CN103450163B - 吲唑类化合物、其制备方法及其药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明首次公开了一系列吲唑类化合物或其生理上可接受的衍生物、其制备方法及其药物用途。所述吲唑类化合物或其生理上可接受的衍生物分别具有抑制Rho激酶活性的作用；具有舒张血管、保护血管功能的作用；具有保护心肌细胞抗缺氧再灌注损伤作用；具有促进细胞葡萄糖消耗的作用；具有保护血管内皮细胞对抗氧化损伤的作用，是一类在制备防治高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死、心力衰竭及糖尿病并发症等心脑血管病、糖尿病等药物方面具有重要用途的新化合物。

Description

吲唑类化合物、其制备方法及其药物用途

技术领域

本发明涉及吲唑类化合物或其生理上可接受的衍生物、其制备方法及其药物用途。具体涉及新化合物、新的药物作用及其在制备预防、缓解和/或治疗高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死、心力衰竭及糖尿病并发症等心脑血管病、糖尿病或症状的药物和保健品中的应用，属于创新药物研究技术领域。

技术背景

众所周知，心脑血管性疾病是威胁人类健康的头号杀手，其发病群体在逐步年轻化，发病率和死亡率也在不断上升。这些疾病的主要病因是中央或外周血管结构和功能的改变，如血管张力的异常增加。舒张血管活性物质可主要用于高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死、心力衰竭及糖尿病血管病变等与血管张力异常增高诱发的血管性疾病、糖尿病及其并发症的治疗。

小分子GTP结合蛋白是一种在细胞功能调节过程中起关键作用的单体G蛋白分子。Rho是一种小分子G蛋白，Rho激酶是最早发现的Rho的效应物。在分子水平，Rho激酶表达上调促进炎症、氧化应激、血栓形成和纤维化的各种因子，下调内皮型一氧化氮合酶。在细胞水平，Rho激酶介导血管平滑肌细胞收缩，促进增殖和迁移，促进炎症细胞移动。Rho激酶通过与血管紧张素II、内皮素-1等血管活性物质相互作用，直接参与许多心脑血管疾病的发生发展，如高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死、心力衰竭及糖尿病及其并发症等。

应用Rho激酶抑制剂，对高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死、心力衰竭及糖尿病血管病变等多种心脑血管疾病、糖尿病及其并发症的治疗具有重要意义，对于目前严重危害人类健康的心脑血管疾病、糖尿病及其并发症的预防和治疗产生积极的作用。

本发明的吲唑类化合物通式I及其衍生物为新化合物，没有在预防和治疗心脑血管性疾病、糖尿病及其并发症的应用相关报道。

发明内容

本发明的一个方面，涉及如式通式Ⅰ所示的吲唑类化合物(中英文名称，化合物通式I)及其生理上可接受的衍生物，均属于本发明的化合物保护范围。

本发明要解决的另一技术问题是提供这类化合物的制备方法。

本发明要解决的又一技术问题是提供含有这类化合物的药物组合物。

本发明要解决的再一技术问题是提供这类化合物在制备心脑血管性疾病、糖尿病及其并发症中的应用。

为解决本发明的技术问题，采用如下技术方案：

1、通式(I)化合物

其中，

R1，R2，R3独立的选自氢，卤素，卤代C1-6烷基，C1-6烷基，C1-6烷氧基；

R4可选自羰基氧、2个氢原子；

R5可选自氢，氰基，酰胺；

n=0,1。

优选的

R1，R2,R3独立的选自氢，卤素，三卤代C1-4烷基，C1-4烷基，C1-4烷氧基；

R4可选自羰基氧，2个氢原子；

R5可选自氢，氰基，酰胺；

n=0,1。

更优选的化合物，包括但不限定于

在本发明中，术语“卤素"是指氟、氯、溴、碘。

根据本发明，本发明式(I)化合物可通过如下反应路线I-II制备：

R4为氢时，采用路线I：

i加成;ii苄基保护；iii还原;iv氢化;v酰胺化

R4为羰基痒时，采用路线II：

i加成;v酰胺化

本发明的第三方面，涉及一种用于预防、缓解和/或治疗血管张力异常增高引发的疾病或症状的药物组合物，其含有预防和/或治疗有效量的上述的吲唑类化合物，以及任选的药学可接受的载体和/或辅料。

在本发明中，根据施用途径，所述吲唑类化合物的药物组合物可呈选自如下剂型：溶液、悬液、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放或持续释放制剂。

本发明的吲唑类化合物药物组合物可以用已知的方法配制，使用几种途径对受试者施用，包括但不限于肠胃外、经口、局部、皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、静脉、鼻内途径。

本发明的吲唑类化合物药物组合物任选的可以通过任何常规方法用一种或多种药学可接受的载体和/或赋形剂来配制。因此，吲唑类化合物和它药学可接受的衍生物可特别配制为例如吸入或吹入(通过口或鼻)或经口、含化、肠胃外或直肠给药。

吲唑类化合物药物组合物也可以采用溶液、悬液、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放或持续释放制剂。这些制剂将含有治疗有效量的吲唑类化合物，优选为纯化形式，以及适量的载体，以提供对患者适当给药的形式。

本发明的第四个方面，涉及吲唑类化合物通式I在制备预防、缓解和/或治疗心脑血管疾病引发的症状的药物中的应用，只要这些吲唑类化合物及其衍生物应用于心脑血管性疾病和糖尿病及其并发症，均属于本发明的化合物保护范围。

所述的心脑血管疾病是由各种原因引起的血管性疾病。尤其是由血管张力异常增高诱发的血管性疾病，包括高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死、心力衰竭及糖尿病及其并发症。

在本发明中，所述预防、缓解和/或治疗血管性疾病或血管性疾病引发的疾病或症状选自抑制Rho激酶的活性，舒张血管、保护血管功能的作用，保护心肌细胞缺氧再灌注损伤，促进细胞葡萄糖消耗，保护血管内皮细胞氧化损伤的药物作用。

本发明是通过如下技术方案来实现：通过人工合成制备获得一系列吲唑类化合物及其衍生物；利用Rho激酶蛋白活性评价***，评价吲唑类、邻苯二甲酰亚胺类化合物对Rho激酶的抑制活性；通过体外血管环张力测定***，进一步观察吲唑类化合物对去甲肾上腺素或氯化钾引起血管收缩的作用，判定吲唑类化合物对大鼠离体血管的舒张作用；利用原代培养乳鼠心肌细胞，评价吲唑类化合物对心肌细胞缺氧再灌注损伤的保护作用；以体外培养肝细胞为模型评价吲唑类化合物对细胞葡萄糖消耗的促进作用；以体外培养血管内皮细胞过氧化氢损伤模型评价吲唑类化合物保护血管内皮细胞氧化损伤的作用，综合评价判定吲唑类化合物对心脑血管性疾病和糖尿病及其并发症的预防和治疗作用。

本发明的吲唑类化合物通式I在制成任何一种剂型时，均具有预防、缓解和/或治疗心脑血管性疾病或糖尿病及其并发症的药物作用。任何药剂，如果其组分中含有吲唑类化合物通式I或者仅以吲唑类化合物通式I单独成分制备成药，在其包装或说明书等标识上或者其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗心脑血管性疾病和糖尿病及其并发症或血管性疾病引发的疾病或症状的作用，也属于本发明的保护范围之内。

在本发明中，所述纯化形式的吲唑类化合物是指基本上纯的，尤其是纯度大于80%，优选的大于85%，特别优选的大于90%，甚至更优选的大于95%的结构吲唑类化合物。所述纯化形式的结构吲唑类化合物纯度范围可以是例如90-96%。

有益技术效果：

吲唑类化合物通式I为单体新化合物，具有毒性较低、制备工艺简单等优点；

具有很好的应用与开发前景，是一种理想的预防和治疗心脑血管疾病和糖尿病及其并发症的新化合物，可应用于药物及保健品的制备。

吲唑类化合物具有抑制Rho激酶活性的作用，具有舒张血管、保护血管功能的作用，具有保护心肌细胞缺氧再灌注损伤，具有促进细胞葡萄糖吸收的药物作用，具有保护血管内皮细胞氧化损伤的作用，是一类防治高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死、心力衰竭及糖尿病及其并发症等心脑血管病、糖尿病方面极有药用价值的新化合物，具有很好的应用与开发前景。

具体实施方式

下面结合本发明，进一步说明吲唑类化合物的制备过程及其在体内降低血压的药物作用及在预防和治疗高血压等血管张力异常增高诱发的疾病的应用。下述实施例更详细地举例说明本发明，并不是对本发明的任何限制。

制备实施例

实施例1

步骤A：圆底瓶中加入对氟苯胺(1.92mL,20mmol),衣康酸(3.12g,24mmol)，水20mL，加热回流反应，6小时候，TLC显示原料基本消失，停止反应，减压除去大部分水，后用1M的氢氧化钠水溶液调至碱性，过滤除去不溶物，再用1N的盐酸调至酸性，析出固体，抽滤，用水洗3次，烘干后得到白色固体4.014g，收率90%。

¹H NMR(300M,CDCl₃，δppm)12.785(s,1H,-COOH),7.69-7.64(m,2H,Ar-H),7.24-7.18(m,2H,Ar-H),4.01(m,2H,-CH2-),3.34(m,1H,-CH-),2.72(m,2H,-CH2-).

步骤B：圆底瓶中加入化合物1(526mg，2.36mmol)，15mL二氯甲烷，5-氨基吲唑(266mg，2mmol)，EDCI(575mg，3mmol)室温反应，反应3小时候，TLC显示反应完全，减压浓缩除去大部分二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解，加入0.5M的氢氧化钠水溶液搅拌5分钟后，分液，有机相用水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析,得到化合物472mg，收率70%。

¹H NMR(300M,CDCl₃，δppm)12.97(d,1H，-NH-),10.17(s,1H,-NH-),8.12(s,1H,Ar-H),8.09(s,1H,-CH=N),7.72-7.67(m,2H,Ar-H),7.05-7.42(m,2H,Ar-H),7.21(m,2H,Ar-H),4.07(m,2H,-CH2-),3.46(m,1H,-CH-),2.84(m,2H,-CH2-).

实施例2：

圆底瓶中加入1-(3-三氟甲基-苯基)-5-氧-吡咯-3-羧酸(644mg，2.36mmol)，15mL二氯甲烷，5-氨基吲唑(266mg，2mmol)，EDCI(575mg，3mmol)室温反应，反应3小时候，TLC显示反应完全，减压浓缩除去大部分二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解，加入0.5M的氢氧化钠水溶液搅拌5分钟后，分液，有机相用水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析,得到化合物504mg，收率65%。

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)12.97(s,1H);10.21(s,1H);8.21(s,1H);8.13(s,1H);8.01(s,1H);7.85(d,1H,J=8.4Hz);7.62(t,1H,J=7.8Hz);7.46(m,3H);4.09(m,2H);3.46(m,1H);2.86(m,2H).

实施例3

圆底瓶中加入1-(3-三氟甲基-苯基)-5-氧-吡咯-3-羧酸(644mg，2.36mmol)，15mL二氯甲烷，5-氨基吲唑-3-羰酰氨(352mg，2mmol)，EDCI(575mg，3mmol)室温反应，反应3小时候，TLC显示反应完全，减压浓缩除去大部分二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解，加入0.5M的氢氧化钠水溶液搅拌5分钟后，分液，有机相用水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析,得到化合物586mg，收率68%。

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)13.47(s,1H);10.28(s,1H);8.46(s,1H);8.21(s,1H);7.86(d,1H,J=8.4Hz);7.65-7.47(m,5H);7.3(s,1H);4.08(m,2H);3.49(m,1H);2.85(m,2H).

实施例4

圆底瓶中加入1-(4-氟-苯基)-5-氧-吡咯-3-羧酸(526mg，2.36mmol)，15mL二氯甲烷，3-氰基-5-氨基吲唑(316mg，2mmol)，EDCI(575mg，3mmol)室温反应，反应3小时候，TLC显示反应完全，减压浓缩除去大部分二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解，加入0.5M的氢氧化钠水溶液搅拌5分钟后，分液，有机相用水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析,得到化合物522mg，收率72%。

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)10.32(s,1H);8.47(s,1H);7.7(m,2H);7.62(s,2H);7.22(t,2H,J=8.4Hz);4.07(m,2H);3.48(m,1H);2.78(m,2H).

实施例5

圆底瓶中加入1-(4-甲基-苯基)-5-氧-吡咯-3-羧酸(516mg，2.36mmol)，15mL二氯甲烷，3-氰基-5-氨基吲唑(316mg，2mmol)，EDCI(575mg，3mmol)室温反应，反应3小时候，TLC显示反应完全，减压浓缩除去大部分二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解，加入0.5M的氢氧化钠水溶液搅拌5分钟后，分液，有机相用水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析,得到化合物502mg，收率70%。

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)10.31(s,1H);8.47(s,1H);7.57(m,5H);7.18(d,2H,J=8.4Hz);4.0(m,2H);3.5(m,1H);2.78(m,2H).

实施例6

圆底瓶中加入1-(3-氯-苯基)-5-氧-吡咯-3-羧酸(564mg，2.36mmol)，15mL二氯甲烷，3-氰基-5-氨基吲唑(316mg，2mmol)，EDCI(575mg，3mmol)室温反应，反应3小时候，TLC显示反应完全，减压浓缩除去大部分二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解，加入0.5M的氢氧化钠水溶液搅拌5分钟后，分液，有机相用水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析,得到化合物531mg，收率70%。

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)10.37(s,1H);7.88(s,1H);7.82(s,1H);7.56(d,1H,J=8.1Hz);7.37(m,3H);7.2(d,1H,J=7.8Hz);7.12(d,1H,J=8.1Hz);4.06(m,2H);3.44(m,1H);2.8(m,2H).

实施例7

圆底瓶中加入1-(4-甲基-苄基)-5-氧-吡咯-3-羧酸(550mg，2.36mmol)，15mL二氯甲烷，5-氨基吲唑(266mg，2mmol)，EDCI(575mg，3mmol)室温反应，反应3小时候，TLC显示反应完全，减压浓缩除去大部分二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解，加入0.5M的氢氧化钠水溶液搅拌5分钟后，分液，有机相用水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析,得到化合物542mg，收率78%。

300M¹H-NMR(δppm,CD3OD)8.5(d,2H,J=11.7Hz);7.94(m,2H);7.69(s,3H);4.95(s,2H);4.06(m,2H);3.82(m,1H);3.20(m,2H);2.80(s,3H).

实施例8

圆底瓶中加入1-(4-甲氧基-苄基)-5-氧-吡咯-3-羧酸(587mg，2.36mmol)，15mL二氯甲烷，5-氨基吲唑(266mg，2mmol)，EDCI(575mg，3mmol)室温反应，反应3小时候，TLC显示反应完全，减压浓缩除去大部分二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解，加入0.5M的氢氧化钠水溶液搅拌5分钟后，分液，有机相用水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析,得到化合物553mg，收率76%。

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)12.96(s,1H);10.03(s,1H);8.07(s,1H);7.99(s,1H);7.41(d,1H,J=9Hz);7.37(d,1H,J=10.8Hz);7.17(d,2H,J=8.7Hz);6.9(d,2H,J=8.4Hz);4.32(s,2H);3.72(s,3H);3.47(m,1H);3.3(m,2H);2.58(d,2H).

实施例9

圆底瓶中加入1-(4-氟-苄基)-5-氧-吡咯-3-羧酸(559mg，2.36mmol)，15mL二氯甲烷，5-氨基吲唑(266mg，2mmol)，EDCI(575mg，3mmol)室温反应，反应3小时候，TLC显示反应完全，减压浓缩除去大部分二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解，加入0.5M的氢氧化钠水溶液搅拌5分钟后，分液，有机相用水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析,得到化合物549mg，收率78%。

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)12.96(s,1H);10.04(s,1H);8.08(s,1H);7.99(s,1H);7.47-7.14(m,6H);4.38(s,2H);3.40(m,1H);3.30(m,2H);2.60(d,2H).

实施例10

圆底瓶中加入1-苄基-5-氧-吡咯-3-羧酸(516mg，2.36mmol)，15mL二氯甲烷，5-氨基吲唑(266mg，2mmol)，EDCI(575mg，3mmol)室温反应，反应3小时候，TLC显示反应完全，减压浓缩除去大部分二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解，加入0.5M的氢氧化钠水溶液搅拌5分钟后，分液，有机相用水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析,得到化合物507mg，收率76%。

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)12.95(s,1H);10.04(s,1H);8.07(s,1H);7.99(s,1H);7.47-7.23(m,6H);4.39(s,2H);3.50(m,1H);3.37(m,2H);2.60(d,2H).

实施例11

步骤C：圆底瓶中加入化合物1(1.784g8mmol)，加入DMF20mL溶解后，加入DBU(1.8mL,12mmol),溴苄(1.2mL,9.6mmol),室温反应3小时候，TLC显示反应完全，加入***，水，搅拌5分钟后分液，有机相用水洗2次，饱和氯化钠水溶液洗1次，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=4∶1)，得到白色固体2.26g，收率90%。

¹H NMR(300M,CDCl₃，δppm)7.52-7.51(m,2H,Ar-H),7.37(s,5H,Ar-H),7.09-7.03(m,2H,Ar-H)，5.20(s,1H,-OCH2Ph),4.07(m,2H,-CH2-),3.40(m,1H,-CH-),2.92(m,2H,-CH2-).

步骤D：圆底瓶中加入化合物2(313mg，1mmol)，加四氢呋喃5mL溶解后，冰浴下滴加硼烷二甲硫醚溶液(0.2mL)加完后室温反应，过夜后TLC显示反应完全，缓慢滴加饱和氯化铵水溶液，搅拌10分钟后，加入乙酸乙酯和水，分液，水相用乙酸乙酯提取2次，合并有机相，用饱和氯化钠使溶液洗1次，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=6∶1)，得到无色油状物238mg，收率79.5%。

¹H NMR(300M,CDCl₃，δppm)7.35-7.25(d,5H,Ar-H),6.97(m,2H,Ar-H),6.50-6.49(m,2H,Ar-H)，5.16(s,1H,-OCH2Ph),3.53(d 2H,-CH2-),3.93-3.24(m,3H,-CH-,-CH2-),2.30(m,2H,-CH2-).

步骤E：圆底瓶中加入化合物3(200mg,0.73mmol)，二氯甲烷/甲醇(4∶1),加入钯碳(25mg)，常压氢化反应，3小时后TLC显示反应完全。过滤除去钯碳，蒸干后得到150mg淡粉色固体。收率98%。

¹H NMR(300M,CDCl₃，δppm)12.47(s,1H,-COOH),7.03-6.97(m,2H,Ar-H),6.54-6.50(m,2H,Ar-H)，3.40(m,2H,-CH2-),3.24-3.12(m,3H,-CH-,-CH2-),2.15(m,2H,-CH2-).

步骤F：圆底瓶中加入化合物4(209mg,1mmol)，5-氨基吲唑(160mg,1.2mmol),加入DMF10mL溶解后，加入EDCI(230mg，1.2mmol)，DMAP10mg，80℃反应，3小时候，TLC显示反应完全，温度降至室温后，加入乙酸乙酯，1N的盐酸，搅拌5分钟，分液，水相用乙酸乙酯提取2次，合并有机相后，依次用水，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=1∶1)，得到淡褐色固体254mg，收率78%

¹H NMR(300M,CDCl₃，δppm)12.97(s,1H，-NH-),10.08(s,1H,-NH-),8.14(s,1H,Ar-H),8.00(s,1H,-CH=N),7.47-7.45(m,2H,Ar-H),7.04-6.98(m,2H,Ar-H),6.54(m,2H,Ar-H),3.45(m,2H,-CH-),3.30(m,4H,-CH-,-CH2-),2.24(m,2H,-CH2-).

实施例12

圆底瓶中加入1-(3，5-二氟-苯基)-吡咯-3-羧酸(227mg,1mmol)，5-氨基吲唑(160mg,1.2mmol),加入DMF10mL溶解后，加入EDCI(230mg，1.2mmol)，DMAP10mg，80℃反应，3小时候，TLC显示反应完全，温度降至室温后，加入乙酸乙酯，1N的盐酸，搅拌5分钟，分液，水相用乙酸乙酯提取2次，合并有机相后，依次用水，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析，得到固体266mg，收率78%

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)12.97(s,1H);10.10(s,1H);8.14(s,1H);8.01(s,1H);7.47(m,2H);6.28(m,3H);3.54(m,1H);3.42(m,2H);3.29(m,2H);2.28(m,2H).

实施例13

圆底瓶中加入1-(3，4-二氟-苯基)-吡咯-3-羧酸(227mg,1mmol)，5-氨基吲唑(160mg,1.2mmol),加入DMF10mL溶解后，加入EDCI(230mg，1.2mmol)，DMAP10mg，80℃反应，3小时候，TLC显示反应完全，温度降至室温后，加入乙酸乙酯，1N的盐酸，搅拌5分钟，分液，水相用乙酸乙酯提取2次，合并有机相后，依次用水，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析，得到固体266mg，收率78%

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)12.99(s,1H);10.12(s,1H);8.15(s,1H);8.01(s,1H);7.45(m,2H);7.23(m,1H);6.56(m,1H);6.33(d,1H);3.52(m,1H);3.32(m,4H);2.26(m,2H).

实施例14

圆底瓶中加入1-(4-甲基-苄基)-吡咯-3-羧酸(219mg,1mmol)，5-氨基吲唑(160mg,1.2mmol),加入DMF10mL溶解后，加入EDCI(230mg，1.2mmol)，DMAP10mg，80℃反应，3小时候，TLC显示反应完全，温度降至室温后，加入乙酸乙酯，1N的盐酸，搅拌5分钟，分液，水相用乙酸乙酯提取2次，合并有机相后，依次用水，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析，得到固体267mg，收率80%

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)12.93(s,1H);9.82(s,1H);8.08(s,1H);7.98(s,1H);7.40(m,2H);7.15(m,2H);3.53(s,2H);3.02(m,1H);2.85(m,1H);2.66(m,1H);2.35(m,2H);2.04(s,3H);2.0(m,2H).

实施例15

圆底瓶中加入1-(4-甲氧基-苄基)-吡咯-3-羧酸(235mg,1mmol)，5-氨基吲唑(160mg,1.2mmol),加入DMF10mL溶解后，加入EDCI(230mg，1.2mmol)，DMAP10mg，80℃反应，3小时候，TLC显示反应完全，温度降至室温后，加入乙酸乙酯，1N的盐酸，搅拌5分钟，分液，水相用乙酸乙酯提取2次，合并有机相后，依次用水，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析，得到固体287mg，收率82%

300M¹H-NMR(δppm,DMSO)12.95(s,1H);9.83(s,1H);8.10(s,1H);7.99(s,1H);7.42(m,2H);7.23(d,2H,J=8.7Hz);6.88(d,2H,J=8.7Hz);3.73(s,3H);3.05(m,1H);2.86(m,1H);2.67(m,1H);2.50(s,2H);2.43(m,2H);1.99(m,2H).

药理实验

实验例1：吲唑类化合物对Rho激酶活性的抑制作用评价。

采用酶联免疫吸附方法(ELISA)对Rho激酶活性进行检测。使用商品化ELISA试剂盒(Cyclex Rho-kinase Assay kit)，其中包含已用Rho激酶底物MBS(MYPT1)包被的96孔板，在ATP存在下Rho激酶可与底物反应，使底物696位苏氨酸残基磷酸化。根据抗原抗体特异性结合反应原理，激酶反应完成后，应用HRP标记的苏氨酸磷酸化特异性单克隆抗体作为探针，与磷酸化的苏氨酸残基特异性结合，最后用四甲基联苯胺(Tetrabenzidine,TMB)与HRP反应显色，测定其吸光度，以反应Rho激酶的活性。

酶储存液浓度为100ng/μl，用激酶缓冲液稀释成工作浓度为0.2ng/μl。激酶反应缓冲液将20X ATP用激酶缓冲液稀释成1X。10μl酶+10μl化合物+80μl激酶反应缓冲液加入到酶标板中，37℃反应30分钟。倒出液体，用洗脱缓冲液洗板5次。加入HRP标记抗体，室温反应1小时。倒出液体，用洗脱缓冲液洗板5次。加入TMB显色约5分钟，当显色明显后加入反应停止液终止显色，在450nm处测定吸收值。根据OD值高低判断酶活性强弱，判断吲唑类化合物对Rho激酶的抑制活性，抑制率%=(OD标准-OD样品)/OD标准*100%，并计算对Rho激酶的半数抑制浓度(IC₅₀)值。

结果显示通式I吲唑类化合物能剂量依赖性的抑制Rho激酶的活性，部分吲唑类化合物的IC₅₀分别是34.46、23.99和48.21μg/ml，判定吲唑类化合物在预防和治疗Rho激酶活性异常增高诱发的心脑血管性疾病的药物作用及应用。

表1.部分吲唑类化合物对Rho激酶活性的抑制率。

实验例2：吲唑类化合物对去甲肾上腺素预刺激血管环收缩的作用。

实验动物选用雄性SD大鼠6只，体重250～300g。大鼠断头处死后，迅速取出胸主动脉，剪成2-3mm长的血管环，将血管环置于盛有K-H液10mL(37℃恒温，并持续通入95%氧气和5%二氧化碳的混合气体)的浴槽中，张力变化被传输并记录在BL-420S生物机能实验***中。血管环在1.2g张力稳定60min，期间每20min换K-H液1次。以60mM KCl刺激血管环，使血管环收缩，达到最大幅度后冲洗2次，使血管环恢复到刺激前的状态，共2次。加入1μM去甲肾上腺素，达到最大收缩幅度后给予10μM的乙酰胆碱，并测定其舒张幅度。若舒张幅度大于80%表示内皮完整，表明操作过程中对血管环内皮的损失极小，内皮完整性良好，为有内皮组；若不舒张或舒张幅度小于30%表示内皮损失大，内皮功能不完整，为无内皮组。检测内皮功能后，冲洗至刺激前的状态，再稳定30min，进一步检测药物对血管环的影响。

去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)是一种血管收缩药。本实施例通过在反应体系中加入1μM去甲肾上腺素，使血管呈收缩状态，1，2，5，10，25，50μg/ml累积浓度的吲唑类化合物对去甲肾上腺素所引起的无内皮和有内皮血管环的收缩均有明显的舒张作用，其舒张作用随浓度的增高而增强，并呈量效关系，部分吲唑类化合物的半数有效浓度(EC₅₀)表2所示，判定吲唑类化合物对去甲肾上腺素所引起的血管收缩的舒张作用及在预防和治疗血管张力异常增高诱发的心脑性疾病的药物作用及应用。

表2.部分吲唑类化合物对去甲肾上腺素预收缩血管的舒张作用。

实验例3：吲唑类化合物对高浓度氯化钾预刺激血管环收缩的作用。

张力测定用血管环制备方法同实施例3。

高浓度氯化钾能够引起血管收缩。本实施例通过在反应体系中加入60mM KCl，使血管呈收缩状态，1，2，5，10，25，50μg/ml累积浓度的吲唑类化合物对KCl所引起的无内皮和有内皮血管环的收缩均有明显的抑制作用，其抑制作用随浓度的增高而增强，并呈量效关系。部分吲唑类化合物的半数有效浓度(EC₅₀)表3所示，判定吲唑类化合物对高浓度氯化钾所引起的血管收缩的舒张作用及预防和治疗血管张力异常增高诱发的心脑性疾病的药物作用及应用。

表3.部分吲唑类化合物对高浓度氯化钾预收缩血管的舒张作用。

实验例4：吲唑类化合物对原代培养乳鼠心肌细胞缺氧再灌注损伤的保护作用。

心肌缺血是冠脉狭窄、血管硬化所引起的常见疾病，它可引发心绞痛、心衰等严重疾病并易造成猝死。利用体外乳鼠原代心肌细胞培养模拟临床缺血性心脏病的发病机制，减少能量及氧的供给，可产生心肌细胞的缺血样损伤。近年来有研究发现，在变异性心绞痛、短暂性缺血发作、心衰等疾病中，Rho激酶起到了关键作用。因此对本发明中具有Rho激酶抑制作用的吲唑类化合物进行心肌缺氧再灌注损伤的保护作用具有重要意义。

心肌细胞在发生缺氧(再灌)时会产生损伤，随着细胞膜的破裂，胞内乳酸脱氢酶(LDH)释放入培养基，通过检测培养基中LDH含量和MTT法测定细胞活力可知道细胞的损伤程度，判定吲唑类化合物在预防和治疗缺血、缺氧损伤诱发的血管性疾病的药物作用及应用。

乳鼠原代心肌细胞培养在96孔板中，5天后按以下几组开始实验：正常组：常氧，DMEM高糖培养基；模型组：缺氧6h,无糖DMEM培养基；给药组：终浓度10μg/ml，缺氧6h，无糖DMEM培养基。将细胞培养基换成DMEM无糖无血清(事先通氮气以排净氧气)，与此同时加入化合物，放入无氧孵箱6小时。正常组用相同培养基但放置于普通孵箱中作为对照。6小时后分别收集细胞上清。

LDH检测：向1瓶底物混合物中加入11ml检测缓冲液混匀成为CytoTox-One试剂。向黑色384孔板加入25μl细胞上清液，再加入25μl CytoTox-One试剂，室温反应10分钟，加入12.5μl反应终止液，震荡10秒，进行荧光检测：激发波长Ex=560nm，发射波长Em=590nm。乳酸脱氢酶(LDH)释放抑制率%=(模型-样品)/(模型-正常)*100%；MTT细胞保护率%=(样品-模型)/(正常-模型)*100%。

如表4所示，部分吲唑类化合物在10μg/ml浓度时对原代培养心肌细胞缺氧损伤的保护率分别是48.38%、37.59%、49.60%、58.48%、27.89%、35.48%和49.19%，抑制LDH释放率分别是82.37%、68.92%、61.81%、54.24%、67.92%、50.31%和63.42%。

表4.部分吲唑类化合物对原代培养心肌细胞保护率和LDH释放抑制率。

实验例5：吲唑类化合物促进肝细胞葡萄糖消耗的作用。

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由于胰岛素缺乏或者胰岛功能受损，以及肝脏、骨骼肌、脂肪等靶组织对葡萄糖的摄取量减少，而引发的一系列以高血糖为特征的代谢紊乱综合症。研究和开发新型降糖药，促进胰岛细胞功能和靶器官对葡萄糖的吸收利用，成为糖尿病药物研究的重要课题。

肝脏是动物体内物质代谢的中心，是胰岛素作用的靶器官之一，它既是利用葡萄糖又是产生葡萄糖的主要器官。HepG2(human hepatocellular liver carcinoma cellline)细胞来源于肝细胞，系一种表型与肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株，保留了肝细胞的许多生物学特性，可以表达葡萄糖激酶及胰岛素受体、***等，是研究体外降糖作用的常见细胞模型之一。本模型选用HepG2细胞，研究化合物对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响。

培养细胞消化后，按每毫升5×10⁴个的密度接入96孔板中，每孔200μL，24小时后选取生长状态良好的细胞，更换无血清的PRMI-1640培养液同步化12h。随机分组，分别为正常对照组，阳性药胰岛素组，不同浓度的化合物组。换入无血清的含化合物或不含化合物的PRMI-1640培养液，分别于培养24小时后采用葡萄糖氧化酶法测定培养液中葡萄糖含量(GC)。以各组空白孔均值为对照，计算该组各孔培养液中葡萄糖含量的变化值。在葡萄糖消耗试验24小时孵育结束后将待测培养液移出，换人含有0.5mg/mL的MTT无血清培养液孵育4h，吸弃原培养液，每孔加入DMSO 150μL，混匀后置酶标仪上于540nm处测OD值(MTT)，以OD值反映细胞活性和数量的多少；以GC／MTT表示单位细胞的糖消耗量，表5所示吲唑类化合物促进肝细胞葡萄糖消耗的作用，判定吲唑类化合物在预防和治疗糖尿病及其并发症的药物作用及应用。

表5.部分类化合物对HepG2肝细胞葡萄糖消耗的促进作用。

实验例6：吲唑类化合物对血管内皮细胞氧化损伤的保护作用。

血管内皮细胞产生和表达各种调节分子，从而在生理和病理状态下对血管功能的调节起关键作用。血管内皮细胞损伤不仅是动脉粥样硬化的始动因素，而且对冠心病、高血压等疾病的发生和发展起着重要的作用。因此研究对血管内皮细胞损伤的保护是防治心脑血管疾病的新途径。

过氧化氢作为活性氧家族中的一员，可直接作用于膜脂质，形成脂质过氧化物，从而MDA生成增加，质膜通透性增加，外钙内流增多，LDH漏出也增多，同时SOD活性下降；过氧化氢可直接损伤内质网，并可加剧线粒体功能障碍，使氧化磷酸化紊乱，导致内皮细胞损伤甚至激活凋亡调控基因，促发凋亡。

CRL-1730人脐静脉内皮细胞计数，培养于96孔平底培养板。24小时后，细胞先用样品处理4h，然后用H₂O₂处理20h造成细胞氧化损伤模型，用MTT法测定血管内皮细胞线粒体活性，以判定吲唑类化合物对H₂O₂所致血管内皮细胞氧化损伤的保护作用，表6所示部分吲唑类化合物对血管内皮氧化损伤的保护率。

表6部分类化合物对血管内皮氧化损伤的保护作用。

综上所述，吲唑类化合物或其生理上可接受的衍生物分别具有抑制Rho激酶活性的作用；具有舒张血管、保护血管功能的作用；具有保护心肌细胞抗缺氧再灌注损伤作用；具有促进细胞葡萄糖消耗的作用；具有保护血管内皮细胞对抗氧化损伤的作用，是一类在制备防治高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死、心力衰竭及糖尿病并发症等心脑血管病、糖尿病等药物方面具有重要用途的新化合物。

Claims (10)

1.通式(I)化合物或其异构体及其盐类

R₁，R₂，R₃独立的选自氢，卤素，卤代C1-6烷基，C1-6烷基，C1-6烷氧基；

R₄可选自羰基氧、2个氢原子；

R₅可选自氢，氰基，酰胺；

n＝0,1。

2.根据权利要求1的化合物或其异构体及其盐类，其特征在于，

R₁，R₂，R₃独立的选自氢，卤素，三卤代C1-4烷基，C1-4烷基，C1-4烷氧基；

R₄可选自羰基氧，2个氢原子；

R₅可选自氢，氰基，酰胺；

n＝0，1。

3.根据权利要求1-2任一项的化合物或其异构体及其盐类，其特征在于，所述化合物选自

4.权利要求1-3中任一项所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

R₄＝羰基氧时，采用如下路线：

i加成；v酰胺化

1)式(Ⅲ)化合物与衣康酸Michael加成，分子内酰胺化反应得到式(Ⅳ)化合物，R₄＝羰基氧，

2)式(Ⅳ)化合物与5-氨基吲唑发生酰胺化反应得到式(Ⅰ)化合物，R₄＝羰基氧；

R₄＝两个氢原子时，采用如下路线：

i加成；ii苄基保护；iii还原；iv氢化；v酰胺化

1)式(Ⅲ)化合物，与衣康酸Michael加成，分子内酰胺化反应得到式(Ⅳ)化合物，R₄＝羰基氧，

2)式(Ⅳ)化合物与溴苄反应得到式(Ⅴ)化合物，

3)式(Ⅴ)化合物用硼烷还原得到式(Ⅵ)化合物，

4)式(Ⅵ)化合物脱去苄基保护得到式(Ⅶ)化合物，

5)式(Ⅶ)化合物与5-氨基吲唑发生酰胺化反应得到式(Ⅰ)化合物；

其中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅如权利要求1-3中任一项所定义。

5.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1-3中任一项的化 合物及制药领域中可用的载体。

6.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物选自如下的剂型：片剂、胶囊、丸剂、注射剂。

7.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物选自如下的剂型：溶液、悬液、乳剂、粉末、控制释放或持续释放制剂。

8.权利要求1-3中任一项的化合物在制备预防、缓解和/或治疗心脑血管病、糖尿病的产品中的应用。

9.根据权利要求8的应用，其特征在于，所述的心脑血管病选自高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死、心力衰竭及糖尿病并发症。

10.根据权利要求8的应用，其特征在于，所述的产品包括药品、保健品。