽复合物或抗微生物肽多聚体的多核苷酸可操作地连接的重组载体。如本文所使用，术语“可操作地连接”意思是连接表达控制序列，从而控制编码本发明的多聚体抗微生物肽复合物或抗微生物肽多聚体的多核苷酸序列的转录和翻译。具体地，其意思是精确保持阅读框，从而在表达控制序列(包括启动子)的控制下表达多核苷酸序列，以生产该多核苷酸序列编码的多聚体抗微生物肽复合物或抗微生物肽多聚体。
在仍另一方面，本发明提供用重组载体转化的抗微生物微生物，以将多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面。
如本文所使用，术语“抗微生物微生物”指能够将抗微生物肽展示在其细胞表面上的微生物。本发明的抗微生物微生物可用于将多聚体抗微生物肽复合物——其可被细胞中的消化酶胃蛋白酶切割成单体抗微生物肽——展示在细胞表面上，从而抗微生物微生物本身在体内杀死病原体。因此，本发明的抗微生物微生物可用作抗生素的替代品。
如本文所使用，术语“转化”意思是将基因引入宿主细胞，从而其可在宿主细胞中表达。关于转化的基因，可使用***宿主细胞的染色体中或位于染色体外部的任何基因而没有限制，只要其可在宿主细胞中表达。
另外，基因是能够编码多肽的多核苷酸，并且其例子包括DNA和RNA。可以任何形式引入基因，只要其可被引入并且在宿主细胞中表达。例如，基因可以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是包括自表达需要的所有元件的多核苷酸结构。表达盒通常包括可操作地连接至基因的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒为自复制表达载体的形式。另外，基因本身可被引入宿主细胞，或基因可以多核苷酸结构的形式引入宿主细胞并且被可操作地连接至需要在宿主细胞中表达的序列。
抗微生物微生物是用重组载体转化的微生物，其包括编码多聚体抗微生物肽复合物的多核苷酸，从而能够将多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面。抗微生物微生物的例子包括埃希氏菌属(Escherichia sp.)、杆菌属(Bacilus sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)、肠杆菌属(Enterobacteria sp.)、结合酵母属(Zygosaccharomyces sp.)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、异常球菌属(Deinococcus sp.)、毕赤氏酵母属(Pichiasp.)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces sp.)、念珠菌属(Candida sp.)、汉逊酵母属(Hansenula sp.)、德巴利酵母属(Debaryomyces sp.)、毛霉菌属(Mucor sp.)、球拟酵母属(Torulopsis sp.)、甲基杆菌属(Methylobacter sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、短颈细菌属(Brevibacterium sp.)和棒杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物。
优选地，抗微生物微生物可以是埃希氏菌属微生物，更优选地是大肠杆菌，甚至更优选地是大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明的实例中，显示了构建用包括编码多聚体抗微生物肽复合物的多核苷酸的重组载体转化的大肠杆菌菌株(实施例4)，并且多聚体抗微生物肽复合物在转化的大肠杆菌细胞中的表达由IPTG诱导，其后多聚体抗微生物肽复合物是否展示在细胞表面上。结果，可见连接至细胞表面锚定基序的抗微生物肽Hinge2L的单体、二聚体和三聚体展示在大肠杆菌菌株的细胞表面上(实施例5和6)。
在另一方面，本发明提供抗微生物药物组合物，其包括作为有效成分的本发明的多聚体抗微生物肽复合物、抗微生物肽多聚体或抗微生物微生物。
在仍另一方面，本发明提供治疗由致病细菌、酵母或真菌引起的传染病的方法，该方法包括施用上述抗微生物药物组合物至具有传染病的对象。
本发明中，致病细菌指侵入活的动物或植物并且寄生在其上引起疾病或对动物或植物损害的任何微生物。致病细菌的例子包括***和革兰氏阴性细菌。优选地，致病细菌可以是革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus)或革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichia coli)。
另外，致病酵母和真菌的例子包括但不限于白色念球菌(Candidaalbicans)、烟曲霉菌（Aspergillus humigatus）、酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans）。
本发明中，致病细菌引起的传染病可以是由霍乱弧菌(Vibriocholera)引起的霍乱；痢疾杆菌(dysentery bacillus)引起的细菌性痢疾；百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)引起的百日咳；伤寒沙门菌(Salmonella typhi)引起的伤寒；白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)引起的喉白喉和鼻白喉；鼠疫杆菌(Yersinea pestis)引起的腺鼠疫和鼠疫性肺炎；溶血性链球菌(hemolytic Streptococci)引起的猩红热、类丹毒、败血症和脓皮病；结合分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的肺结核、关节结核、肾结核和结核性脑膜炎；或沙门氏菌(Salmonella)和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的细菌性胃肠炎。另外，致病酵母和真菌引起的传染病可以是隐球菌病、白假丝酵母病、皮肤癣菌病、浅部真菌病、脑膜炎、脑脓肿、脑瘤、组织胞浆菌病、肺孢子虫性肺炎或曲霉菌病。
如本文所使用，术语“治疗”指通过施用抗微生物药物组合物恢复或有益改变致病细菌、酵母或真菌引起的感染的所有动作。如本文所使用，术语“对象”指具有或处在发展由致病细菌、酵母或真菌引起的传染病的风险的所有动物，包括人。
本发明的抗微生物药物组合物可施用至遭受由致病细菌、酵母或真菌引起的传染病的人对象，以治疗传染病。
本发明的抗微生物药物组合物可通过任何通常路径施用，只要其可到达靶组织。具体地，本发明的药物组合物可腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、鼻内、肺内或直肠内使用，但不限于此。另外，药物组合物可使用能够输送有效成分至靶细胞的任何***施用。
当包括本发明的抗微生物微生物的抗微生物药物组合物在体内施用时，展示在抗微生物微生物的细胞表面上的多聚体抗微生物肽复合物被消化酶胃蛋白酶在体内消化并且分离成具有抗微生物活性的单体抗微生物肽单元，表明分离和纯化抗微生物肽不是必需的。另外，由胃蛋白酶切割成单体单元的抗微生物肽具有高的抗微生物活性，并且因此可有效地用于消除病原体。
在本发明的实例中，用胃蛋白酶处理将多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面上的大肠杆菌菌株，并且然后测量被胃蛋白酶分离的单体抗微生物肽单元的抗微生物活性。结果，可见，单体抗微生物肽具有对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌和酵母酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的高抗微生物活性(实施例6和图7)。
本发明的抗微生物药物组合物可包括药学上可接受的载体。抗微生物药物组合物可为各种口服或肠胃外制剂的形式。使用传统稀释剂或赋形剂配制抗微生物药物组合物，包括填料、膨胀剂、粘结剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂。口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉末、颗粒剂、胶囊等。可通过混合至少一种化合物与一种或多种赋形剂制备这些固体制剂，赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等。另外，口服施用的液体制剂包括悬液、溶液、乳液和糖浆剂等。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡外，还可以包括各种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等。肠胃外使用的制剂包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳液、冻干剂、栓剂等。丙二醇、聚乙二醇、植物油比如橄榄油、注射用酯比如油酸乙酯等可用作非水性溶剂和悬浮剂。栓剂的基质(base)可包括witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、月桂酸甘油酯油(laurin butter)、含甘油的明胶等。另外，制剂可包括将多聚体抗微生物肽复合物展示在抗微生物药物组合物中包括的抗微生物微生物的细胞表面上所需的滋养物。
抗微生物药物组合物可具有选自下述的任何一种剂型：片剂、丸剂、粉末、颗粒剂、胶囊、悬液、溶液、乳液、糖浆剂、灭菌的水溶液、非水溶液、悬液、乳液、冻干的剂型和栓剂。
可以药学上有效的量施用本发明的药物组合物。如本文所使用，术语“药学上有效的量”指在适于任何药学治疗的合理益处/风险比下足以治疗疾病的量。可取决于下述确定组合物的有效剂量水平：对象的类型、疾病严重性、对象的年龄和性别、药物的活性、对药物的敏感性、施用时间、施用路径、***速度、治疗持续时间、与组合物联合施用的药物、和药学领域已知的其他因素。本发明的药物组合物可单独施用或与其他治疗剂联合施用，并且可与传统治疗剂连续施用或同时施用。可以单剂量形式或多剂量形式施用组合物。就上述因素而言，以可展现最大作用而不引起副作用的最小量施用组合物是重要的。
为了治疗由致病细菌、酵母或真菌引起的传染病，本发明的药物组合物可单独或与外科手术、激素疗法、药物疗法和生物反应调节剂联合使用。
在仍另一方面，本发明提供包括作为有效成分的本发明抗微生物微生物的抗微生物非处方(OTC)药物组合物。换句话说，本发明提供用于预防或改善由致病细菌、酵母或真菌引起的传染病的OTC药物组合物。
本发明中，OTC药物组合物可与其他OTC药物或OTC药物组分一起使用并且根据传统的方法适当使用。可根据期望用途(预防性或治疗性治疗)，适当地确定添加的有效成分的量。
OTC药物组合物可为下述形式：消毒剂、沐浴泡沫、漱口液、湿巾纸、去污皂、洗手液、加湿器的填充物、美容面具、软膏剂、或过滤器的填充物。
在仍另一方面，本发明提供制备抗微生物组合物的方法，该抗微生物组合物将本发明的多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面上。
根据本发明的制备方法包括下述步骤：(a)制备包括编码本发明的多聚体抗微生物肽复合物的多核苷酸的重组载体；(b)将重组载体引入宿主细胞以获得转化体；和(c)培养转化体以诱导多聚体抗微生物肽复合物的表达。
通过引入包括本发明DNA的重组载体转化宿主细胞的步骤可使用本领域已知的任何方法进行。转化方法的例子包括但不限于瞬时转染、微注射、转导、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)介导的转染、电穿孔等。
培养转化体以诱导多聚体抗微生物肽复合物的表达的步骤可使用本领域已知的任何方法进行。例如，多聚体抗微生物肽复合物的表达可通过IPTG在LB培养基中37℃下在需氧条件下进行，所述需氧条件是大肠杆菌细胞生长的一般条件。
在本发明的一个实例中，用重组载体pLH0、pLH1、pLH2和pLH3、使用基于CaCl2的转化方法，转化大肠杆菌BL21(DE3)，以便表达本发明的多聚体抗微生物肽复合物(实施例4)。如图6中可见，多聚体抗微生物肽复合物展示在用重组载体转化的大肠杆菌菌株的细胞表面上(图6)。
通过本发明的方法生产的抗微生物微生物将胃蛋白酶消化的多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面上。因此，当抗微生物微生物以活的状态施用在体内时，多聚体抗微生物肽复合物将被胃蛋白酶分离成具有抗微生物活性的单体抗微生物肽单元，表明裂解微生物细胞以及分离和纯化抗微生物肽的步骤不是必需的。另外，分离的抗微生物肽单元展现高的抗微生物活性，并且因此可有效地用于消除病原体。
发明的方式
下文，将参考实施例和测试实施例进一步详细描述本发明。然而，应理解，这些实施例仅仅用于说明的目的并且不打算限制本发明的范围。
实施例1：确定由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体的序列和测定包括 氨基酸连接体的单体抗微生物肽的抗微生物活性
1-1：确定由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体的序列
为了制备被胃蛋白酶分离成单体单元的抗微生物肽多聚体，将韩国专利登记号0441402中公开的SEQ ID NO:1的抗微生物肽单元(SEQID NO.9:RVVRQWPIGRVVRRVVRRVVR)使用任何氨基酸作为连接体彼此连接，从而获得抗微生物肽多聚体。接着，使用计算机程序工具ExPAsy(Expert蛋白分析***，Swiss)确定由胃蛋白酶消化将肽多聚体分离成单体形式的氨基酸连接体的序列。结果，亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸每一个的C末端和抗微生物肽的N末端之间形成的肽键被胃蛋白酶消化，并且每个所述氨基酸被确定为由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体。
1-2：测定具有添加的、由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体的单体抗 微生物肽的抗微生物活性
使用程序预测通过添加由胃蛋白酶消化的氨基酸连接体至抗微生物肽获得的抗微生物肽多聚体的氨基酸序列，并且作为结果，显示胃蛋白酶作用在亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的下游。基于该发现，对于这三种肽，通过化学合成获得95%纯的抗微生物肽。
通过96孔微稀释最小抑菌浓度试验，测定制备的抗微生物肽对微生物的抗微生物活性。具体地，将细菌和真菌分别在37℃和30℃下在胰胨豆胨培养液(TSB)中培养过夜，然后在新鲜培养基中接种细胞并且培养2小时至指数生长期。然后，稀释细胞至105个细胞/ml的密度，并且将10μl的稀释物接种在96孔板的每个孔中，其后用10μl的连续稀释的抗微生物肽处理每个孔。温育96孔板12小时，并且测量每个孔的吸光度。这里，微生物细胞不能生长的最小浓度确定为最小抑菌浓度。测量结果显示在下面的表1中。表1中，Hinge2L、Hinge2F和Hinge2Y分别表示通过添加亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸至SEQ ID NO:9的抗微生物肽获得的抗微生物肽。
表1
Hinge2L Hinge2F Hinge2Y
金黄色葡萄球菌(G+) 2μl 4μl 8μl
大肠杆菌(G-) 2μl 4μl 8μl
酿酒酵母菌(酵母) 2μl 4μl 8μl
从上表1中的结果可见，包括添加至抗微生物肽的亮氨酸的肽具有抗革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌和酵母酿酒酵母菌的最高的抗微生物活性2μl/ml(表1)。
实施例2：制备由胃蛋白酶消化的抗微生物肽多聚体
构建DNA片段，其编码如实施例1中所描述的包括由胃蛋白酶消化的、添加至抗微生物肽的C末端的氨基酸连接体(亮氨酸)的单体抗微生物肽(Hinge2L)。将DNA载体克隆至载体。具体地，使用引物SEQ IDNO:1
(5'-GAAGACCCCGTGTTGTTCGTCAGTGGCCGATTGGTCGTGTCGTTCGCCGTGTTGTTCG-3')和SEQ ID NO:2
(5'-GGATGGATCCTAAGCACGCAGACGAACGACGCGACGAACAACACGGCGAACGACACG-3')进行PCR，从而获得双链DNA片段，其编码包括由胃蛋白酶消化的、添加至SEQ ID NO:9的抗微生物肽的C末端的氨基酸连接体亮氨酸的单体抗微生物肽(由22个氨基酸组成)。PCR反应进行30个循环，每个循环由在94℃下DNA变性30秒、在56℃下退火30秒和在72℃下DNA合成30秒组成。为了克隆，将限制酶BbsI识别位点(5'-GAAGAC(N)2▼-3'，3'-CTTCTG(N)6▲-5')引入单体抗微生物肽的N末端，并将FokI识别位点(5'-GGATG(N)9▼-3'，3'-CCTAC(N)13▲-5')引入C末端。
接着，将获得的DNA片段***pGEM T-easy载体，将所得载体命名为“pMBT-H”。
另外，为了构建抗微生物肽多聚体，通过PCR构建的编码单体抗微生物肽Hinge2L的DNA片段，用限制酶BbsI和FokI消化，然后***用限制酶BbsI消化的pMBT-H载体，从而构建包括连接至其上的两个Hinge2L单元的pMBT-H2载体。以相同的过程，构建pMBT-H3、pMBT-H4···pMBT-Hn(图2)。
实施例3：构建和克隆连接至细胞表面锚定基序的抗微生物肽多聚 体的DNA片段
3-1：构建和克隆连接至Lpp-OmpA的抗微生物肽多聚体DNA
为了将抗微生物肽多聚体展示在宿主细胞表面上，构建用作细胞表面锚定基序的Lpp-OmpA DNA片段，其具有包括连接至大肠杆菌脂蛋白的前导序列和连接至细胞外膜的一部分大肠杆菌外膜蛋白A(OmpA)的SEQ ID NO:7的核苷酸序列。将Lpp-OmpA DNA片段克隆至载体。
具体地，为了构建Lpp-OmpA DNA片段，合成SEQ ID NO:3
(5'-CGCCATATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCAACAACAATGGCCCGACC-3')、SEQ ID NO:4
(5'-GCAAACACCGGAGAAACGCCGGTG-3')、SEQ ID NO:5
(5'-TTCTCCGGTGTTTGCTGGCGGTGTTG-3')和SEQ ID NO:6
(5'-CGGGATCCTAGTGATGGTGATGGTGATGAACACGCAGTCTTCCACGGGTAG-3')，使用作为模板的大肠杆菌MG1655的基因组DNA和合成的引物进行30个循环的重组PCR，每个循环由在94℃下DNA变性30秒、54℃下退火30秒和在72℃下DNA合成90秒组成，从而获得编码由123个氨基酸组成的Lpp-OmpA多肽的DNA片段(369个核苷酸)。
接着，为了实现有效的克隆，同时防止表达期间发生氨基酸的改变，用G替换通过重组PCR获得的Lpp-OmpA DNA序列的限制酶BbsI识别位点的位置321处的C，并且用T替换位置324处的C，从而构建Lpp-OmpA DNA片段(SEQ ID NO:7)。为了将构建的Lpp-OmpADNA片段克隆至载体，将限制酶NdeI识别位点(CATATG)引入Lpp-OmpA的N末端，和将限制酶BbsI识别位点(5'-GAAGAC(N)▼-3'，3'-CTTCTG(N)6▲-5')***C末端，从而可连接实施例2中构建的抗微生物肽多聚体DNA片段，并且也将限制酶BamHI识别位点(GGATCC)引入C末端。另外，为了确认表达，引入His标签。
将获得的DNA片段***pGEM T-easy载体，并且所得的载体命名为“pLO载体”。用BbsI消化pLO载体，并且用限制酶BbsI和FokI消化实施例2中构建的pMBT-Hn，以获得抗微生物肽多聚体Hinge2Ln的DNA片段，其接着连接用限制酶消化的pLO载体，从而构建pLO-Hinge2Ln载体(n表示单体抗微生物肽Hinge2L单元的数量；图2)，其包括由连接至Lpp-OmpA的抗微生物肽多聚体DNA组成的DNA片段(Lpp-OmpA-Hinge2Ln)。
3-2：测定Lpp-OmpA-Hinge2Ln DNA片段的大小
为了确认DNA片段是否被克隆，测量实施例3-1中构建的***pLO-Hinge2Ln载体中的Lpp-OmpA-Hinge2Ln DNA片段的大小。
具体地，用限制酶NotI处理每个pLO-Hinge2Ln载体，并且测量***每个载体的Lpp-OmpA-Hinge2Ln DNA片段的大小。测量的结果显示在图3。对于电泳，将0.3g的1%琼脂糖凝胶添加至30ml的1X TBE(Tris、硼酸、EDTA)缓冲液并且在微波炉中煮沸。将溶液倒入模具并且使其静置30分钟以硬化。接着，将10μl的Lpp-OmpA-Hinge2Ln DNA溶液添加至2μl的6X上样染料，上样在凝胶上，并且在100V下电泳40分钟。接着，在EtBr溶液中染色凝胶20分钟并且用水冲洗15分钟。
图3是显示Lpp-OmpA-Hinge2Ln DNA片段大小的电泳图像。图3中，M表示DNA大小标记，和泳道LH0、LH1、LH2、LH3和LH4表示Lpp-OmpA-Hinge2Ln DNA片段的大小。具体地，LH0表示Lpp-OmpA，和LH1、LH2、LH3和LH4分别表示连接至细胞表面锚定基序Lpp-OmpA的单体抗微生物肽单元。
如图3中可见，包括连接至细胞表面锚定基序Lpp-OmpA的抗微生物肽多聚体的多聚体抗微生物肽复合物(Lpp-OmpA-Hinge2Ln DNA)被有效地克隆至载体(图3)。
实施例4：构建将多聚体抗微生物肽复合物(Lpp-OmpA-Hinge2Ln) 展示在细胞表面上的微生物
如图4中显示，将多聚体抗微生物肽复合物和His标签连接至Lpp-OmpA DNA，从而构建重组载体。具体地，用限制酶NdeI和BamHI处理实施例3中构建的每个pLO-Hinge2Ln载体，以获得Lpp-OmpA-Hinge2Ln DNA片段，并且使用凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)，从中分离具有期望大小的DNA片段。
将每个分离的DNA片段连接至用NdeI和BamHI消化的pET21c载体，从而构建pLHn(pLH0、pLH1、pLH2···，n=Hinge2L单体的数量)载体(图4)。接着，通过基于CaCl2的转化方法将pLH0、pLH1、pLH2和pLH3载体的每一个引入大肠杆菌BL21(DE3)。
实施例5：检查多聚体抗微生物肽复合物(Lpp-OmpA-Hinge2Ln)是 否展示在细胞表面上
检查多聚体抗微生物肽复合物是否展示在实施例4的转化的大肠杆菌菌株的细胞表面上。具体地，在LB培养基(Luria Botani，1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%NaCl)中培养转化的大肠杆菌细胞，并且当培养基达到0.5-0.6的OD600时，向其添加0.2mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，以诱导多聚体抗微生物肽复合物表达在细胞表面上。诱导表达之后4小时，去除培养基，并且用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗细胞，将含0.2%BSA(牛血清白蛋白)的PBS和His-标签一抗添加至细胞，随后在冰上温育30分钟。温育之后，用PBS冲洗细胞两次，将FITC轭合的His标签二抗添加至细胞，随后在避光条件下在冰上温育30分钟。接着，大肠杆菌细胞用PBS冲洗，再悬浮在PBS中，并且用共焦显微镜观察。
结果，显示未连接至单体抗微生物肽的细胞表面锚定基序的表达通过IPTG诱导(LH0)，细胞表面锚定基序-单体抗微生物肽、细胞表面锚定基序-二聚体肽和细胞表面锚定基序-三聚体肽的表达通过IPTG诱导(图5)。
另外，可见连接至细胞表面锚定基序的多聚体抗微生物肽复合物LH1、LH2和LH3通过IPTG展示在转化的大肠杆菌的细胞表面(图6)。
实施例6：检查展示在细胞表面上的多聚体抗微生物肽复合物的抗 微生物活性
测量实施例4中构建的并且将多聚体抗微生物肽复合物展示在细胞表面上的大肠杆菌菌株的抗微生物效果。具体地，在100ml的LB培养基中培养转化的大肠杆菌BL21(DE3)，并且当培养基达到0.5-0.6的OD600时，向其添加0.2mM IPTG，以诱导连接至细胞表面锚定基序的多聚体抗微生物肽复合物的表达。在诱导表达之后4小时，去除培养基，并且细胞用NAPB(磷酸钠缓冲液)冲洗两次，接着再悬浮在相同的缓冲液中。将所有的大肠杆菌样品调整至1×1010cfu/ml的细胞数量。接着，将胃蛋白酶溶解在人工胃液(SGF)(0.084N HCl、35mM NaCl、pH1.2或2.0)中，并用胃蛋白酶溶液处理大肠杆菌细胞并且温育30分钟。温育之后，为了灭活胃蛋白酶以及中和pH，添加与人工胃液相同浓度的NaOH水溶液至细胞，并且离心细胞溶液以去除细胞碎片而不是由胃蛋白酶消化的单体抗微生物肽。
测量胃蛋白酶消化的单体抗微生物肽对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌和酵母酿酒酵母菌的抗微生物活性。
在培养期间的指数生长期收集每个微生物菌株，用NAPB冲洗两次，接着再悬浮在相同的缓冲液中。调整微生物细胞的数量至1×105cfu/ml。将10μl含每个微生物菌株和胃蛋白酶消化的单体抗微生物肽的水溶液分配在96孔板的每个孔中，混合孔并且在37℃下温育3小时。3小时后，添加2×TSB(胰蛋白酶豆胨培养液)培养基至细胞，其随后在37℃下温育12小时，然后测量OD595处的吸光度。
结果，在多聚体抗微生物肽复合物中，LH3显示17.95%抗革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、30%抗革兰氏阴性大肠杆菌和33.17%抗酵母酿酒酵母菌的抗微生物活性，表明LH3显示了最高的抗微生物活性(图7)。这种结果说明，随着其中的单体抗微生物肽单元的数量增加，多聚体抗微生物肽复合物的抗微生物活性增加，并且当展示该多聚体抗微生物肽复合物的抗微生物微生物在体内施用时，它们可显示抗微生物作用，包括消除病原体和活化免疫细胞。因此，可见可使用该抗微生物肽而不必分离和纯化抗微生物肽，表明该抗微生物肽可具有宽泛的用途。
Figure IDA00003620285700011
Figure IDA00003620285700021
Figure IDA00003620285700031
Figure IDA00003620285700051
Figure IDA00003620285700061
Figure IDA00003620285700071

Claims (23)

1.多聚体抗微生物肽复合物，其包括抗微生物肽多聚体和与所述多聚体连接的细胞表面锚定基序，其中所述抗微生物肽多聚体包括由下列式1或2表示的至少一个单体：
式1
N末端-[抗微生物肽-胃蛋白酶消化的氨基酸连接体]-C末端，
式2
N末端-[胃蛋白酶消化的氨基酸连接体-抗微生物肽]-C末端，
其中所述抗微生物肽不包括所述连接体中使用的氨基酸。
2.权利要求1所述的多聚体抗微生物肽复合物，其中所述抗微生物肽具有由SEQ ID NOS:9至24表示的氨基酸序列中的任一个。
3.权利要求1所述的多聚体抗微生物肽复合物，其中所述胃蛋白酶消化的氨基酸连接体选自亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
4.权利要求1所述的多聚体抗微生物肽复合物，其中所述细胞表面锚定基序被连接至所述多聚体的N末端。
5.权利要求1所述的多聚体抗微生物肽复合物，其中所述细胞表面锚定基序是外膜蛋白。
6.权利要求5所述的多聚体抗微生物肽复合物，其中所述外膜蛋白选自大肠杆菌外膜蛋白OmpA、连接至大肠杆菌脂蛋白的前导序列的大肠杆菌外膜蛋白OmpA、大肠杆菌外膜蛋白OmpS、大肠杆菌外膜蛋白LamB、大肠杆菌外膜蛋白PhoE、大肠杆菌外膜蛋白OmpC、大肠杆菌外膜蛋白FadL、沙门氏菌外膜蛋白OmpC和假单胞菌外膜蛋白OprF。
7.权利要求6所述的多聚体抗微生物肽复合物，其中所述连接至大肠杆菌脂蛋白的前导序列的大肠杆菌外膜蛋白OmpA具有由SEQ IDNO:8表示的氨基酸序列。
8.权利要求1所述的多聚体抗微生物肽复合物，其中所述抗微生物肽具有由SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列，所述胃蛋白酶消化的氨基酸连接体是亮氨酸，并且所述细胞表面锚定基序具有由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列。
9.抗微生物肽多聚体，其包括由下列式1或2表示的至少一个单体：
式1
N末端-[抗微生物肽-胃蛋白酶消化的氨基酸连接体]-C末端，
式2
N末端-[胃蛋白酶消化的氨基酸连接体-抗微生物肽]-C末端，
其中所述抗微生物肽不包括所述连接体中使用的氨基酸。
10.多核苷酸，其编码权利要求1至8任一项所述的多聚体抗微生物肽复合物。
11.多核苷酸，其编码权利要求9所述的多聚体。
12.权利要求10所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有由SEQID NOS:25至27表示的核苷酸序列中的任一个。
13.权利要求11所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有由SEQID NOS:28至30表示的核苷酸序列中的任一个。
14.重组载体，其包括权利要求10至13任一项所述的多核苷酸。
15.抗微生物微生物，其用权利要求14所述的重组载体转化以将多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面上。
16.权利要求15所述的抗微生物微生物，其中所述抗微生物微生物在体内将所述多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面上。
17.抗微生物药物组合物，其包括作为有效成分的权利要求1至8任一项所述的多聚体抗微生物肽复合物。
18.抗微生物药物组合物，其包括作为有效成分的权利要求9所述的多聚体。
19.抗微生物药物组合物，其包括作为有效成分的权利要求15或16所述的抗微生物微生物。
20.抗微生物非处方(OTC)药物组合物，其包括作为有效成分的权利要求15或16所述的抗微生物微生物。
21.生产将多聚体抗微生物肽复合物展示在其细胞表面上的抗微生物微生物的方法，包括(a)制备包括编码权利要求1至8所述的多聚体抗微生物肽复合物的多核苷酸的重组载体；(b)将所述重组载体引入宿主细胞以获得转化体；和(c)培养所述转化体以诱导所述多聚体抗微生物肽复合物的表达。
22.治疗由致病细菌、酵母或真菌引起的传染病的方法，其包括施用权利要求17至19任一项所述的抗微生物药物组合物至具有所述传染病的对象。
23.权利要求22所述的方法，其中所述传染病是选自下述的一种或多种：霍乱、细菌性痢疾、百日咳、伤寒、喉白喉、鼻白喉、腺鼠疫、鼠疫性肺炎、猩红热、类丹毒、败血症、脓皮病、肺结核、关节结核、肾结核、结核性脑膜炎、细菌性胃肠炎、隐球菌病、白假丝酵母病、皮肤癣菌病、浅部真菌病、脑膜炎、脑脓肿、脑瘤、组织胞浆菌病、肺孢子虫性肺炎和曲霉菌病。
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