CN103451284B - 一组人类心肌细胞的新型分子标记物及其应用 - Google Patents
一组人类心肌细胞的新型分子标记物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一组人类心肌细胞的新型分子标记物及其应用。该组标记物由如下29种基因组成：POPDC2、ALPK2、TRIM55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX、NRK、ABLIM1、SYNPO2L、ANKRD1、TNNI1、MYH6、ABRA、TPM1、C15orf52、MYOM1、MASP1、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2。本发明的标记物在心肌细胞的筛选和鉴定上具有重要作用，并且在人类心脏早期发育研究、心脏疾病模型构建、心脏疾病的治疗以及心脏疾病药物靶点的开发或药物研发中都具有潜在的作用与极大的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一组人类心肌细胞的新型分子标记物及其应用。
背景技术
心脏病是威胁人类健康的杀手，每年都有上千万人因罹患各类心脏疾病失去生命，给家庭和公共卫生事业带来了极大的压力和负担。无论在发达国家还是发展中国家，心脏病的发病率和病死率都居高不下，然而面对如此严峻的考验，目前心脏疾病的治疗却不容乐观，药物治疗停留在缓解症状的阶段，手术治疗如搭桥手术等开支较大且存在一定的风险和可能的副作用，介入治疗也仍处于探索阶段，鲜有标本兼治的治疗方法问世。究其原因，很大一方面是人类对心脏以及心脏疾病认识的不足。心脏疾病的病因追根溯源是心肌细胞的缺失或功能的紊乱。因而未来根治心脏疾病的一个思路便是研究心脏病的分子致病机理，寻找影响心脏纤维化或者心肌细胞增殖的决定性因子，实现对紊乱的心肌细胞进行人为调控使其恢复正常功能的目的（1）。
近年来，随着诱导型多能干细胞（induced Pluripotency Stem Cells，iPSCs）技术的产生，人们能够在体外获得iPSCs并分化为病人特异的心肌细胞，通过基因矫正或其他手段得到“健康”的病人来源的心肌细胞（1）；利用转分化（transdifferentiation）技术可以不经过iPSCs过程由其他便于获得的细胞类型直接获得心肌细胞（2），这些技术的发展为将来实现在病人体内的细胞移植治疗提供了可能。
1.Mordwinkin NM,Burridge PW,Wu JC.2013.A review of human pluripotentstem cell-derived cardiomyocytes for high-throughput drug discovery,cardiotoxicity screening,and publication standards.Journal ofcardiovascular translational research6:22-30.
2.Wada R,Muraoka N,Inagawa K,Yamakawa H,Miyamoto K,Sadahiro T,UmeiT,Kaneda R,Suzuki T,Kamiya K,Tohyama S,Yuasa S,Kokaji K,Aeba R,YozuR,Yamagishi H,Kitamura T,Fukuda K,Ieda M.2013.Induction of humancardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors.Proceedings ofthe National Academy of Sciences110：12667-12672.
发明内容
本发明的目的是提供一组人类心肌细胞的新型分子标记物及其应用。
本发明提供的一组用于鉴定或辅助鉴定人类心肌细胞的标记物，由如下29种基因组成：POPDC2、ALPK2、TRIM55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX、NRK、ABLIM1、SYNPO2L、ANKRD1、TNNI1、MYH6、ABRA、TPM1、C15orf52、MYOM1、MASP1、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2。
所述29种基因满足如下条件：与人类胚胎多能干细胞和/或人类神经干细胞相比，在人类心肌细胞中该29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平均显著降低、且在人类心肌细胞中该29种基因的mRNA表达量均显著提高。
上述标记物中，所述该29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平均显著降低是指在人类心肌细胞中每种基因的启动子区CpG岛甲基化的量均比人类胚胎多能干细胞和/或人类神经干细胞中相同基因的启动子区CpG岛甲基化的量降低5%以上。
所述该29种基因的mRNA表达量均显著提高是指在人类心肌细胞中每种基因的mRNA表达量均是人类胚胎多能干细胞和/或人类神经干细胞中相同基因mRNA表达量的2倍以上。
上述任一所述标记物在鉴定人心肌细胞中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述应用为非疾病治疗或诊断方法。
上述任一所述标记物在制备、开发或设计鉴定人心肌细胞的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述标记物在从人心肌细胞、人胚胎多能干细胞和人神经干细胞中鉴定出人心肌细胞中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述标记物在从人心肌细胞和人胚胎多能干细胞中鉴定出人心肌细胞中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述标记物在制备、开发或设计具有如下功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围：从人心肌细胞、人胚胎多能干细胞和人神经干细胞中鉴定出人心肌细胞。
上述任一所述标记物在制备、开发或设计具有如下功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围：从人心肌细胞和人胚胎多能干细胞中鉴定出人心肌细胞。
上述任一所述的应用中，所述人心肌细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的；所述人神经干细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的。
检测29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平的物质和检测29种基因的mRNA表达量的物质在制备鉴定人类心肌细胞的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
所述29种基因为POPDC2、ALPK2、TRIM55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX、NRK、ABLIM1、SYNPO2L、ANKRD1、TNNI1、MYH6、ABRA、TPM1、C15orf52、MYOM1、MASP1、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2。
检测29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平的物质和检测29种基因的mRNA表达量的物质在制备具有如下功能的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围：从人心肌细胞、人胚胎多能干细胞和人神经干细胞中鉴定出人心肌细胞。
所述29种基因为POPDC2、ALPK2、TRIM55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX、NRK、ABLIM1、SYNPO2L、ANKRD1、TNNI1、MYH6、ABRA、TPM1、C15orf52、MYOM1、MASP1、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2。
检测29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平的物质和检测29种基因的mRNA表达量的物质在制备具有如下功能的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围：从人心肌细胞和人胚胎多能干细胞中鉴定出人心肌细胞。
所述29种基因为POPDC2、ALPK2、TRIM55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX、NRK、ABLIM1、SYNPO2L、ANKRD1、TNNI1、MYH6、ABRA、TPM1、C15orf52、MYOM1、MASP1、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2。
上述任一所述应用中，所述人心肌细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的；所述人神经干细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的。
上述任一所述应用中，所述由人胚胎多能干细胞分化而来的人心肌细胞中和所述由人胚胎多能干细胞分化而来的人神经干细胞中，所述人胚胎多能干细胞为同一株系的人胚胎多能干细胞。
由于H9-ESC，H9-NSC及H9-CM具有完全相同的基因型与遗传背景，将H9-ESC或H9-NSC作为对照，进行转录组及全基因组DNA甲基化分析具有严格的无偏见性。通过大规模比较H9-ESC，H9-NSC及H9-CM的基因表达谱和全基因组DNA甲基化谱，筛选出29种新型分子标记物。本发明涉及的新型分子标记物在心肌细胞的筛选和鉴定上具有重要作用，并且在心脏疾病模型构建、心脏疾病的治疗以及心脏疾病药物靶点开发或药物研发中都具有潜在的作用与极大的意义。
附图说明
图1为人类心肌细胞的鉴定。
图2为人类胚胎多能干细胞、人类神经干细胞和人类心肌细胞基因表达热图以及qPCR验证。
图3为人类胚胎多能干细胞、人类神经干细胞和人类心肌细胞中全基因组启动子区CpG岛甲基化水平热图。
图4为编码心肌结构蛋白与心脏转录因子的基因的DNA去甲基化与基因表达水平正相关性分析。
图5为双核心稳定调控网络。
图6为功能相关性网络分析。
图7为基因-疾病网络分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
人类胚胎多能干细胞系H9购自美国WiCell Research Institute，货号为WA09(H9)-DL-7；
丝裂霉素购自美国Sigma公司，货号为M0503；
小鼠胚胎成纤维细胞购自美国Millipore公司，货号为PMEF-CFL；
细胞外基质(qualified-Matrigel)购自美国BD Biosciences，货号为354277；
DMEM/F12培养基购自Invitrogen公司，货号为11320-033；
CDF12培养基配方如下：
DMEM/F12(购自Invitrogen，货号为11320-033)、0.1mM非必需氨基酸(购自Invitrogen，货号为11140-050)、1mM GlutaMAXTM二肽(购自Invitrogen，货号为35050-061)、20%Knockout血清替代物(购自Invitrogen，货号为N10828-028)、1%青霉素/链霉素(购自Invitrogen，货号为15070-063)、55μMβ-巯基乙醇(购自Invitrogen，货号为21985-023)和10ng/ml Human FGF2(购自Joint Protein Central)；
RPMI1640培养基购自Invitrogen公司，货号为11875119；
B27添加剂购自Invitrogen公司，货号为0080085SA；
B27（不含Insulin）添加剂购自Invitrogen公司，货号为0050129SA；
mTeSR培养基购自美国StemCell Technologies；
ROCK抑制剂Y-27632购自Sigma-Aldrich，货号为Y0503；
CHIR99021购自Selleck；
Wnt抑制剂IWP4购自Stemgent；
Triton X-100购自Sigma，货号T-8787；
鼠抗cTnT购自Lab Vision；
鼠抗MF20购自Developmental Studies Hybridoma Bank；
兔抗MLC2v购自ProteinTech Group；
鼠抗α-Actinin购自Sigma-Aldrich；
二抗Alex Fluor488goat anti-mouse IgG购自Life Technologies；
二抗Alex Fluor568goat anti-rabbit IgG购自Life Technologies；
人类胚胎多能干细胞系H9来源的神经干细胞（hNSCs）及分化方案在文献“Liu GH,Qu J,Suzuki K,Nivet E,Li M,Montserrat N,Yi F,Xu X,Ruiz S,Zhang W,WagnerU,Kim A,Ren B,Li Y,Goebl A,Kim J,Soligalla RD,Dubova I,Thompson J,YatesJ,3rd,Esteban CR,Sancho-Martinez I,Izpisua Belmonte JC.2012.Progressivedegeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2.Nature491:603-607.”中公开过，公众可从中国科学院生物物理研究所获得人类胚胎多能干细胞来源的神经干细胞（hNSCs）；
RNeasy Mini Kit购自QIAGEN；
AffymetrixGeneChipPrimeView Human Gene Expression Arrays购自Affymetrix，货号为901837。
实施例1、人类胚胎多能干细胞的培养
将人类胚胎多能干细胞系H9利用如下方法进行培养：
一、将H9细胞接种至预先培养了经过丝裂霉素灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的培养板中，使用人类多能干细胞培养基(CDF12培养基)与小鼠胚胎成纤维细胞共同培养。
二、用DMEM/F12培养基将细胞外基质稀释至体积分数为1%的浓度，并用稀释后的细胞外基质包被培养板。
三、将步骤一培养的H9细胞接种至预先用体积分数为1%的细胞外基质包被的培养板中，使用mTeSR培养基培养。
实施例2、人类胚胎多能干细胞向人类心肌细胞分化
人类胚胎多能干细胞系H9向人类心肌细胞分化方案基于Palecek方案（Lian X,Hsiao C,Wilson G,Zhu K,Hazeltine LB,Azarin SM,Raval KK,Zhang J,Kamp TJ,Palecek SP.2012.Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotentstem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America109:E1848-1857.）进行改进，改进后的方案进一步提高了人类心肌细胞的纯度,该方案的具体步骤如下：
一、用DMEM/F12培养基将细胞外基质稀释至体积分数为1%的浓度，用稀释后的细胞外基质包被培养板。
二、将人类胚胎多能干细胞系H9消化为单细胞悬液，以105个细胞/cm2的密度接种到经体积分数为1%的细胞外基质包被的培养板中，添加含有10μM ROCK抑制剂Y-27632的mTeSR培养基。37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时，然后改用mTeSR培养基继续培养48小时。
三、起始心肌细胞的分化。
（一）在第1天换用含有12μM CHIR99021的RPMI/B27-insulin培养基培养24小时，24小时后更换为RPMI/B27-insulin培养基继续培养。
（二）第3天换用含有5μM Wnt抑制剂IWP4的RPMI/B27-insulin培养基培养48h，期间不换液。
（三）从第5天起每隔2-3天更换RPMI/B27培养基继续培养。
（四）第15天，将肉眼可见的可自主收缩的人类心肌细胞薄片或团块通过机器分选或人工挑取进行收集。
（五）将收集的细胞重新接种到经体积分数为1%的细胞外基质包被的培养板中，用RPMI/B27培养基进行培养。
实施例3、人类心肌细胞的鉴定
人类胚胎多能干细胞来源的人类心肌细胞不仅在形态上表现出心肌细胞特有的收缩功能，并且可以进一步通过免疫荧光及流式细胞术对心肌细胞特异性的生物学标记进行鉴定。
一、免疫荧光鉴定
（一）将实施例2得到的人类心肌细胞分为四组，各组分别经4%多聚甲醛固定，0.3%Triton X-100/PBS通透。然后四组分别与四种一抗（鼠抗cTnT,鼠抗MF20,兔抗MLC2v,鼠抗α-Actinin）4℃孵育过夜。将一抗清洗后于室温进行二抗孵育1小时，其中第一组使用的二抗为Alex Fluor488goat anti-mouse IgG，第二组使用的二抗为Alex Fluor488goat anti-mouse IgG，第三组同时使用二抗Alex Fluor488goatanti-mouse IgG和二抗Alex Fluor568goat anti-rabbit IgG进行孵育。
（二）细胞核用DAPI进行负染。激光共聚焦显微镜采集图像进行分析。
cTnT为心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T）；
MF20为肌球蛋白重链；
MLC2v为肌球蛋白轻链2v(myosin light chain2V)；
α-Actinin为肌动蛋白。
结果如图1A所示。
图1A中，1（a-c）表示cTnT在不同放大倍率下的染色结果，2（a-c）表示MF20在不同放大倍率下的染色结果，3a表示α-Actinin的染色结果，3b表示MCL2v的染色结果，3c为3a和3b重叠的结果。
结果表明，人类胚胎多能干细胞来源的人类心肌细胞能够表达心肌特异的标记物心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T）和肌球蛋白，通过对肌球蛋白和肌动蛋白的免疫荧光染色可观察到心肌纤维结构。
二、流式细胞术鉴定
结果如图1B所示。
图1B表明，分化得到的人类心肌细胞群中大约96%是cTnT阳性细胞，大约91%是MF20阳性的细胞。
实施例4、转录组分析
一、设置三组样品：人类胚胎多能干细胞（hESCs）H9（以下简称为H9-ESC），人类胚胎多能干细胞系H9来源的神经干细胞（hNSCs）（以下简称为H9-NSC）以及实施例3鉴定出的人类胚胎多能干细胞系H9来源的人类心肌细胞（hCMs）（以下简称为H9-CM），每组细胞样品共设三个平行。
二、使用Trizol法提取各组细胞各样品的总RNA，并使用RNeasy Mini Kit进一步纯化。
三、将三组细胞的样品用“AffymetrixGeneChipPrimeView Human Gene ExpressionArrays”基因芯片处理。
四、表达差异比较
分析比较各组细胞中不同基因在H9-ESC、H9-NSC及H9-CM中的表达情况。由AffymetrixGeneChip Scanner30007G采集基因芯片的表达信号。利用R/Bioconductor处理表达信号，根据RMA算法归一化后转换为对应的基因表达值，并绘制H9-ESC、H9-NSC和H9-CM三种细胞各3份样品的表达热图（heatmap），结果如图2A所示。
图2A中，
hESC＃1、hESC＃2和hESC＃3分别为H9-ESC的三个平行样品；
hNSC＃1、hNSC＃2和hNSC＃3分别为H9-NSC的三个平行样品；
hCM＃1、hCM＃2和hCM＃3分别为H9-CM的三个平行样品；
1/4x表示基因的表达水平下调到4倍；
1/2x表示基因的表达水平下调到2倍；
1x表示基因的表达水平无显著变化；
2x表示基因的表达水平上调到2倍；
4x表示基因的表达水平上调到4倍。
图中是以人胚胎干细胞H9-ESC作为基因上调和下调的标准。
经过分析，与基因在H9-ESC和H9-NSC中的表达量相比，共有695个基因在H9-CM中的表达量同时是H9-ESC和H9-NSC中的表达量的2倍以上，共有401个基因在H9-CM中的表达量均不足H9-ESC和H9-NSC中的表达量的一半。
五、实时荧光定量PCR验证关键基因的表达结果，表1为各关键基因的引物。其中部分结果如图2B所示，验证结果与芯片分析得到的结果一致。
表1验证引物
| 基因 | 正向引物序列(5’-3’) | 反向引物序列(5’-3’) |
| ACTA2 | GTGTTGCCCCTGAAGAGCAT | GCTGGGACATTGAAAGTCTCA |
| CASQ2 | GGCAGAAGAGGGGCTTAATTT | GAAGACACCGGCTCATGGTAG |
| CREM | ACACCACCTAGTATTGCTACCA | GGATTGTTCCACCTTGGGCTAT |
| CSRP3 | CCTGTGAAAAGACCGTCTACC | GTCGTGCTGTCAAGAGCCT |
| DTNA | TACCCACGGAAGTTTTGGAGG | GGATCTGACATAAGCGTGTCC |
| EYA4 | CTTCTTGCAGTCAAAACAGAGC | GTGGATAGGGCTTGGAAGGAT |
| FBXO32 | GCCTTTGTGCCTACAACTGAA | CTGCCCTTTGTCTGACAGAAT |
| GATA4 | CGACACCCCAATCTCGATATG | GTTGCACAGATAGTGACCCGT |
| GATA5 | CTTCGTGTCCGACTTCTTGGA | CCGAGGCATTCCTTGTGGA |
| GATA6 | CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT | GTCGAGGTCAGTGAACAGCA |
| HAND2 | CGCCGACACCAAACTCTCC | TCGCCATTCTGGTCGTCCT |
| HECW2 | AAATCCCCAGATGCGGTACAC | CGGCTCTCAGAAGTCACCA |
| ISL1 | GCGGAGTGTAATCAGTATTTGGA | GCATTTGATCCCGTACAACCT |
| KCNA5 | CGCGTCCACATCAACATCTC | GGTAGAAGCGTATCTCGTCCG |
| LBH | GCCCCGACTATCTGAGATCG | GCGGTCAAAATCTGACGGGT |
| LDB3 | CTATCTCCCGGATCACACCAG | GTGAGGCTCAAGTTGTAGCTG |
| leftY2 | TGGACCTCAGGGACTATGGAG | CCGAGGCGATACACTGTCG |
| MARCH11 | CCGGGGAGAGTCTTCCACA | GCCTCATCCGATTGAACAGGT |
| MEF2A | ACTACAGACCTCACAGTGCCA | GCCTAAGCTATTTGCACCAGT |
| MEF2C | CCAACTTCGAGATGCCAGTCT | GTCGATGTGTTACACCAGGAG |
| MIR21 | CTGCCTGACTGTCTGCTTGTTT | AGATTCAACAGTCAACATCAGTCTGA |
| MITF | CAGTCCGAATCGGGGATCG | TGCTCTTCAGCGGTTGACTTT |
| MYBPC3 | CCATGACGCTGAGGTCAAATG | GCTTGGCACCGATGGACTC |
| MYOCD | ACGGATGCTTTTGCCTTTGAA | AACCTGTCGAAGGGGTATCTG |
| MYOZ2 | CCAGGCTATTTAAGATGCGTCA | CCTTCCAAGTTACTTCCATCCAC |
| NEXN | ACTGTGAAGGGTAGATTTGCTG | TTCTGCGTTTTCGTTCCTCCT |
| NKX2 | CCAAGGACCCTAGAGCCGAA | ATAGGCGGGGTAGGCGTTAT |
| NPPA | CAACGCAGACCTGATGGATTT | AGCCCCCGCTTCTTCATTC |
| NPPB | TGGAAACGTCCGGGTTACAG | CTGATCCGGTCCATCTTCCT |
| PCGF5 | AGCCAACAACAGTGACGGAAT | TGAACTTGGTTGCCACACCTT |
| PLN | ACCTCACTCGCTCAGCTATAA | CATCACGATGATACAGATCAGCA |
| PPAPDC3 | AGCTGAACCCCTCCTTCAAG | CCGATGACAAAGCCGGAGA |
| PPARGC1A | TCTGAGTCTGTATGGAGTGACAT | CCAAGTCGTTCACATCTAGTTCA |
| PRICKLE1 | TTTGCTTGCTTACCAGAGGAAA | ACTGGCAATACCGTACCTCAT |
| RARB | TCCGAAAAGCTCACCAGGAAA | GGCCAGTTCACTGAATTTGTCC |
| SMAD6 | GCTACCAACTCCCTCATCACT | CGTACACCGCATAGAGGCG |
| SMAD7 | TTCCTCCGCTGAAACAGGG | CCTCCCAGTATGCCACCAC |
| SNTA1 | TGCTCCTCTACTTGTCTCTCC | TCTGCATCGTAGGGCACTGA |
| STAT4 | TGTTGGCCCAATGGATTGAAA | GGAAACACGACCTAACTGTTCAT |
| TBX2 | GCTGACGATTGCCGCTATAAG | GGCTGTCTGGGTGGATGTA |
| TCEA3 | AAGAGCACGGACATGAAGTACC | CTCTGCCGTCATCTTGGCTA |
| TNNT2 | GGAGGAGTCCAAACCAAAGCC | TCAAAGTCCACTCTCTCTCCATC |
| TRIM63 | CTTCCAGGCTGCAAATCCCTA | ACACTCCGTGACGATCCATGA |
| TTN | CCCCATCGCCCATAAGACAC | CCACGTAGCCCTCTTGCTTC |
| XPO4 | ATTTCAGCGTTACCTTGCACT | CAGCACATTTTGCGAGGATTC |
| ZFPM2 | GGCCTGAAAATCTGAGCTGC | CAGTCGTCTGTCTCAACTCCA |
实施例5、DNA甲基化分析
一、设置三组样品：H9-ESC，H9-NSC以及H9-CM，每组细胞样品共设三个平行。
二、提取各组各样品细胞的DNA，利用基于重亚硫酸盐挂锁探针（bisulfitepadlock probes）的DNA甲基化测序技术以及甲基化水平计算方法（Diep D,Plongthongkum N,Gore A,Fung HL,Shoemaker R,Zhang K.2012.Library-freemethylation sequencing with bisulfite padlock probes.Nature methods9:270-272.）分析H9-ESC，H9-NSC以及H9-CM的全基因组DNA甲基化水平，部分基因检测结果如图3所示。
图3中，
hESC为H9-ESC；
hNSC为H9-NSC；
hCM为H9-CM；
-10%表示基因的启动子区CpG岛甲基化水平下调10%；
-5%表示基因的启动子区CpG岛甲基化水平下调5%；
0表示基因的启动子区CpG岛甲基化无显著变化；
5%表示基因的启动子区CpG岛甲基化水平上调5%；
10%表示基因的启动子区CpG岛甲基化水平上调10%。
图中是以人胚胎干细胞H9-ESC作为甲基化上调和下调的标准。
图3表明，与H9-ESC和H9-NSC相比，H9-CM具有最高的全基因组DNA甲基化水平。
经过分析，与基因启动子区CpG岛在H9-ESC和H9-NSC中的甲基化水平相比，共有985个基因启动子区CpG岛在H9-CM中的甲基化水平同时比该基因启动子区CpG岛在H9-ESC和H9-NSC中的甲基化水平有5%以上的提高，共有195个基因启动子区CpG岛在H9-CM中的甲基化水平同时比该基因启动子区CpG岛在H9-ESC和H9-NSC中的甲基化水平有5%以上的降低。
将DNA甲基化分析与实施例4的转录组分析相结合得到基因的甲基化水平与表达水平的结果。部分基因的结果如图4所示，图4表明，心脏结构与心脏转录因子相关基因的DNA去甲基化与基因表达水平成正相关性。
将DNA甲基化分析与实施例4的转录组分析相结合得出：与H9-ESC和H9-NSC相比，在H9-CM中，鉴别出基因的表达水平提高到2倍以上且启动子区CpG岛甲基化水平降低5%以上的29种基因。这些基因可以作为人类心肌细胞的分子标记物，如表2所示。
表2 29种基因的DNA甲基化水平和表达水平
实施例6、生物信息分析
对表达差异最显著的50个基因进行基因-疾病网络分析，发现有27种基因至少与已知的一种心血管疾病有关。其中包括上述鉴别出的29种人类心肌细胞分子标记物中的6种，它们分别是NPPA，MYL4，MYOZ2，ANKRD1，TNNI1，MYH6。
实施例7、表达差异显著基因的生物信息分析
对实施例4中表达水平存在显著差异的基因进行进一步的生物信息分析，分析包括基因聚类分析（Gene Ontology，GO），功能相关性网络分析以及基因-疾病网络分析等。
一、基因聚类分析
使用Cytoscape软件的BiNGO插件进行聚类分析，分析结果显示显著上调的基因多数被归入了心脏功能相关的GO类别中，该类别包括心肌收缩，心脏发育，肌节结构等。相反，显著下调的基因多数被归入有丝***期，细胞核***和有丝***等类别，提示了心肌细胞中细胞的有丝***受到强烈的抑制。此外，通过分析基因调控网络上下游中受调控基因的显著性可鉴定出hESCs向hCMs分化最小的决定性基因组合，通过计算模型确定了一个双核心的稳定调控网络，如图5所示。这两个核心分别与多潜能性和心肌细胞特性相关。人为改变双核心中的基因表达水平能够引发调控的链式反应，使得hESCs向hCMs分化。对双核心中部分基因有目的的调控同样可能实现其他细胞类型向hCMs的转分化。
二、功能相关性网络分析
为揭示实施例4发现的695个hCMs特异基因的功能相关性，利用Cytoscape软件的GeneMANIA插件产生了基于相关性的网络，包括共表达，共定位，相互作用等。此外，将上述GO聚类分析中被归入心肌收缩，心脏发育，心肌转录调控等类别的基因群分别产生次级网络，如图6所示。
图6A为心肌收缩相关基因网络。
图6B为心肌转录调控网络。
图6C为心脏发育相关基因网络。
图6所示的网络为心肌基因新功能、新相关性的预测等提供了支持。
三、基因-疾病网络分析
对hCMs特异基因中表达差异最显著的50个基因利用Cytoscape软件的DisGeNET插件进行基因-疾病网络分析。其中，27个基因至少与已知的一种心血管疾病有关。此外，有5种基因（NPPB，TNNT2，NPPA，RYR2和PLN）与超过10种不同种类的心血管疾病有联系。超过140种疾病相关的基因突变被证明与这些表达差异最显著的hCMs特异基因有关，部分结果如图7所示。基因-疾病网络的分析结果进一步强调了这些hCMs特异基因对维持正常心脏发育的重要作用，为揭示心脏病机制乃至治疗心脏病提供了参考和依据。
实施例5得到的29个基因在聚类分析中被归入肌肉收缩，肌肉结构组成，肌节结构等类别，为心脏结构相关的基因。可见，与心脏结构相关的基因主要受DNA甲基化调控。而其余未在表达水平上产生显著改变的去甲基化基因可能在其它水平上接受调控。此外，多数与心脏结构相关的基因在hESCs和hNSCs中表现出CpG岛的高甲基化，提示了在非心肌细胞的细胞谱系中，这些基因的启动子区DNA甲基化是最主要的抑制信号。
此外，存在一些心肌细胞特异的转录因子（如NKX2.5，GATA6，GATA4，MYOCD，HAND2，TBX5，TBX18等）在hESCs，hNSCs及hCMs中均表现类似的低甲基化水平，但在hCMs中表达水平远高于hESCs和hNSCs。先前的研究也发现了这些转录因子在hESCs向hCMs的分化过程中抑制性的组蛋白修饰H3K27me3水平发生了降低。提示了对这些基因，组蛋白修饰才是最主要的表观遗传调控因素。
Claims (10)
1.一组用于鉴定或辅助鉴定人类心肌细胞的标记物，由如下29种基因组成：POPDC2、ALPK2、TRIM55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX、NRK、ABLIM1、SYNPO2L、ANKRD1、TNNI1、MYH6、ABRA、TPM1、C15orf52、MYOM1、MASP1、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2；
所述29种基因满足如下条件：与人类胚胎多能干细胞和/或人类神经干细胞相比，在人类心肌细胞中该29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平均显著降低、且在人类心肌细胞中该29种基因的mRNA表达量均显著提高。
2.根据权利要求1所述的标记物，其特征在于：所述该29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平均显著降低是指在人类心肌细胞中每种基因的启动子区CpG岛甲基化的量均比人类胚胎多能干细胞和/或人类神经干细胞中相同基因的启动子区CpG岛甲基化的量降低5%以上；
所述该29种基因的mRNA表达量均显著提高是指在人类心肌细胞中每种基因的mRNA表达量均是人类胚胎多能干细胞和/或人类神经干细胞中相同基因mRNA表达量的2倍以上。
3.权利要求1或2所述标记物在鉴定人心肌细胞中的应用，所述应用为非疾病治疗或诊断方法；
或，权利要求1或2所述标记物在制备、开发或设计鉴定人心肌细胞的产品中的应用。
4.权利要求1或2所述标记物在从人心肌细胞、人胚胎多能干细胞和人神经干细胞中鉴定出人心肌细胞中的应用；
或，权利要求1或2所述标记物在从人心肌细胞和人胚胎多能干细胞中鉴定出人心肌细胞中的应用。
5.权利要求1或2所述标记物在制备、开发或设计具有如下功能的产品中的应用：从人心肌细胞、人胚胎多能干细胞和人神经干细胞中鉴定出人心肌细胞；
或，权利要求1或2所述标记物在制备、开发或设计具有如下功能的产品中的应用：从人心肌细胞和人胚胎多能干细胞中鉴定出人心肌细胞。
6.根据权利要求3-5任一所述的应用，其特征在于：所述人心肌细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的；所述人神经干细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的。
7.检测29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平的物质和检测29种基因的mRNA表达量的物质在制备鉴定人类心肌细胞的试剂盒中的应用；
所述29种基因为POPDC2、ALPK2、TRIM55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX、NRK、ABLIM1、SYNPO2L、ANKRD1、TNNI1、MYH6、ABRA、TPM1、C15orf52、MYOM1、MASP1、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2。
8.检测29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平的物质和检测29种基因的mRNA表达量的物质在制备具有如下功能的试剂盒中的应用：从人心肌细胞、人胚胎多能干细胞和人神经干细胞中鉴定出人心肌细胞；
所述29种基因为POPDC2、ALPK2、TRIM55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX、NRK、ABLIM1、SYNPO2L、ANKRD1、TNNI1、MYH6、ABRA、TPM1、C15orf52、MYOM1、MASP1、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2。
9.检测29种基因的启动子区CpG岛甲基化水平的物质和检测29种基因的mRNA表达量的物质在制备具有如下功能的试剂盒中的应用：从人心肌细胞和人胚胎多能干细胞中鉴定出人心肌细胞；
所述29种基因为POPDC2、ALPK2、TRIM55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX、NRK、ABLIM1、SYNPO2L、ANKRD1、TNNI1、MYH6、ABRA、TPM1、C15orf52、MYOM1、MASP1、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2。
10.根据权利要求7-9任一所述的应用，其特征在于：所述人心肌细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的；所述人神经干细胞是由所述人胚胎多能干细胞分化而来的。
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