CN103443277A - 淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对淀粉样蛋白低聚物具有结合性的核酸适体,该核酸适体具有G-四分体结构、且为选自由下述多核苷酸组成的组中的至少1种:(1)由序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列构成的多核苷酸;(2)由至少含有4组至少2个连续的鸟苷核苷酸、且是序列编号18的任意之一所表示的碱基序列中有1个或2个以上碱基发生缺失、取代或者添加而成的碱基序列所构成的多核苷酸;以及(3)多核苷酸,其是含有所述(1)或(2)的多核苷酸作为结构单元的多聚体。
Description
技术领域
本发明涉及淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体及其应用。
背景技术
α-突触核蛋白(α-Syn)是在帕金森氏病(PD)或路易氏体失智症(DLB)中所观察到的包涵体的主结构蛋白,据认为,其通过聚集而得到细胞毒性、引起疾病。据报告,作为α-Syn聚集中间体的α-突触核蛋白低聚物显示出了比最终形成的淀粉样纤维更高的细胞损伤性,因而暗示出α-突触核蛋白低聚物可能为PD、DLB发症中的毒性主体。
此外,并不限于α-突触核蛋白,阿兹海默氏病、感染性蛋白质病、多聚谷氨酰胺病、亨廷顿舞蹈症等的发病还分别与β淀粉样肽和Tau蛋白、感染性蛋白、多聚谷氨酰胺肽、亨廷顿蛋白等淀粉样蛋白的累积有很大相关。另外,这些淀粉样蛋白也是在体内以可溶化形态持续存在的蛋白质,在受到某些刺激时构型发生变化而形成低聚物,其后变成不溶化形态的淀粉样纤维。
在以这些淀粉样蛋白的沉积等为原因的疾病中,对淀粉样蛋白低聚物的特异性检测在疾病原因的探究查明中是必要的。此外,只要能够把握低聚物在组织内的局部存在,则在预防及诊断中也是有效的。
因此开发出了用于特异性检测低聚物形态的淀粉样蛋白的各种技术。例如,在日本特表2010-531992号公报和日本特表2010-530227中公开了抗淀粉样β肽的抗体。此外,在日本特表2010-502938号公报和日本特表2010-537962号公报中公开了抗淀粉样β蛋白的单克隆抗体。
另一方面,已知有作为与任意分子特异结合的多核苷酸分子的核酸适体。核酸适体可使用市售的核酸合成机化学全合成,与特异抗体相比,成本非常低,并且易于修饰,因而具有可设计结构变化的优点。进一步地,与肽不同,即使在高温发生变性,也会恢复原状,因而稳定性优异。核酸适体形成特定的三维结构,对目标分子发挥出选择性的分子识别功能。作为核酸适体的三维结构,迄今为止据报告其可采取发夹型、假结型、凸环型、G-四分体型之类的各种形态。
作为用于检测α-突触核蛋白的核酸适体,已知具有2个以上发夹型结构的核酸适体M5-15(参照Biotechnol.Lett.,(2010)vol.32,pp.643-648)。据记载,该与α-突触核蛋白结合的核酸适体M5-15不仅可识别低聚体型的突触核蛋白,还可识别单体型的α-突触核蛋白。
发明内容
发明所要解决的课题
如上所述,需要特异性识别淀粉样蛋白低聚物,但尚未得到对于特异性识别淀粉样蛋白低聚物有用的核酸适体。
因而,本发明的目的在于提供能够特异性识别淀粉样蛋白低聚物的核酸适体和使用其的淀粉样蛋白低聚物的检测方法。
解决课题的手段
本发明提供下述方式。
[1]一种对淀粉样蛋白低聚物具有结合性的核酸适体,该核酸适体具有G-四分体结构、且为选自由下述多核苷酸组成的组中的至少1种:
(1)由序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列构成的多核苷酸;
(2)由至少含有4组至少2个连续的鸟苷核苷酸、且是序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列中有1个或2个以上碱基发生缺失、取代或者添加而成的碱基序列所构成的多核苷酸;以及
(3)多核苷酸,其是含有所述(1)或(2)的多核苷酸作为结构单元的多聚体。
[2]如[1]所述的核酸适体,其中,所述(3)的多核苷酸具有所述(1)或(2)的多核苷酸与将各(1)或(2)的多核苷酸间连接的接头序列。
[3]一种淀粉样蛋白低聚物检测试剂盒,其含有[1]或[2]所述的核酸适体。
[4]一种淀粉样蛋白低聚物的检测方法,该方法包括以下步骤:使[1]或[2]所述的核酸适体与待检试样接触;以及对所述待检试样中的淀粉样蛋白低聚物和所述核酸适体的复合物进行检测。
[5]如[4]所述的淀粉样蛋白低聚物检测方法,其中,所述待检试样为选自由髓液、血清、血浆和它们的稀释物组成的组中的至少1种。
[6]一种多核苷酸,其由序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列构成。
[7]一种多聚体多核苷酸,其是含有由序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列构成的多核苷酸作为结构单元的多聚体。
发明的效果
根据本发明,能够提供可特异性识别淀粉样蛋白低聚物的核酸适体和使用该核酸适体的淀粉样蛋白低聚物的检测方法。
附图说明
图1为示出了实施例1中的对各核酸适体相对于α-突触核蛋白单体、低聚物或纤维的结合能力进行比较的核酸适体印迹分析结果的图。
图2为示出了实施例1中的对各核酸适体相对于各种蛋白质的结合能力进行比较的核酸适体印迹分析结果的图。
图3为示出了实施例1中的对各核酸适体相对于β淀粉样肽Aβ1-40的结合能力进行比较的核酸适体印迹分析结果的图。
图4为示出了实施例2中的对各核酸适体相对于α-突触核蛋白单体、低聚物或纤维的结合能力进行比较的核酸适体印迹分析结果的图。
图5为示出了实施例3中的各核酸适体相对于Aβ蛋白的结合能力的图表。
图6为示出了实施例3中的对二聚体型核酸适体相对于β淀粉样肽Aβ1-40的结合能力进行比较的核酸适体印迹分析结果的图。
图7为示出了实施例4中的改良型核酸适体相对于Aβ蛋白的结合能力的图表。
图8为示出了实施例4中的2G16和3G4的PAGE解析结果的图像。
图9为示出了实施例4中的对二聚体型核酸适体相对于β淀粉样肽Aβ1-40的结合能力进行比较的核酸适体印迹分析结果的图。
具体实施方式
本发明的核酸适体为对淀粉样蛋白低聚物具有结合性的核酸适体,其为具有G-四分体结构的多核苷酸,且为选自由下述多核苷酸组成的组中的至少1种:
(1)由序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列构成的多核苷酸;
(2)由至少含有4组至少2个连续的鸟苷核苷酸、且是序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列中有1个或2个以上碱基发生缺失、取代或者添加而成的碱基序列所构成的多核苷酸;以及
(3)具有上述(1)或(2)的多核苷酸的多核苷酸,其是至少二聚体以上的多聚体。
本发明的相对于淀粉样蛋白低聚物具有结合性的核酸适体(下面称为“淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体”)具有特定的碱基序列或与其类似的碱基序列,为具有G-四分体结构的核酸适体,因而根据淀粉样蛋白的构型变化,可特异性识别、结合低聚物。
若进一步进行说明,则如上所述,淀粉样蛋白的构型可变更为单体型、低聚体型和纤维型。本发明中发现,具有G-四分体结构的所述特定的核酸适体相对于低聚体型与单体型的结合能力不同。通过使用这样的G-四分体型核酸适体,可特异性识别出低聚体型的淀粉样蛋白。
所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体的特异性意味着能够对淀粉样蛋白与淀粉样蛋白以外物质进行区分、并且能够对淀粉样蛋白单体与淀粉样蛋白低聚物进行区分的特异性。此外,所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体也可以具有相对于淀粉样蛋白纤维的结合性。
需要说明的是,本说明书中的“核酸适体”表示与特定分子结合的核酸配位体。
本说明书中的“工序”这一用语不仅为独立工序,是在无法与其它工序明确区別的情况下,只要可达成本工序所期望的作用,也包含在本术语中。
此外,本说明书中使用“~”表示的数值范围表示的是分别含有“~”的前后所记载的数值作为最小值和最大值的范围。
此外,在本发明中,在提及组合物中各成分的量的情况下,在组合物中相当于各成分的物质存在有两种以上的情况下,只要不特别声明,就意味着组合物中存在的该两种以上物质的总量。
下面对本发明进行说明。
<淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体>
本发明的淀粉样蛋白结合核酸适体为对淀粉样蛋白低聚物具有结合性的核酸适体,其为具有G-四分体结构的多核苷酸,选自由以下多核苷酸组成的组中的至少1种。
(1)由序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列构成的多核苷酸;以及
(2)由至少含有4组至少2个连续的鸟苷核苷酸、且是序列编号1~18的任意之一所表示的碱基序列中有1个或2个以上碱基发生缺失、取代、或者添加而成的碱基序列所构成的多核苷酸;
(3)具有上述(1)或(2)的多核苷酸的多核苷酸,其是至少二聚体以上的多聚体。
若为这样的序列,则具有G-四分体结构,能够特异性识别淀粉样蛋白低聚物。
T-SO517:GGTGGCTGGAGGGGGCGCGAACG(序列编号1)
T-SO606:GGGTCGGCTGTCCGTGGGTGGGGA(序列编号2)
T-SO554:CGAGGGGCGTCTGGGAGTGGTCGG(序列编号3)
T-SO530:GGTGCGGCGGGACTAGTGGGTGTG(序列编号4)
T-SO552:GCGTGTGGGGCTTGGGCAGCTGGG(序列编号5)
T-SO504:CAGGGGTGGGCAAAGGGCGGTGGTG(序列编号6)
T-SO508:GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG(序列编号7)
T-SO602:GCGGTAGGGTGTGAGCGGAAGGGG(序列编号8)
2G16:CGAGGGGCGTCTGGGGGGGAGGGA(序列编号9)
2G4:CGGGGGGCGTGTGGGAGAGGTCGG(序列编号10)
2G13:TGGGGGGCGTAGGGTCGCGAACGA(序列编号11)
2G9:CGGGGGGCGTAGGGGAGAGGGGCG(序列编号12)
3G4:CGGGGGGCCTGAGGGGGGGAGGGA(序列编号13)
3G21:CGGGGCGCATCTGGGGGGGAGGGA(序列编号14)
3G16:CGGGGGGCTTGTGGCGGGGAGGGA(序列编号15)
3G22:CGAGGGGAGTAGGGGGGAGGGGCG(序列编号16)
3G14:CGGGGGGCGTCTGGGCGCGAGGGA(序列编号17)
3G9:CGGGGGCCGTTGGGGGGGGAGGGA(序列编号18)
G-四分体结构为本领域公知的结构。该结构为在鸟苷核苷酸(G)中富含的DNA或RNA中的分子间和分子内的四链结构。G-四分体结构中,鸟嘌呤核苷碱基与其相邻的鸟嘌呤核苷碱基一起形成2个氢键,4个鸟嘌呤核苷碱基在环状Hogsten H结合配置相连,从而形成该结构。最终G-四分体结构相互堆积,取四分子螺旋结构。
其为具有G-四分体结构的核酸适体这一点可利用公知的测定手段来确认。例如,可使用CD光谱,通过对特定波形进行确认来确认其为具有G-四分体结构的核酸适体。例如,可以将核酸适体溶解在TBS缓冲液(10m MTris-HCl、150mM NaCl、5mMKCl、pH7.4)中,制备试样液,基于在温度20℃、波长200nm~320nm、扫描速度100nm/分钟、积分次数10次的条件下进行光谱测定时的条件进行的CD光谱中,通过240nm附近的最小值和260nm附近的最大值的出现来进行确认。
作为构成核酸适体的核苷酸的种类,只要可根据核苷酸所含有的碱基的种类构成G-四分体结构就没有特别限制,可以举出脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸等。此外,本发明的核酸适体中的核苷酸中也可以包括肽核酸等核酸类似物(疑似核酸)。此外,所述核苷酸也可以含有修饰核苷酸。作为所述核酸适体,从目标物质反应时立体结构上的柔软性的方面出发,优选核糖核苷酸、即RNA。
作为修饰核苷酸,可以举出例如对RNAase具有耐性的修饰核苷酸、用于荧光检测的标记化核苷酸等。作为标记,可以举出能够在该领域中使用的已知标记,可以举出FITC等荧光物质、生物素、抗生物素蛋白等。
所述(2)的核酸适体为由下述碱基序列构成的多核苷酸:该序列具有G-四分体结构,至少含有4组至少2个连续的鸟苷核苷酸、且是序列编号1~18的任意之一所表示的碱基序列中有1个或2个以上的碱基发生缺失、取代、或者添加而成的。只要为这样的多核苷酸,即可与由所述序列编号1~18的任意之一所表示的碱基序列构成的多核苷酸同样地具有G-四分体结构、具有对淀粉样蛋白低聚物的结合性。
所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体的核苷酸长度为20~30,从对淀粉样蛋白的结合能力的方面出发,优选为23~25。
所述(2)的核酸适体至少含有4组至少2个连续的鸟苷核苷酸。此处“至少2个连续的鸟苷核苷酸”是指序列中的鸟苷核苷酸以2个或其以上的数目相连续。此外“至少含有4组”意味着至少2个连续的鸟苷核苷酸在序列中含有4组以上。需要说明的是,例如在4个鸟苷核苷酸连续的情况下,表示2个连续的鸟苷核苷酸以2组相连续。从确实地构成G-四分体结构、确实地识别淀粉样蛋白低聚物的方面考虑,2个连续以上的鸟苷核苷酸在序列中优选含有4组。此外,从更为确实地识别淀粉样蛋白低聚物的方面考虑,进一步优选23~25个核苷酸长度、且序列中的鸟苷核苷酸为14~15位的多核苷酸。
只要可满足所述(2)的核酸适体中的鸟苷核苷酸数目的条件、可与低聚体型淀粉样蛋白特异性地结合,本发明中的淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体也可以为序列编号1~18的任意之一所表示的碱基序列中有1个或2个以上的碱基发生缺失、取代、或者添加而成的。作为所述的2个以上,例如可为2~5个。
只要为这样的淀粉样蛋白结合核酸适体,即可特异性识别低聚体型淀粉样蛋白。
此外,只要可满足所述(2)的核酸适体中的鸟苷核苷酸的数目的条件、可与低聚体型淀粉样蛋白特异性地结合,本发明中的淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体也可以具有与序列编号1~18的任意之一所示碱基序列的互补碱基序列在严格条件下杂交的序列。
此处所谓严格条件是指形成特异性杂交、不形成非特异性杂交的条件。典型的严格条件可以举出例如在钾浓度为约25mM~约50mM以及镁浓度为约1.0mM~约5.0mM下进行杂交的条件。
对于所述核酸适体,可进行基于SELEX(配体指数级***进化技术,systemicevolution of ligands by exponential enrichment)法的试验管内筛选,由无规的多核苷酸文库中根据与目标物质的结合能力进行筛选。
此外,对于所得到的核酸适体,可以以相对于低聚体型淀粉样蛋白的结合能力为指标,进一步对核酸适体的序列进行最佳化,来得到其它核酸适体。作为进行最佳化的方法,可以举出所谓计算机内进化法(In silico maturation)。计算机内进化法由下述操作组成:在体外(in vitro)进行核酸适体的评价和排序的操作、以及序列的重组、改组以及各种变异导入等的基于计算机上(in silico)的进化模拟算法的新颖序列的制作的操作。这两个操作合起来称为第一代,通过反复进行几代的操作,得到具有目的功能的核酸适体序列(例如,参照Nucleic Acids Res.,(2005)vol.33(12),pp.e108;BiochemBiophys Res Commun.,(2006)vol.347(1),pp.226-31;Biosens Bioelectron.,(2010)vol.15;26(4),pp.1386-91)。
此外,对于序列已知的核酸适体,也可利用常规方法进行化学合成。
所得到的核酸适体对淀粉样蛋白低聚物具有结合性这一点可通过印迹分析等常规方法进行确认。
例如,在印迹分析的情况下,按下述方法进行。
将淀粉样蛋白低聚物0.5μg~1μg固定在硝酸纤维素膜上,准备印迹用膜。将作为对象的核酸适体与荧光物质(例如FITC)连接,制备试样核酸适体。
对于上述印迹用膜,添加以50nM~5μM的浓度含有所得到的试样核酸适体的TBS-T溶液(25mM tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.005M KCl、0.05%Tween20),在室温下培养1小时。其后使用充分量的TBS-T对膜进行清洗(2min×2次、10min×1次)。
将清洗后的硝酸纤维素膜与用经TBS-T稀释1000倍的检测用酶(例如,HRP)修饰的所述荧光物质的抗体(例如,抗FITC抗体)一起在室温下培养1小时。其后使用充分量的TBS-T对膜进行清洗(2min×2次、10min×1次、5min×2次)。
接下来添加所述检测用酶的底物,通过检测化学发光来评价试样核酸适体与淀粉样蛋白低聚物的结合。
作为淀粉样蛋白结合核酸适体所能够识别的淀粉样蛋白,可以举出产生了构型变化的淀粉样蛋白,可以举出例如α-突触核蛋白(帕金森氏病相关淀粉样蛋白)、β淀粉样肽(阿尔兹海默型认知症相关淀粉样蛋白)、感染性蛋白质蛋白质(所谓疯牛病相关淀粉样蛋白)、Tau蛋白质(阿尔兹海默型认知症相关淀粉样蛋白)、多聚谷氨酰胺肽(多聚谷氨酰胺病相关淀粉样蛋白)、亨廷顿蛋白(亨廷顿舞蹈症相关淀粉样蛋白)等。
所述淀粉样蛋白结合核酸适体可以为含有上述(1)或(2)的多核苷酸作为结构单元的多聚体(下面称为多聚体核酸适体)。与仅为构成多聚体核酸适体的(1)或(2)的多核苷酸(下面称为结构单元)的核酸适体相比,这样的多聚体核酸适体可提高与淀粉样蛋白低聚物的结合力。
作为这样的多聚体核酸适体,可以举出将所述结构单元2个连接而成的二聚体型、3个连接而成三聚体型、3个连接而成的四聚体型,以及5聚体以上、例如由10~30所述结构单元形成的多聚体。此外,多聚体核酸适体可以为二聚体~四聚体程度。若为二聚体以上,则具有提高与淀粉样蛋白低聚物的结合性的倾向;通过为四聚体程度,具有可得到与所述结构单元数目相应的相对于淀粉样蛋白低聚物结合性提高的效果的倾向。
作为所述多聚体核酸适体,所述结构单元可以串联连接,也可以为树状聚体型。在串联连接的情况下,作为连接的形态,可以举出结构单元同向连接(即(头-尾)(头-尾)型)和反向连接(即(头-尾)(尾-头)型)的形态。在树状聚体型的情况下,作为核部分,可以举出乙二胺、1,6-己二胺等。
在这些多聚体低聚物中的单体单元之间可以含有接头序列。
作为接头序列,可以举出由鸟苷核苷酸以外的核苷酸、胸苷核苷酸或胞嘧啶核苷酸2个以上相连续而形成的序列等。作为接头序列的长度,可以为2~15,从提高结合能力的方面考虑,优选为3~10。
所述淀粉样蛋白结合核酸适体可以单独使用,也可将2种以上组合。此外,在多聚体的情况下,也可以为所述结构单元数目不同的核酸适体的组合。
此外,所述淀粉样蛋白结合核酸适体在其两端可以具有附加序列。作为这样的附加序列,可以举出由鸟苷核苷酸以外的核苷酸、胸苷核苷酸或胞嘧啶核苷酸2个以上连续而形成的序列等。这样的附加序列例如是为了保持低聚核苷酸末端标记中的标记物的功能而设置的。作为所述附加序列,可以举出5个连续的胸苷核苷酸、腺嘌呤核苷酸等。通过设置5个连续的胸苷核苷酸,例如可防止进行荧光标记的情况下荧光强度的降低。
所述淀粉样蛋白结合核酸适体可使用已知的方法根据序列进行化学合成,只要为本领域技术人员,即可适宜选择用于得到淀粉样蛋白结合核酸适体的合成方法。
<淀粉样蛋白低聚物的检测方法>
本发明的淀粉样蛋白低聚物的检测方法包含下述工序:使所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体与体液试样接触(接触工序);以及对体液中的淀粉样蛋白低聚物和所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体的复合物进行检测(检测工序)。
上述淀粉样蛋白低聚物的检测方法中,使具有上述特定序列、可与淀粉样蛋白特异性结合的淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体与作为目标分子的淀粉样蛋白低聚物接触、并对由它们构成的复合物进行检测,因而可对试样中的淀粉样蛋白低聚物进行特异性检测。
对于作为淀粉样蛋白低聚物的检测对象的体液试样,只要为可能存在有淀粉样蛋白低聚物的待检试样就没有特别限制,可以使用髓液、血清和血浆等体液或其稀释物。只要这些待检试样可由被测物中分离出即可。
在淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体与待检试样接触前,可以设有待检试样的制备工序。作为这样的制备工序,可以举出:由被测物中的采集;采集试样的稀释,使用适当的稀释液稀释至适于检测的浓度;等等。
关于接触工序中淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体与待检试样的接触没有特别限制,可以直接应用核酸适体与目标分子的接触中通常使用的条件。在待检试样中存在目标淀粉样蛋白低聚物的情况下,可在试样中形成淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体与目标淀粉样蛋白低聚物的复合物。
在检测工序中,对于接触工序中形成的所述复合物进行检测。需要说明的是,本检测工序中的术语“检测”不仅包括试样中有无所述复合物的检测,还包括对试样中的所述复合物进行定量。此外,通过使用校正曲线由所述复合物的检测或定量来进行试样中中的目标淀粉样蛋白低聚物的检测或定量也可利用常规方法来进行。
待检试样中的目标淀粉样蛋白低聚物的检测或定量可利用基于核酸适体的通常公知的方法来进行,例如,利用下述公知方法均可进行:不使用抗体而利用核酸适体的免疫测定法(免疫色谱法或ELISA(酶联免疫吸附法,Enzyme linked ImmunosorbentAssay);或WO2005/049826号或WO2007/086403号所记载的测定方法;或核酸适体印迹法(日本特开2008-8237042号)、或者表面等离子共振法(SPR);等等。
作为可利用本检测方法进行检测的淀粉样蛋白低聚物,可以举出产生构型变化而得到的淀粉样蛋白的低聚物。作为这样的淀粉样蛋白,可以举出例如:α-突触核蛋白(帕金森氏病相关淀粉样蛋白)、β淀粉样肽(阿尔兹海默型认知症相关淀粉样蛋白)、感染性蛋白质蛋白质(所谓疯牛病相关淀粉样蛋白)、Tau蛋白质(阿尔兹海默型认知症相关淀粉样蛋白)、多聚谷氨酰胺肽(多聚谷氨酰胺病相关淀粉样蛋白)、亨廷顿蛋白(亨廷顿舞蹈症相关淀粉样蛋白);以及SOD1蛋白、TDP-43蛋白(肌萎缩性侧索硬化症相关蛋白)、胰淀素(アミリン,II型糖尿病相关蛋白)、血浆淀粉样A蛋白、溶酶体蛋白(全身性淀粉样变性相关蛋白)、β2微球蛋白(透析性淀粉样变性相关蛋白)等。
<淀粉样蛋白低聚物检测试剂盒>
本发明的淀粉样蛋白低聚物检测试剂盒含有所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体。
如上所述,本试剂盒所含有的淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体可特异性地检测淀粉样蛋白低聚物,因而通过使用本试剂盒可简便地检测淀粉样蛋白低聚物。
本试剂盒可以包括:容纳所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体的容纳部;以及记载了使用所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体检测淀粉样蛋白低聚物的检测方法的产品说明书。此外还可以包括容纳稀释剂的稀释剂用容纳部,该稀释剂用于将作为检测淀粉样蛋白低聚物的对象的待检试样稀释到适度的浓度;此外,也可不包括该稀释剂用容纳部而包括容纳其它试剂的试剂容纳部。
对于本试剂盒中的“容纳部”,只要是对于各药剂不混合而独立存在为有效的形态就没有特别限制,例如,可以为容器或个别包装形态等,也可以是作为以一个片状独立区分的区域的形态。
作为试剂盒可能包括的其它试剂,可以举出可用于检测所述复合物的试剂、阳性或阴性对照样品等。
<其它用途>
如上所述本发明的一个方式提供了:(1)由序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列构成的多核苷酸;(2)由至少含有4组至少2个连续的鸟苷核苷酸、且是序列编号1~18的任意之一所表示的碱基序列中有1个或2个以上的碱基发生缺失、取代、或者添加而成的碱基序列所构成的多核苷酸;以及(3)含有由序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列构成的多核苷酸作为结构单元的多聚体多核苷酸。
这些多核苷酸或多聚体多核苷酸除上述用途外还可用于各种用途中。
特别是由于所述多核苷酸或多聚体多核苷酸作为淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体对淀粉样蛋白低聚物具有特异结合性,因而可在以淀粉样蛋白低聚物为目标的各种方式中进行使用。
例如,所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体可作为与目标淀粉样蛋白低聚物的种类相对应的疾病的治疗剂或预防剂或者治疗或预防用医药组合物来应用。这样的治疗剂或预防剂含有所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体作为有效成分。此外,治疗用或预防用医药组合物含有所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体以及作为医药能够容许的载体。作为医药能够容许的载体,可以举出在该用途中通常使用的各种有机或者无机载体物质。在治疗剂或预防剂、或者治疗用或预防用医药组合物的情况下,所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体可以进一步作为与治疗用或预防用的其它有效成分的结合体的形态来含有。
此外,本发明还包括与目标淀粉样蛋白低聚物的种类相对应的疾病的治疗或者预防方法。本疾病的治疗或预防方法含有将有效量的所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体施用至对象。
对于作为这些的治疗或预防对象的疾病,可以举出与淀粉样蛋白低聚物相关的疾病。作为这样的疾病,可以举出例如:帕金森氏病、感染性蛋白质病(疯牛病)、多聚谷氨酰胺病、亨廷顿舞蹈症、阿尔兹海默型认知症、路易氏体失智症、帕金森氏病、多***萎缩症、克-雅氏病、牛海绵状脑病或痒病等感染性蛋白质病、皮克病或进行性核上性麻痺等Tau蛋白病、亨廷顿舞蹈症等多聚谷氨酰胺病、肌萎缩性侧索硬化症、II型糖尿病、全身性淀粉样变性或透析性淀粉样变性等淀粉样变性等。
此外,作为给药对象,只要为可产生淀粉样蛋白低聚物的累积的生物即可,可以举出:人、猴子等灵长类;以及牛、马、羊等家畜动物。
此外,所述(1)~(3)的淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体可以构成具有所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体与可通过高频感应加热而发热的导电性颗粒的核酸适体-导电性颗粒结合体的一部分。
此处“高频感应加热”是指在高频频率、高频电压等加热条件下设定为特定温度进行加热。
由于所述核酸适体-导电性颗粒结合体含有所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体部分,因而可藉由核酸适体部分与淀粉样蛋白低聚物特异性结合;并且由于含有所述导电性颗粒,因而通过高频感应加热,导电性颗粒可发热而产生热。通过使用该核酸适体-导电性颗粒结合体,可以仅对照射了高频交流磁场的区域进行局部加热,通过调整所产生的热,从而可破坏与核酸适体结合的目标物质。由此,可破坏目标淀粉样蛋白低聚物、预防或消除淀粉样蛋白低聚物的累积,可以减轻淀粉样蛋白低聚物的累积所致的各种症状、或预防其发病。
作为导电性颗粒的原料,只要为通过高频感应加热而发热的材料就没有特别限定,可以举出例如金属、导电性聚合物。作为金属,例如优选金、铝、铜、银等过渡金属,特别优选金。
作为导电性颗粒使用金颗粒的情况下,可以使用金纳米颗粒复合物。作为金纳米颗粒复合物,可以使用例如NANOGOLD(商标)(纳米探针社(Nanoprobes,Inc.))等市售的金纳米颗粒复合物。金纳米颗粒具有可放大基于银离子的光学信号、并且具有能够构建对聚集所致的颜色变化进行观察的检测法的优点。因此,通过将金纳米颗粒与核酸适体结合,能够达成高灵敏度的蛋白质检测。
此外,也可不使用导电性颗粒而使用磁性颗粒。此处,磁性颗粒可以含有例如Fe2O3或Fe3O4等材料。
核酸适体-导电性颗粒结合体的制造方法可以直接应用为了使无机材料与核苷酸等结合而通常应用的手段,例如可以举出使硫醇修饰核酸适体与含有马来酰亚胺的金颗粒发生反应的方法等。
高频感应加热例如可利用下述装置实现,在该装置中,在特定的电气控制电路中增大由信号发生器产生的输出功率、增加用于供给至电磁场照射线圈的阻抗匹配电路。
所述核酸适体-导电性颗粒结合体例如可如下制作。
向金纳米颗粒(直径1.4nm)30nmol中添加100μl异丙醇得到混合物,将该混合物利用Milli Q稀释至1/10,使总量为1000μl(金纳米颗粒溶液)。接下来,将所述淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体3nmol添加至金纳米颗粒溶液中,在4℃培养24小时。接着,对于所得到的混合溶液,使用利用5mM的NaH2PO4、150mM的NaCl、pH6.5进行了平衡化的凝胶过滤柱(Suplex 7516/60)来进行凝胶过滤色谱。接下来,将利用凝胶过滤色谱得到的级分脱盐,进行冷冻干燥,从而制备出核酸适体·金颗粒复合物。
实施例
下面对本发明的实施例进行说明,但本发明并不限于此。需要说明的是,只要不特别声明,“%”为质量基准。
[实施例1]
<α-突触核蛋白低聚物特异的核酸适体的制作>
(1)α-突触核蛋白试样的制备
(1-1)单体的制备
将具有加入了α-突触核蛋白基因的质粒的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)α-突触核蛋白利用含有最终浓度为30μg/ml的卡那霉素的LB培养基进行培养,通过添加IPTG诱导α-突触核蛋白的表达。将所得到的湿菌体悬浮后进行破碎,进行离心分离(15,000g、4℃、20min),回收上清。将所得到的上清在沸腾的热水中加热20分钟。加热后进行离心分离(15,000g、4℃、15min),除去热所致的变性·聚集的蛋白质。将所得到的上清利用20mM Tris-HCl(pH8.0)透析一夜。透析后进行微量超离心(150,000g、4℃、20min),使用阴离子交换柱RESOURSE Q(GE Healthcare社)6ml利用FPLC对所得到的上清进行精制。缓冲液中使用buffer A(20mM Tris-HCl、pH8.0)和buffer B(20mM Tris-HCl、pH8.0、1M NaCl)这两种。设定阶梯梯度,结合说明书、柱容量设定流速、级分容量等,进行精制。
对于所得到的峰级分,利用Lowry法进行蛋白质浓度测定。其后进行SDS-PAGE确认精制度。精制度确认后,利用MiliQ或PBS(8.1mM Na2HPO4、1.4mM KH2PO4、37mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.3)进行透析。所得到的试样为α-突触核蛋白单体。
(1-2)低聚物的制备
利用MiliQ对重组表达和精制后的α-突触核蛋白进行透析,将透析后的α-突触核蛋白以每4mg~6mg进行分注,进行冷冻干燥。其后使用MiliQ对冷冻干燥后的试样进行复水使其浓度为30mg/ml,通过搅拌30~60分钟左右使其充分溶解后,再次进行冷冻干燥。将该试样使用PBS缓冲液进行复水使其浓度为30mg/ml,进行30~60分钟左右的搅拌使其充分溶解。通过使用Superdex200 10/300colunm(GE Healthcare社)对所得到的试样进行凝胶过滤色谱来进行精制。缓冲液使用PBS缓冲液,在流速0.5ml/min下进行分离。分离后回收认为含有低聚物的级分,使用超滤过滤器(MWCO100kDa)进行浓缩。浓缩后加入叠氮化钠使其最终浓度为0.02%,在4℃保存。所得到的试样为α-突触核蛋白低聚物试样。
(1-3)纤维试样的制备
将以1mg/ml~2mg/ml溶解在PBS缓冲液中的α-突触核蛋白单体在37℃振荡培养,促进纤维形成。以与淀粉样纤维结合的荧光色素Thioflavin T(硫磺素T,TfT)(Sigma社)的荧光为指标来制备α-突触核蛋白的纤维试样。一边对TfT的荧光强度进行测定一边进行培养,在TfT的荧光饱和时停止培养。对培养试样进行离心(10,000g、20℃、10min),回收上清。
向颗粒中加入400μl的PBS缓冲液,进行良好的漩涡搅拌。其后再次在相同条件下进行离心,同样地对颗粒进行清洗。该操作进行3次,将最终得到的颗粒悬浮在50μl的PBS缓冲液中。将其作为α-突触核蛋白纤维试样。对回收上清的蛋白质浓度进行测定来计算出纤维试样的蛋白质浓度,算出α-突触核蛋白纤维试样的浓度。
需要说明的是,由于纤维试样未精制,因而估计会少量混有α-突触核蛋白低聚物。
(2)α-突触核蛋白低聚物特异的核酸适体的制备
(2-1)低聚核苷酸的合成
分别设计下述(a)~(e)所示的随机文库和引物(序列编号19~23),合成各种低聚核苷酸。对于随机文库和正向引物,在5’末端附加FITC序列(下述碱基序列中表示为“FITC”。);对于反向引物,在3’末端附加生物素序列(下述碱基序列中表示为“Biotin”。),分别构建经FITC或生物素修饰的序列。此外,关于3’末端侧引物区域的互补链,分别制作在5’末端具有FITC修饰序列的序列与未修饰的序列。
(a)随机文库(序列编号19)
5’-FITC-ATA CTG CCA TTC ATT TCA TTT(N24)TTT AGA TAT CAG CAT GTGTCA-3’
(b)5’末端侧引物区域的互补链(序列编号20)
5’-TGA AAT GAA TGG CAG TAT-3’
(c)3’末端侧引物区域的互补链(序列编号21)
5’-TGA CAC ATG CTG ATA TCT-3’
(d)正向引物(序列编号22)
5’-FITC-ATA CTG CCA TTC ATT TCA-3’
(e)反向引物(序列编号23)
5’-TGA CAC ATG CTG ATA TCT-Biotin-3’
(2-2)使用凝胶阻滞分析的筛选(第1、2轮)
使用凝胶阻滞分析对所得到的低聚核苷酸进行筛选。筛选反复进行以下的(i)~(iv)的全部操作2次。
(i)与α-突触核蛋白低聚物结合的ssDNA的选择与ssDNA文库的结合确认
将5’末端FITC修饰的DNA文库与引物区域的互补链DNA按每等摩尔量进行混合,在TBS缓冲液(10mM Tris-HCl,150mM NaCl,5mM KCl、pH7.4)中使其折叠后,将α-突触核蛋白低聚物与DNA混合,利用高速振荡机在搅拌下室温培养1小时。折叠是通过在95℃加热3分钟后,利用30分钟将温度降至25℃来进行的。
其后,使用3%琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中对该混合溶液进行电泳。通过利用可变图像分析仪Tyhoon8600(GE Healthcare社、以下相同)进行FITC的荧光检测来确认低聚物与DNA的结合。其后对凝胶进行CBB染色,确认蛋白质的位置。
(ii)与α-突触核蛋白低聚物结合的ssDNA的提取
对于上述(i)中使用的进行了α-突触核蛋白低聚物与DNA的混合溶液的电泳的凝胶,利用醇进行清洗,使用烧热的刀片和镊子切取蛋白质部分的凝胶进行回收。
使用MERmaid kit(Q-biogene社),由该凝胶对与α-突触核蛋白低聚物结合的DNA进行提取。实验操作按照常规方案进行。最终使DNA溶出到1×TE缓冲液(10mMTris-HCl、1mM EDTA)中,作为下述文库的模板。
(iii)所提取的ssDNA的扩增
将提取的ssDNA作为模板进行PCR。制备30份含有FITC修饰5’引物(最终浓度0.4μM)、生物素修饰3’引物(最终浓度0.4μM)、dNTP(最终浓度0.2mM)、5U/μl的Taq DNA聚合酶、5μl的模板DNA的PCR反应液100μl。
利用热循环仪在95℃加热3分钟后,以95℃1分钟、52℃1分钟、72℃1分钟为1循环,反复进行30循环。各PCR产物在TAE缓冲液中使用3%琼脂糖21凝胶进行电泳,确认到作为模板的DNA发生扩增。
(iv)扩增的dsDNA的单链化
将抗生物素蛋白固定化琼脂糖120μl利用5倍量的上柱缓冲液(30mM HEPES、500mM NaCl、5mM EDTA、pH7.0)进行2次清洗。其中,在PCR产物中添加其1/10倍量的×50TE缓冲液和1/5倍量的5M NaCl,将该溶液添加至清洗后的抗生物素蛋白固定化琼脂糖中,进行30分钟培养。
培养后去除上清,利用5倍量的上柱缓冲液对琼脂糖进行2次清洗后,加入琼脂糖1.5倍量的0.15M NaOH进行10分钟搅拌,回收上清后,再次向琼脂糖中加入同量的0.15M NaOH进行10分钟搅拌,使ssDNA溶出,回收上清。将含有ssDNA的上清利用2M HCl中和,利用乙醇沉淀回收ssDNA。
将所得到的颗粒利用60μl的TE缓冲液溶解,使用分光光度计测定260nm的吸收,从而计算出DNA浓度。需要说明的是,操作全部在室温下进行。
(2-3)使用核酸适体印迹的竞争性筛选(第3、4、5轮)
反复进行下述(v)~(viii)的操作,进行全部3轮的使用核酸适体印迹的竞争性筛选。
(v)与α-突触核蛋白低聚物结合的ssDNA的选择
将制备为硝酸纤维素膜的各种量的α-突触核蛋白单体、低聚物和纤维分别固定、干燥后,将膜与利用TBS-T(25mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.005M KCl、0.05%Tween20)制备的4%脱脂乳在室温下培养1小时培养来进行封闭。
其后使用充分量的TBS-T对膜进行清洗(2min×2次、10min×1次)。与上述(i)同样地进行5’末端FITC修饰的DNA文库的折叠,将DNA与膜在室温下培养1小时后,使用充分量的TBS-T对膜进行清洗(2min×2次、10min×1次、5min×2次)。
(vi)与α-突触核蛋白低聚物结合的ssDNA的提取
将进行了低聚物固定化的部分的硝酸纤维素膜剪下,添加200μl的8M脲和600μl的苯酚氯仿,搅拌3分钟后,在室温下静置30分钟。向其中加入MilliQ 100μl,搅拌3分钟,进行离心分离(12000rpm、10℃~20℃),将得到的上清转移到新的Eppendorf管中。进一步加入与上清同等量的氯仿,搅拌3分钟后,进行离心分离(12000rpm、10℃~20℃),将上清转移到新的Eppendorf管中,将其中所含有的ssDNA分子通过乙醇沉淀进行回收,将回收后得到的颗粒利用30μl的TE缓冲液(10mM Tris、1mMEDTA)溶解。
(vii)提取的ssDNA的扩增
与上述(iii)同样地操作。
(viii)扩增的dsDNA的单链化
与上述(iv)同样地操作。
(2-4)所得到的文库的序列解析
将上述第4轮或第5轮筛选中提取出的DNA作为模板,使用未修饰的引物进行PCR。使用3%琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中对所得到的PCR产物进行电泳,之后剪下目的大小的条带,使用MERmaid kit进行凝胶精制。
精制后,将试样用于TA克隆化,将其与pGEM-T连接。TA克隆化使用pGEM-T载体***进行。加入精制后的ssDNA溶液3μl、以及5μl快速连接缓冲液、1μl的pGEM-T载体(50ng)、1μl的T4DNA连接酶,制备成总量为10μl后,在室温下进行1小时连接。
使用连接样品转化大肠杆菌DH5α,利用振荡机进行1小时前培养后,涂覆在含有100μg/ml氨苄西林、0.1mM IPTG、40μg/ml X-gal的LB培养基的培养板上。将其在37℃进行主要培养,通过颜色选择来选择含有***了目的DNA的质粒的菌落。
利用1ml的LB液体培养基(Amp 100μg/ml)对含有目的质粒的大肠杆菌DH5α进行培养后进行集菌,利用碱-SDS法进行质粒提取。使用提取出的质粒进行序列分析。
(2-5)基于核酸适体印迹的结合分析
将α-突触核蛋白单体、低聚物、纤维1μg固定在硝酸纤维素膜上,干燥后,将膜与利用TBS-T(25mMTris-HClpH7.4、0.15M NaCl、0.005M KCl、0.05%Tween-20)制备的4%脱脂乳在室温下培养1小时来进行封闭。其后使用充分量的TBS-T对膜进行清洗(2min×2次、10min×1次)。对于在5’末端进行FITC修饰而得到的2个以上的低聚核苷酸(f.c.100nM)进行折叠,将DNA与膜在室温下培养1小时后,使用充分量的TBS-T对膜进行清洗(2min×2次、10min×1次、5min×2次)。其后将利用TBS-T进行1000倍稀释后的HRP修饰抗FITC抗体与膜在室温下培养1小时,之后使用充分量的TBS-T对膜进行清洗(2min×2次、10min×1次、5min×2次)。向膜中添加ECL PlusWestern印迹检测***(GE Healthcare社),利用Typhoon 8600检测HRP的化学发光,从而观察DNA与蛋白质的结合。
该结果见图1。
如图1所示,确认得到了不与α-突触核蛋白单体结合、而与低聚物强结合的下述8种α-突触核蛋白低聚物结合核酸适体。
T-SO517:GGTGGCTGGAGGGGGCGCGAACG(序列编号1)
T-SO606:GGGTCGGCTGTCCGTGGGTGGGGA(序列编号2)
T-SO554:CGAGGGGCGTCTGGGAGTGGTCGG(序列编号3)
T-SO530:GGTGCGGCGGGACTAGTGGGTGTG(序列编号4)
T-SO552:GCGTGTGGGGCTTGGGCAGCTGGG(序列编号5)
T-SO504:CAGGGGTGGGCAAAGGGCGGTGGTG(序列编号6)
T-SO508:GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG(序列编号7)
T-SO602:GCGGTAGGGTGTGAGCGGAAGGGG(序列编号8)
另外,使用CD光谱对所得到的α-突触核蛋白低聚物结合核酸适体具有G-四分体结构的情况进行确认。
即,利用TBS缓冲液(10mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM KCl、pH7.4)将核酸适体制备为20μM,进行折叠。其后使用圆二色性分散计J-720测定CD光谱。测定在温度20℃、波长200~320nm、扫描速度100nm/min、积分次数10次的条件下进行。
其结果,由于存在240nm附近的最小值和260nm附近的最大值,可知上述α-突触核蛋白低聚物结合核酸适体具有G-四分体结构。
(3)α-突触核蛋白低聚物结合核酸适体的特异性的确认
在上述得到的8种核酸适体之中,对T-SO517和T-SO606与抗α-突触核蛋白低聚物抗体A11(Life technologies社)的结合性进行比较。
在同样的硝酸纤维素膜上固定各为5pmol的以PQQ为辅酶的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)(国际试剂社)、C反应性蛋白质(CRP)(Polyscience社)、荧光素酶、IgG抗体(Sigma社),以及0.5μg的α-突触核蛋白低聚物,使用该膜,利用核酸适体印迹法进行特异性的评价。
此外,使用抗低聚物抗体A11同样地对特异性进行评价。操作按照常规方案进行。需要说明的是,荧光素酶使用的是利用采用大肠杆菌的重组生产而制备出的荧光素酶。
其结果见图2。需要说明的是,PQQGDH、CRP、荧光素酶、IgG抗体和α-突触核蛋白低聚物均为富含β结构的蛋白质。
如图2所示,A11抗体不仅对α-突触核蛋白低聚物、而且对富含β结构的其它蛋白质也显示出结合性;与此相对,对于实施例1中得到的T-SO517和T-SO606,确认到对其它蛋白质不显示出结合性、而对α-突触核蛋白低聚物具有高特异性。
(4)相对于β淀粉样肽的结合性
如下确认上述得到的8种核酸适体相对于β淀粉样肽的结合性。
(4-1)β淀粉样肽Aβ1-40的制备
作为β淀粉样肽,使用Aβ1-40(Peptide Institute,Inc社)。
将利用六氟异丙醇(HFIP)稀释至最终浓度为2.5mg/ml的100μL的Aβ1-40溶液与900μL的MilliQ混合,在室温下搅拌后进行离心(14,000g、室温、15min),回收上清。在上清中进行Ar气体鼓泡后,使用高速振荡机进行24小时搅拌(800rpm、室温)。其后对试样进行离心(14,000g、4℃、20min),利用超滤过滤器(MWCO:10kDa)对回收的上清进行浓缩。将其作为Aβ1-40低聚物试样。
需要说明的是,对于Aβ1-40单体试样,直接使用上述制备的Aβ1-40溶液。
如下制备Aβ1-40纤维试样。首先,将Aβ1-40溶解在DMSO中,使最终浓度为4.33mg/ml,来制作贮存液。将其利用PBS稀释至50μM,在37℃搅拌9天左右。其后在14,000G、4℃离心20分钟,回收颗粒。在颗粒中加入500μL的PBS,进行搅拌·离心,反复进行2次该操作,对颗粒进行清洗。与上述同样地对各操作中得到的上清在280nm的吸光度进行测定,计算出颗粒中残留的蛋白质量。其后利用PBS将颗粒复水至所期望的浓度,作为纤维试样用于实验中。
(4-2)核酸适体印迹分析
将12.5pmol的Aβ1-40单体·低聚物·纤维在相同的硝酸纤维素膜上进行固定化,使用500nM的各核酸适体通过核酸适体印迹评价结合特异性。作为对照使用A11,进行同样的实验。
将各为3μL、2μL、1μL、0.5μL的Aβ1-40低聚物试样、以及各为300ng、200ng、100ng、50ng的α-Syn低聚物分别固定在硝酸纤维素膜上,使用A11进行斑点印迹。
对固定有α-Syn低聚物的位置的斑点强度进行分析,通过制作校正曲线来估算出Aβ1-40低聚物试样所含有的低聚物浓度。其后按照A11的斑点强度为同等程度将Aβ1-40低聚物固定在硝酸纤维素膜上,使用500nM的各核酸适体进行核酸适体印迹。作为对照使用A11,进行同样的实验。
结果见图3。
如图3所示,实施例1中得到的8种淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体均可识别Aβ1-40低聚物,但在Aβ1-40单体或纤维中未显示出结合性。
由此可知,本实施例的淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体可特异性识别α-突触核蛋白低聚物、Aβ1-40低聚物。
[实施例2]
<二聚体型核酸适体的结合性1>
将实施例1中得到的核酸适体T-SO504的序列利用5mer的胸腺嘧啶脱氧核苷(t)核苷酸连接,合成核酸适体二聚体(504W)。
此外,作为比较对照,还同样地合成从T-SO504的碱基序列中削除5’末端侧的3碱基和3’末端侧的8碱基而成的多核苷酸504M1(GGGTGGGCAAAGGG:序列编号24)、从T-SO504的碱基序列削除5’末端侧的7碱基和3’末端侧的8碱基而成的多核苷酸504M2(GGGCAAAGGG:序列编号25)。
此外,对于各多核苷酸,为了缓和抗FITC抗体结合中的立体障碍以及防止鸟嘌呤所致的FITC的消光,分别在5’末端侧附加5mer的腺嘌呤核苷(a)核苷酸(对于T-SO504附加胸腺嘧啶(t)核苷酸:tT-SO504),进一步进行FITC修饰。需要说明的是,在504M1和504M2中,为了进一步防止多聚体形成,在3’末端侧附加2mer的腺嘌呤核苷核苷酸。
所得到的各核酸适体的序列列于表1。表1中,小写字母(t或a)意味着上述的附加序列。
【表1】
对于各核酸适体相对于α-突触核蛋白单体、α-突触核蛋白低聚物和α-突触核蛋白纤维的结合性,与上述的实施例1(2-5)同样地进行。需要说明的是,所使用的α-突触核蛋白单体、α-突触核蛋白低聚物和α-突触核蛋白纤维使用与实施例1中所用相同的物质。
其结果见图4。
如图4所示,作为实施例1中得到的T-SO504的二聚体的504W与T-SO504显示出相同的特异性,同时结合能力提高。
与此相对,在削除T-SO504碱基序列的一部分且二连续的鸟苷核苷酸仅为3组的504M1、以及仅为2组的504M2中,无法保持T-SO504的结合性。
[实施例3]
<二聚体型核酸适体的结合性2>
(1)二聚体型核酸适体的制作
针对实施例1中得到的核酸适体T-SO530的序列,设计、合成藉由5mer或10mer的胸腺嘧啶连接子串联排列而成的二聚体(下面记为5T二聚体、10T二聚体)。对于各核酸适体,在5’末端连接FITC作为抗原进行修饰,在FITC与核酸适体之间***5mer的胸腺嘧啶作为连接子。各核酸适体序列列于表2。
【表2】
(2)二聚体型核酸适体的结合能力评价
对于所制作的5T二聚体、10T二聚体以及作为原来的核酸适体的T-SO530的Aβ低聚物进行结合能力评价。
将1μM的Aβ低聚物溶液或PBS缓冲液以每100μL加入到MaxiSorp(注册商标)培养板(Nunc社)的各孔中,在37℃培养1.5h,将Aβ低聚物固定在孔上。对于各孔利用2%(w/v)的BSA溶液(TBS-T:25mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.005M KCl、0.05%Tween-20)进行封闭,制作Aβ低聚物固定化培养板。
在Aβ低聚物固定化培养板的各孔中加入制备成1nM、2.5nM、或者10nM浓度的上述各FITC标记核酸适体,在室温下进行60分钟培养。将孔清洗后,向孔中添加HRP修饰抗FITC抗体(Cosmo生物社),在室温下进行培养。将孔清洗后,加入HRP的发光底物,通过化学发光检测各核酸适体在低聚物上的结合。结果见图5。
此外,使10T二聚体与作为原来的核酸适体的T-SO530的浓度为1nM、2.5nM、10nM、20nM或者60nM,与上述同样地进行与Aβ低聚物的结合实验。基于所得到的结合信号,使用GraphPad Prism(一种医学绘图软件,MDF社)进行曲线拟合,计算出结合解离常数(Kd)。
如图5所示,在T-SO530中,自10nM起确认到了信号;与此相对,在5T二聚体中,自1nM起得到了信号;在10T二聚体中,自2.5nM起得到了信号。由其结果可知,二聚体型的核酸适体的结合力强于单体型的核酸适体。
此外,对于结合解离常数(Kd),T-SO530的Kd为9.03±3.06nM、10T二聚体的Kd为1.44±0.68nM。与原来的核酸适体相比,二聚体型的Kd值降低至6分之1左右,因而可知,二聚体型的核酸适体中具有得到了提高的结合亲和性。
(3)相对于β淀粉样肽的结合性
如下确认上述得到的5T二聚体与10T二聚体相对于β淀粉样肽的结合性。
(3-1)β淀粉样单体的制备
作为β淀粉样肽使用Aβ1-40(Peptide Institute,Inc社)。将其以最终浓度为2.5mg/ml溶解在六氟异丙醇(HFIP)溶液中,制备贮存液。将该贮存液利用PBS稀释成所期望的浓度,直接使用其作为Aβ1-40单体。利用紫外可见分光解析***DU 800(Beckmancoulter社)、或者NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific社)测定280nm处的吸光度,从而来确认蛋白质浓度,作为β淀粉样单体用于实验中。
(3-2)β淀粉样低聚物的制备
Aβ1-40低聚物与实施例1同样地进行制备。与单体试样同样地测定280nm处吸光度,确认蛋白质浓度,作为β淀粉样低聚物试样用于实验中。
(3-3)β淀粉样纤维的制备
将Aβ1-40溶解在DMSO中使其最终浓度为4.33mg/ml,制作贮存液。将其利用PBS稀释至50μM,在37℃搅拌9天左右。其后在14,000G、4℃离心20分钟,回收颗粒。向颗粒中加入500μL的PBS进行搅拌·离心,反复进行2次该操作,对颗粒进行清洗。与上述同样地对于各操作中得到的上清在280nm处的吸光度进行测定,从而计算出颗粒中残留的蛋白质量。其后将颗粒利用PBS复水至所期望的浓度,作为纤维试样用于实验中。
(3-4)核酸适体印迹分析
将所得到的Aβ1-40的单体、低聚物、纤维试样各0.5μg固定在硝酸纤维素膜上,干燥后,将膜与利用TBS-T(0.05%Tween20)制备的4%脱脂乳在室温下培养1小时来进行封闭,得到固定有Aβ1-40的各试样的印迹分析用硝酸纤维素膜。对于该硝酸纤维素膜,除了使用各核酸适体200nM以外,与实施例1的(2-5)同样地进行印迹分析。
结果见图6。
如图6所示,5T二聚体与10T二聚体均在固定有低聚物的位置确认到强斑点。由此可知,5T二聚体与10T二聚体均对Aβ1-40的低聚物显示出高选择性。
[实施例4]
(1)改良型序列的制作
将上述实施例1中得到的8种核酸适体的序列作为亲本序列,通过进行一点交叉和2碱基变异导入来制作24条第一代的核酸适体序列。
合成在所得到的第一代的各核酸适体序列的3’侧添加18mer互补链形成区域的DNA。合成与该互补链形成区域互补的18mer DNA,在其5’末端侧通过常规方法结合FITC,来制作标记化序列,藉由互补链形成区域将FITC修饰在第一代核酸适体序列上。将所得到的各FITC标记核酸适体分别添加到TBS缓冲液中,制备FITC标记核酸适体溶液。
将2μM的Aβ低聚物溶液或PBS缓冲液以每孔100μL加入到MaxiSorp(注册商标)培养板(Nunc社)的各孔中,在37℃培养1.5h,将Aβ低聚物固定在孔上。利用4%(w/v)的脱脂乳对各孔进行封闭,制作Aβ低聚物固定化培养板。
在Aβ低聚物固定化培养板的各孔中加入制备成最终浓度为500nM的FITC标记核酸适体,在室温下培养30分钟。
将孔清洗后,向孔中添加HRP修饰抗FITC抗体(Cosmo生物社),在室温下进行培养。将孔清洗后,加入HRP的发光底物,通过化学发光检测各核酸适体与低聚物的结合,进行比较。进行各培养板间信号强度的标准化时,使用在作为亲本序列的T-SO508核酸适体序列的3’侧藉由形成互补链而进行了FITC修饰的核酸适体(3’FC508)。
基于与Aβ低聚物的结合能力,在第一代核酸适体之中选择结合能力最高的6条序列。
将所得到的6条第一代核酸适体序列作为亲本序列,通过进行一点交叉和2碱基变异导入来制作24条第二代的核酸适体序列。
对于第二代的核酸适体序列,与上述同样地对于与Aβ低聚物的结合能力进行检测、并进行比较。在第二代的核酸适体序列中选择结合能力高的4条序列。与亲本序列的结合能力相比,显示出最高结合能力的第二代核酸适体序列显示出了8.69倍的化学发光。
将所得到的4条第二代核酸适体序列作为亲本序列,通过进行一点交叉和2碱基变异导入来制作24条第三代的核酸适体序列。
对于第三代的核酸适体序列,与上述同样地对于与Aβ低聚物的结合能力进行检测、并进行比较。与亲本序列的结合能力相比,显示出最高结合能力的第三代核酸适体序列显示出了22.55倍的化学发光。
如上所述,得到了与Aβ低聚物具有结合性的下述核酸适体。
2G16:CGAGGGGCGTCTGGGGGGGAGGGA(序列编号9)
2G4:CGGGGGGCGTGTGGGAGAGGTCGG(序列编号10)
2G13:TGGGGGGCGTAGGGTCGCGAACGA(序列编号11)
2G9:CGGGGGGCGTAGGGGAGAGGGGCG(序列编号12)
3G4:CGGGGGGCCTGAGGGGGGGAGGGA(序列编号13)
3G21:CGGGGCGCATCTGGGGGGGAGGGA(序列编号14)
3G16:CGGGGGGCTTGTGGCGGGGAGGGA(序列编号15)
3G22:CGAGGGGAGTAGGGGGGAGGGGCG(序列编号16)
3G14:CGGGGGGCGTCTGGGCGCGAGGGA(序列编号17)
3G9:CGGGGGCCGTTGGGGGGGGAGGGA(序列编号18)
(2)结合能力评价
在上述(1)中得到的核酸适体之中,对于2G16和3G4以及由亲本序列得到的核酸适体3’FC508进行结合能力的评价。
具体地说,使各核酸适体的浓度为1nM、5nM、1nM、25nM、50nM、100nM、或者200nM,与上述(1)同样地对于与Aβ低聚物的结合能力进行确认。基于所得到的结合信号,使用GraphPad Prism(MDF社)进行曲线拟合,计算出结合解离常数(Kd)。结果见图7。对于图7中的各符号,菱形表示3’FC508,正方形表示2G16,三角形表示3G4。
其结果,3’FC508的Kd为67.74nM,2G16的Kd为67.10nM,并且3G4的Kd为70.75nM,各Kd均为70nM左右,在结合解离常数上未见差异。
(3)核酸适体的结构解析
通过使用15质量%聚丙烯酰胺凝胶的电泳对上述(1)中得到的核酸适体、核酸适体3’FC508、2G16、3G4的各结构进行分析。在15质量%Tris-甘氨酸凝胶(WAKO)上进行上述(1)中得到的经FITC修饰的各核酸适体3’FC508、2G16、3G4的点样,在TBE缓冲液中进行电泳。其后,通过观察FITC的荧光来确认各核酸适体的泳动位置。
PAGE解析的结果见图8。对于图8中的各泳道,左起表示ladder、核酸适体3’FC508、2G16、3G4。
如图8所示,核酸适体2G16和3G4中,除了在50bp附近的条带外,还均在推测为1000bp的泳动位置检测到了2个以上的条带。由此可知,2G16和3G4除采取单体形态外,还采取各核酸适体序列十几个以上集合形成的多聚体形态。
此外可知,可通过上述条件下的计算机内进化法得到进行多聚体化且可结合的核酸适体。
(4)相对于β淀粉样肽的结合性
确认上述得到的2G16与3G4相对于β淀粉样肽的结合性。
β淀粉样单体、低聚物、纤维各试样使用实施例3(3)中得到的物质。
除了在200nM的浓度下使用2G16与3G4各核酸适体以外,与实施例3(3)同样地进行印迹分析。结果见图9。
如图9所示,对于2G16和3G4,均可在固定了低聚物和纤维的位置确认到斑点,特别是在固定了低聚物的位置确认到强斑点。与此相对,对于各核酸适体,均无法在固定了单体的位置确认到斑点。由此可知,相对于Aβ1-40的单体,2G16与3G4均可特异性识别低聚物。
因而,本发明的淀粉样蛋白低聚物结合核酸适体能够特异性识别淀粉样蛋白低聚物。
2011年2月18日提交的日本国专利申请第2011-033998号的公开内容全部以参照的形式***到本说明书中。
本说明书所记载的全部文献、专利申请和技术标准是以参照的形式***各文献、专利申请和技术标准的,与具体的且分别记载的情况同等程度地援引并***到本说明书中。
Claims (7)
1.一种对淀粉样蛋白低聚物具有结合性的核酸适体,该核酸适体具有G-四分体结构、且为选自由下述多核苷酸组成的组中的至少1种:
(1)由序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列构成的多核苷酸;
(2)由至少含有4组至少2个连续的鸟苷核苷酸、且是序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列中有1个或2个以上碱基发生缺失、取代或者添加而成的碱基序列所构成的多核苷酸;以及
(3)多核苷酸,其是含有所述(1)或(2)的多核苷酸作为结构单元的多聚体。
2.如权利要求1所述的核酸适体,其中,所述(3)的多核苷酸具有所述(1)或(2)的多核苷酸与将各(1)或(2)的多核苷酸间连接起来的接头序列。
3.一种淀粉样蛋白低聚物检测试剂盒,其含有权利要求1或权利要求2所述的核酸适体。
4.一种淀粉样蛋白低聚物的检测方法,该方法包括以下步骤:
使权利要求1或权利要求2所述的核酸适体与待检试样接触;以及
对所述待检试样中的淀粉样蛋白低聚物和所述核酸适体的复合物进行检测。
5.如权利要求4所述的淀粉样蛋白低聚物检测方法,其中,所述待检试样为选自由髓液、血清、血浆和它们的稀释物组成的组中的至少1种。
6.一种多核苷酸,其由序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列构成。
7.一种多核苷酸,其是含有由序列编号1~序列编号18的任意之一所表示的碱基序列构成的多核苷酸作为结构单元的多聚体。
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