CN103442696A - 预防或抑制肠病的二唾液酸乳-n-四糖（dslnt）或其变体、异构体、类似物和衍生物 - Google Patents

预防或抑制肠病的二唾液酸乳-n-四糖（dslnt）或其变体、异构体、类似物和衍生物 Download PDF

Info

Publication number
CN103442696A
CN103442696A CN2012800077356A CN201280007735A CN103442696A CN 103442696 A CN103442696 A CN 103442696A CN 2012800077356 A CN2012800077356 A CN 2012800077356A CN 201280007735 A CN201280007735 A CN 201280007735A CN 103442696 A CN103442696 A CN 103442696A
Authority
CN
China
Prior art keywords
preparation
dslnt
hmo
oligosaccharide
nec
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2012800077356A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103442696B (zh
Inventor
L·博德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN103442696A publication Critical patent/CN103442696A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103442696B publication Critical patent/CN103442696B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/163—Sugars; Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K40/00—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs
    • A23K40/10—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs by agglomeration; by granulation, e.g. making powders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23P—SHAPING OR WORKING OF FOODSTUFFS, NOT FULLY COVERED BY A SINGLE OTHER SUBCLASS
    • A23P10/00—Shaping or working of foodstuffs characterised by the products
    • A23P10/20—Agglomerating; Granulating; Tabletting
    • A23P10/28—Tabletting; Making food bars by compression of a dry powdered mixture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/067—Pancreatitis or colitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/38—Pediatrics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7095—Inflammation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pediatric Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供包含分离的二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）或其变体、异构体、类似物和衍生物的制剂。

Description

预防或抑制肠病的二唾液酸乳-N-四糖(DSLNT)或其变体、异构体、类似物和衍生物
贯穿本申请，引用了多个公开物。这些公开物的公开内容通过引用的方式整体并入本申请，以更全面地描述本发明所属领域的现状。
本发明是在NIH/NIDDK颁布的K99/R00DK078668号基金下，经由政府支持而做出的。政府对本发明享有一定权利。
背景技术
坏死性小肠结肠炎（NEC）是早产儿中最频发和致命的肠病之一。几乎10%的极低出生体重儿（出生体重<1,500g）会患上NEC。其中超过25%死于该病症。存活者经常面临长期的神经损伤。Lucas和Cole（Lancet,336:1519-23）在1990年就已经报道过，相比于母乳喂养的婴儿，配方喂养的婴儿患上NEC的风险高6～10倍。之后，将人乳中的一些分子（例如LC-PUFA、PAF-AH、EGF）与NEC防护相关联，主要是基于动物研究。然而，尽管在过去的10～15年中在配方组成方面有所改进，配方喂养的婴儿仍然处于比母乳喂养婴儿高6～10倍的风险。数据表明，人乳还含有配方中缺少的并保护母乳喂养的婴儿免患NEC的某些物质。对人乳中防治性成分以及其作用机制的鉴定，将为迫切需求的治疗甚至预防这种毁灭性病症的其它选择的开发铺平道路。
我们已发现，某些人乳低聚糖（HMO）保护母乳喂养的婴儿免患NEC。因此，我们提供含有此HMO的制剂，用于抑制例如NEC的肠病的方法和手段。
发明内容
根据本发明，已经发现可用于多种治疗应用的新型制剂。本发明提供包含分离的二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）或其变体、异构体、类似物和衍生物（本发明的DSLNT）的制剂。
本发明还提供通过在受试者中以足以预防或治疗肠病和/或炎症的量施用二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）或其变体、异构体、类似物和衍生物，从而预防或治疗患有肠病和/或炎症的受试者的方法。
本发明还提供鉴定母乳喂养婴儿是否处于患上坏死性小肠结肠炎（NEC）的风险的方法，包括测定母乳中二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）的浓度，其中低水平的DSLNT预示着该母乳喂养婴儿处于患上NEC的风险。
附图说明
图1.HMO和GOS。乳糖（Galβ1-4Glc）形成人乳低聚糖（HMO，左侧）的还原端，并且可以在非还原端经一个或多个乳糖胺（lactosamine）二糖（Galβ1-3/4GlcNAc）而延长，生成不同大小的HMO。乳糖或聚乳糖胺骨架可以通过以多种连接键（linkage）添加岩藻糖和/或添加唾液酸（在人中为N-乙酰基-神经氨酸）而进行修饰。各个唾液酸为HMO贡献一个负电荷。在结构上与HMO极为不同的低聚半乳糖（GOS，右侧）通过半乳糖延伸，并且没有岩藻糖和唾液酸。
图2.HMO在新生大鼠中预防NEC。A：四天存活率。HMO（10mg/mL）复原存活率而GOS（8mg/mL）没有效果。注意，x轴相交于50%存活率。B：H&E染色的回肠切片的病理得分（0：健康；4：完全破坏）。以低浓度（1mg/mL）和高浓度（10mg/mL）添加HMO，显著地降低得分。GOS（8mg/mL）没有效果。各点表示一个动物。线表示均值和标准差。[BF：母乳喂养；FF：配方喂养]。
图3.二级色谱鉴定最有效的HMO。A：按电荷进行HMO分级后的大鼠NEC。汇集的HMO通过QAE基于电荷而分级。不含唾液酸的HMO不带电（0）。具有一个或多个唾液酸的HMO携带一个或多个负电荷（-1、-2、…）。QAE-2级分对预防NEC最有效。B：HPLC-FL显示出，QAE-2仅含4种主要低聚糖。#1是单唾液酸化HMO，其被认为是无关的QAE-1级分溢出，没有效力。C：按尺寸进行的FPLC P2进一步分级。汇集仅含#2（31-40）的级分并将其与仅含#3和#4的级分分离开。#3和#4不能彼此分离。相应地考虑被排除在外的组分的损耗。D：FPLC进一步分级后的大鼠NEC。尽管#3和#4没有效果，但#2使NEC显著下降。[BF：母乳喂养；FF：配方喂养]。
图4.防治性HMO#2被鉴定为二唾液酸乳-N-四糖。多糖结构解析鉴定出HMO#2是二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）的特定异构体。
图5.人乳低聚糖（HMO）和低聚半乳糖（GOS）在结构上不同。（A）2AB-标记的从汇集人乳中分离的HMO的荧光高效液相色谱（HPLC-FL）色谱图。最常见的HMO被注释出并列于B板块。*二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT），其后来被鉴定为NEC-防治性HMO。（B）在分离的汇集HMO中发现的最常见低聚糖的示意性示图。括号中的数字对应于A板块中的注释峰。2’FL，2’-岩藻糖基乳糖；3FL，3-岩藻糖基乳糖；3’SL，3’-唾液酸乳糖；LNT，乳-N-四糖；LNnT，乳-N-新四糖；LNFP1，乳酰-N-岩藻五糖1；LNFP2，乳酰-N-岩藻五糖2；LSTb，唾液酸乳-N-四糖b；LSTc，唾液酸乳-N-四糖c。单糖符号表：实心圆，葡萄糖（Glc）；空心圆，半乳糖（Gal）；正方形，N-乙酰基-葡糖胺（GlcNAc）；三角形，岩藻糖（Fuc）；菱形，N-乙酰基-神经氨酸（NeuAc）。（C）Vivinal GOS的HPLC-FL色谱图。峰簇表示具有相同聚合度的低聚糖的结构异构体，并根据每个GOS分子中半乳糖残基的数量而不同。HMO和GOS色谱图之间的比较证实了结构组成上的明显差异。
图6.汇集的人乳低聚糖（HMO），而非低聚半乳糖（GOS），改善新生大鼠中的存活率并减少坏死性小肠结肠炎（NEC）。（A）在产后第一个96h内的新生大鼠的存活率。DF，母鼠喂养；FF，配方喂养；FF+HMO，用含有HMO（10mg/ml）的配方喂养；FF+GOS，用含有GOS（8mg/ml）的配方喂养。（B）在产后96h时对大鼠肠的宏观评价。与DF（左）和FF+HMO（右）动物相比，FF动物（中间）的肠更暗沉，并具有片状坏死以及肠出血和肠壁内气囊肿（肠壁囊样积气症）的迹象。（C）对H&E染色的大鼠回肠切片的微观评价。基于组织学异常（如底部板块示出三个实例）的存在与否，将回肠切片从0（正常）至4（完全破坏）评级。（D）在产后96h时的回肠病理得分。在三个独立实验中，在总计10～20只动物中测试各种干预。各个符号表示对于单个动物的病理得分。水平线表示平均病理得分。***p<0.001。
图7.需要在产后第一个24h暴露于人乳低聚糖（HMO），但这种暴露不足以减少坏死性小肠结肠炎。新生大鼠经母鼠喂养（DF）、在整个产后的第一个96h内经不含HMO的配方喂养（FF）、在第一个24h内经不含HMO的配方喂养然后在余下的72h内转换成含有HMO（10mg/ml）的配方（FF+HMO结尾）、或者在第一个24h内经含有HMO的配方喂养然后转换成不含HMO的配方（FF+HMO开端）。在两个独立实验中，在总计9～12只动物中测试各种干预。***p<0.001。
图8.单独的二唾液酸化人乳低聚糖（HMO）减少死性小肠结肠炎。（A）响应于向配方中添加按电荷分级的HMO的回肠病理得分。使用阴离子交换色谱，基于HMO不含（0）、含一个（-1）、含两个（-2）、含三个（-3）或含四个（-4）唾液酸残基，按电荷对汇集HMO进行分级。包含具有两个唾液酸的低聚糖（两个负电荷）的-2带电HMO级分具有最显著的效果。（B）-2带电HMO级分的HPLC-FL色谱图。（C）-2带电的HMO级分中四种主要HMO峰的MALDI-TOF质谱和可能组成。每分子中己糖（圆形）、己糖胺（正方形）、N-乙酰神经氨酸（NeuAc，菱形）和岩藻糖（三角形）的预测数量列于各个质谱上方。分析过程中NeuAc损耗使质量减小291Da。（D）使用带凝胶排阻柱的快速蛋白液相色谱（FPLC），按尺寸来分离-2带电HMO级分中四种主要的HMO峰。主要含有HMO峰2的FPLC级分被汇集在一起（HMO2）。HMO峰3和峰4不能通过凝胶排阻分离开并汇集在一个级分中（HMO3+4）。（E）响应于向配方中添加按尺寸分级的HMO的回肠病理得分。在两个独立的实验中，在总计11～14只动物中测试各种干预。***p<0.001。
图9.坏死性小肠结肠炎防治性人乳低聚糖（HMO）是二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）。（A）连接键特异性神经氨酸酶的处理显示，存在一个α2-3-连接的和一个α2-6-连接的N-乙酰基-神经氨酸（NeuAc）。荧光高效液相色谱（HPLC-FL）色谱图a：防治性HMO2；b：经α2-3-特异性神经氨酸酶处理后的HMO2；c：用连接键混杂性的神经醇胺酶（neuramidase）处理后的HMO2。（B）HMO基础骨架具有I型结构（Galβ1-3GlcNAc）。HPLC-FL色谱图d：缺乏唾液酸-HMO2（用α2-3/6神经氨酸酶处理后，产物c）；e：用β1-3-特异性半乳糖苷酶处理后的缺乏唾液酸基-HMO2；f：用β1-4-特异性半乳糖苷酶处理后的缺乏唾液酸基-HMO2。（C）HMO骨架中的亚末端糖是N-乙酰基-葡糖胺（GlcNAc）。HPLC-FL色谱图g：缺乏唾液酸-无半乳糖-HMO2（用α2-3/6神经氨酸酶和β1-3半乳糖苷酶处理后，产物e）；h：用N-乙酰葡糖胺水解酶（GlcNAcase）处理后的缺乏唾液酸-无半乳糖-HMO2。（D）HMO2的部分甲基化糖醇乙酸酯（PMAA）衍生物的气相色谱质谱（GC-MS）。（E）基于来自按序的外切糖苷酶消化和GC-MS PMAA连接键分析的结果的DSLNT示意性图示。
图10.市售的DSLNT显示出坏死性小肠结肠炎（NEC）的防治效果。响应于向配方中添加市售DSLNT的回肠病理得分。市售DSLNT（300μM）显著地降低NEC病理得分。在三个独立的实验中，在总计11～26只动物中测试各个干预。***p<0.001。
具体实施方式
除非另外定义，本文所用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解含义相同的含义。本文提及的所有专利、申请、公开申请和其它公开物都通过引用的方式整体并入。
本文所用的术语“包括、包含、含有”，当位于对方法中步骤的记载之前时，意指该方法涵盖明确记载之外的一个或多个步骤，并且这些额外的一个或多个步骤可以在所记载的步骤之前、之间、和/或之后进行。例如，包括步骤a、b和c的方法涵盖步骤a、b、x和c的方法，a、b、c和x的方法以及步骤x、a、b和c的方法。此外，当位于对方法中步骤的记载之前时，术语“包括”并不（尽管可以）要求所列步骤的相继执行，除非上下文另外清晰指明。例如，包括步骤a、b和c的方法涵盖，例如，以步骤a、c和b的顺序，步骤c、b和a的顺序以及步骤c、a和b的顺序执行步骤的方法。除非另外指明，本文所用的表示成分的量、性质比如分子量、反应条件等等的所有数字应被理解为，在所有实例中都由术语“约”修饰。因此，除非相反地指出，本文的数值参数是可以根据试图通过本发明获得的期望性质而变化的近似值。最起码，并且不将等同物声明的应用局限于权利要求的范围，应当至少考虑所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来理解各个数值参数。虽然描述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，在具体实施例中的数值是尽可能准确报告的。然而，任何数值本质上包含由数值测试测量中出现的误差而必然产生的标准差。
本文所用的术语“受试者”和“患者”是指任何动物，比如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，人、鼠科、类人猿、猫科、犬科、马科、牛科、猪、绵羊、山羊、兔、哺乳类农场动物、哺乳类体育竞技类动物和哺乳类宠物。在许多实施方式中，宿主是人。
可以通过使用已知的化学或生化原理和方法从自然界中纯化DSLNT，从而获得分离的DSLNT和/或其变体、异构体、类似物和/或衍生物，或者通过合成来得到分离的DSLNT和/或其变体、异构体、类似物和/或衍生物。本文所用的涉及本发明DSLNT的术语“分离的”并不要求绝对纯度。
I.本发明的制剂
本发明提供包含分离的二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）或其变体、异构体、类似物和衍生物（在本文中也称为DSLNT或本发明的DSLNT）的制剂。
本文所用的二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）也被称为(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,3S,4R,5R,6S)-5-乙酰氨基-2-[[(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-羧负离子基（carboxylato）-4-羟基-6-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙基]噁烷-2-基]氧基甲基]-6-[(2R,3R,4S,5R,6S)-3,5-二羟基-2-(羟甲基)-6-[(2R,3S,4R,5R)-4,5,6-三羟基-2-(羟甲基)噁烷-3-基]氧基-噁烷-4-基]氧基-3-羟基-噁烷-4-基]氧基-3,5-二羟基-6-(羟甲基)噁烷-4-基]氧基-4-羟基-6-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙基]噁烷-2-羧酸酯，或其同义词，O-(N-乙酰基-α-神经氨酰基)-(2-6)-O-(O-(N-乙酰基-α-神经氨酰基)-(2-3)-β-D-吡喃半乳糖基-(1-3))-O-2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基-(1-3)-D-葡萄糖，α-Neu5Ac-(2→3)-β-Gal-(1→3)-[α-Neu5Ac-(2→6)]-β-GlcNAc-(1→3)-β-Gal-(1→4)-Glc，或二-N-乙酰基神经氨酰基乳-N-四糖，CAS登记号为61278-38-4。
DSLNT的实施方式示于图1、4、9E和10中。
DSLNT的衍生物、异构体、类似物和变体包含低聚糖，该低聚糖具有（1）在乳-N-四糖（Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）骨架中的至少四个糖残基（例如，如图4所示）以及（2）在任意两个或更多个糖残基处的唾液酸（N-乙酰神经氨酸或Neu5Ac）残基，其中糖可以是D-葡萄糖（Glc）、D-半乳糖（Gal）、L-岩藻糖（Fuc）、D-果糖（Fru）、甘露糖（Man）、N-乙酰基半乳糖胺（GalNAc）或N-乙酰基-葡糖胺（GlcNAc）中的任一种。例如，唾液酸残基可以附着在各个第一和第二个糖残基处，其中末端非还原性糖残基被指定为低聚糖的第一个糖残基。在另一个实例中，唾液酸残基可以附着在各个第一和第三个糖残基处，其中末端非还原性糖残基被指定为低聚糖的第一个糖残基。然而，本发明还考虑唾液酸残基可以附着在任何位置处，包括还原端，例如，DSLNT的Glc。
仅以实例的方式，DSLNT衍生物可以具有四个糖残基，例如葡萄糖、半乳糖和N-乙酰基-葡糖胺的组合，并可在低聚糖链内的前三个糖亚基中的任意处用至少两个唾液酸残基进行修饰，其中，在低聚糖链中，在DSLNT的情况下，最后的末端糖是葡萄糖，或者在DSLNT衍生物、异构体、类似物和衍生物的情况下，是在此位置的对应糖。
在另一个实例中，DSLNT衍生物可具有四个糖残基，包括葡萄糖，半乳糖和N-乙酰基-葡糖胺的组合（例如，图4），并且可在低聚糖链内的前三个糖亚基中的任意处用至少两个唾液酸残基进行修饰。
在另一个实例中，DSLNT衍生物可具有四个糖残基，包括葡萄糖、果糖、半乳糖和N-乙酰基-葡糖胺的组合，并且可在低聚糖链内的前三个糖亚基中的任意处用至少两个唾液酸残基进行修饰。
在另一个实例中，DSLNT变体、异构体、类似物和衍生物可以具有四个葡萄糖残基，并且可在低聚糖链内的前三个糖亚基中的任意处用至少两个唾液酸残基进行修饰。在另一个实例中，DSLNT衍生物可具有四个果糖残基，并且可以在低聚糖链内的前三个糖亚基中的任意处用至少两个唾液酸残基进行修饰。
在另一个实例中，DSLNT衍生物可具有四个半乳糖残基，并且可以在低聚糖链内的前三个糖亚基中的任意处用至少两个唾液酸残基进行修饰。
在另一个实例中，DSLNT衍生物可具有四个N-乙酰基-葡糖胺残基，并且可以在低聚糖链内的前三个糖亚基中的任意处用至少两个唾液酸残基进行修饰。
在另一个实例中，DSLNT衍生物可以具有三个半乳糖残基，其后接葡萄糖残基，例如Gal-Gal-Gal-Glc，并且在低聚糖链内的前三个糖亚基中的任意处用至少两个唾液酸残基进行修饰。
在另一个实例中，DSLNT衍生物可以具有三个果糖残基，其后接葡萄糖残基，例如，Fru-Fru-Fru-Glc，并且在低聚糖链内的前三个糖亚基中的任意处用至少两个唾液酸残基进行修饰。
尽管衍生物可以具有任何化学上允许的连接键（linkage），以用于形成任何两个糖分子或单糖之间的共价化学键，优选的化学连接键为：Neu5Ac残基以α2-3或α2-6连接键与Gal或GlcNAc残基相连；Fuc残基以α1-2、α1-3或α1-4连接键与Gal、GlcNAc或Glc残基相连；Fru残基以β1-2、α1-2键与Fru、Gal、GlcNAc或Glc相连；GlcNAc残基以β1-3、β1-4或β1-6连接键与Gal残基相连；以及Gal残基以β1-3或β1-4连接键与GlcNAc、Gal或Glc残基相连。还优选，末端糖为葡萄糖残基，优选与二糖乳糖中的半乳糖相连。
此外，可以使用有机和合成化学领域内已知的方法或通过酶促方法，通过使DSLNT与任何其它化学化合物或聚合物共价连接而制造出DSLNT的衍生物。这些衍生物包括但不限于，使DSLNT附着到其它低聚糖、氨基酸、多肽和核酸或使它们共价连接。
此外，可以通过用糖类似物来替代DSLNT内的糖残基，以制造DSLNT变体、异构体、类似物和衍生物。例如，半乳糖可用其类似物进行替代，类似物包括但不限于，2-脱氧-D-半乳糖、2-脱氧-2-氟-D-半乳糖和2-脱氧-2-氨基-D-半乳糖。例如，葡萄糖可用其类似物进行替代，类似物包括但不限于，2-脱氧-D-葡萄糖、2,2-二氟-脱氧-D-葡萄糖、2-脱氧-2-氟-2-碘-D-葡萄糖、1-O-甲基-D-葡萄糖、2-O-甲基-D-葡萄糖、2-脱氧-2-氯-D-葡萄糖、2-脱氧-2-溴-D-葡萄糖、3-O-11C-甲基-D-葡萄糖、6-脱氧-D-葡萄糖、6-脱氧-6-氟-D-葡萄糖和6-脱氧-6-碘-D-葡萄糖以及2-脱氧-2-18F-氟-D-葡萄糖。例如，N-乙酰葡糖胺可以用其类似物替代，类似物为N-乙酰葡糖胺基天冬酰胺、N-乙酰葡糖胺6-硫酸盐、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸盐、N-乙酰葡糖胺6-磷酸盐、甲基-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖苷、N-乙酰葡糖胺醇、N-溴代乙酰葡糖胺、2-乙酰氨基-1,3,6-三-O-乙酰基-4-脱氧-4-氟代吡喃葡萄糖、N-乙酰葡糖胺噻唑啉、N-氟代乙酰基-D-葡糖胺、2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡糖酸-(1,5)-内酯和3-乙酰氨基-3,6-二脱氧葡萄糖。
此外，可以基于手性中心获得DSLNT异构体，取决于C-1位处的羟基相对于环剩余部分的取向，使作为六元环的D-葡萄糖可以以α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖存在。同样地，D-半乳糖、N-乙酰葡糖胺和唾液酸环可以基于相对于环剩余部分的C-1（对于D-半乳糖和N-乙酰葡糖胺而言）位和C-2（对于唾液酸而言）位的羟基以α-构象或β-构象存在。DSLNT的异构体可以基于乙缩醛官能团的α-位或β-位而不同。例如，半乳糖和葡萄糖间的糖苷键可以是α-乙缩醛官能团而非通常出现于DSLNT的乳糖部分的β-乙缩醛官能团。因此，基于六元环的C-1位或C-2位处的羟基取向而存在多种DSLNT异构体。一些DSLNT异构体可包括但不限于，α-Neu5Ac-(2→3)-α-Gal-(1→3)-[α-Neu5Ac-(2→6)]-β-GlcNAc-(1→3)-β-Gal-(1→4)-Glc、α-Neu5Ac-(2→3)-β-Gal-(1→3)-[α-Neu5Ac-(2→6)]-α-GlcNAc-(1→3)-β-Gal-(1→4)-Glc、α-Neu5Ac-(2→3)-β-Gal-(1→3)-[α-Neu5Ac-(2→6)]-β-GlcNAc-(1→3)-α-Gal-(1→4)-Glc、β-Neu5Ac-(2→3)-β-Gal-(1→3)-[α-Neu5Ac-(2→6)]-β-GlcNAc-(1→3)-β-Gal-(1→4)-Glc、或α-Neu5Ac-(2→3)-β-Gal-(1→3)-[β-Neu5Ac-(2→6)]-β-GlcNAc-(1→3)-β-Gal-(1→4)-Glc。
由于唾液酸的修饰会引入羧基（COO-）形式的负电荷，其它单糖也含有羧基并可以代替DSLNT变体、异构体、类似物和衍生物中的唾液酸。这些糖可以是葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、艾杜糖醛酸、3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸、神经氨酸或任何其它含有羧基的单糖或其衍生物。
可以通过能够保留在受试者（例如儿科受试者，包括婴儿、儿童或青少年）中预防或抑制肠病（例如坏死性小肠结肠炎）的生物学活性的取代、修饰和结合来改变DSLNT，从而产生变体、类似物和衍生物，包括其异构体和代谢物。受试者可以是人受试者或动物受试者，包括猴、大鼠、小鼠、狗、猫、猪、山羊、绵羊、马或牛。
如本文所用的，合适量的DSLNT（或其变体、异构体、类似物和衍生物）是指足以抑制肠病的量。合适量的实例包括但不限于，约至少30μM、至少300μΜ、至少600μΜ、至少800μΜ、高于800μΜ、在约10μM～10,000μM、约600～1500μM或约500～800μM范围内的量，可以制备出含有约至少38.7mg/L、至少387mg/L、在每升约12.9mg～12.9g、约774mg/L～1,935mg/L、约645mg/L～1,032mg/L或约200～500mg/L的DSLNT或其衍生物的活性成分（本发明的DSLNT）且余量由无毒性载体构成的剂型或组合物。在一些实施方式中，这些量或范围可以变动约10%。在其它实施方式中，量或范围可以变动约20%。在其它实施方式中，这些量或范围可以变动约25%。用于制备这些组合物的方法是本领域内技术人员已知的。
在一个实施方式中，本发明的制剂包含约387mg/L（～300μM）的本发明DSLNT。
本发明的制剂优选包含其它组分，例如维生素和/或矿物质，优选根据婴儿配方的国际指令。
制剂中本发明DSLNT的浓度将取决于本发明DSLNT的吸收、失活和***速率、给药日程、给药量以及本领域技术人员已知的其它因素。本发明DSLNT的浓度在给药时对于递送可治疗、预防或改善待治疗疾病或障碍的一种或多种症状的量是有效的。
在制剂中，本发明的DSLNT也可与其它哺乳动物蛋白或植物蛋白混合。例如，哺乳动物蛋白包括哺乳动物奶中的蛋白（例如，哺乳动物全奶或分馏奶的完整或部分蛋白水解物）。植物蛋白包括豌豆、大豆、杏仁和/或大米蛋白的完整蛋白或蛋白水解物。在制剂中，重量分数的本发明DSLNT可以以有效浓度溶解、混悬、分散或者以其它方式混合在所选载体中，从而缓解、预防所治疗的病症或改善一种或多种症状。
在一个实施方式中，本发明的制剂是肠制剂。本发明的肠制剂可以表现为婴儿配方、母乳、水、果汁或幼儿食品。此外，本发明的肠制剂可以表现为营养补充剂。
在本发明的制剂中，DSLNT也可与其它哺乳动物蛋白或植物蛋白相混合。例如，哺乳动物蛋白包括哺乳动物奶中的蛋白，例如，哺乳动物全奶或分馏奶的完整或部分蛋白水解物。植物蛋白包括豌豆、大豆、杏仁和/或大米蛋白的完整蛋白或蛋白水解物。
在又一个实施方式中，可以将本发明的制剂添加到任何消耗型液体中。液体包括但不限于，水或果汁。
在另一个实施方式中，使用本发明的制剂，通过DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物来补充或增强母体自身的***或人供体***（人奶强化剂）。巴氏消毒的市售人供体***可从Prolacta Bioscience（Monrovia,CA）获得，名称为Prolact+H2MF比如
Figure BDA00003620776700111
Figure BDA00003620776700112
母乳的强化可在事先知晓或不知晓母乳的DSLNT含量的情况下进行，并且在母体自身的***或供体***中DSLNT水平低的情况下确保母乳强化。
本发明还提供包含分离的DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体以及药学上可接受的赋形剂或媒介物的药物制剂（也称为药物组合物或剂型）。
在一个实施方式中，本发明的制剂包含分离的DSLNT或其变体、异构体、类似物和衍生物以及药学可接受的赋形剂。
在另一个实施方式中，本发明的制剂由分离的DSLNT或其变体、异构体、类似物和衍生物以及药学可接受的赋形剂组成。
在另一个实施方式中，本发明的制剂包含分离的DSLNT或其变体、异构体、类似物和衍生物以及药学可接受的赋形剂但基本上没有其它低聚糖（例如，非DSLNT的低聚糖）。
药学上可接受的赋形剂或媒介物是指无毒性的固体、半固体（在本文中也提及为软胶囊）或液体填料、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。
此外，本发明的分离的DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体可被聚乙二醇化、磷酸化、酯化、用氨基酸和/或肽衍生化，以提高用于配制和生物利用度的溶解度。
本发明的分离的DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体可以与药学上可接受的赋形剂相混合。赋形剂的实例包括但不限于，粘合剂、稀释剂、佐剂、或媒介物，如保藏剂、填料、聚合物、崩解剂、助流剂、润湿剂、乳化剂、混悬剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、润滑剂、酸化剂、着色剂、染料、防腐剂和分散剂、或类似性质的化合物，根据给药模式和剂型的性质而不同。这些成分，包括可用于配制口服剂型的药学上可接受的载体和赋形剂，在Handbook ofPharmaceutical Excipients,American Pharmaceutical Association(1986)中有过记载，其通过引用的方式整体并入本文。
药学上可接受的赋形剂通常在所采用的剂量和浓度下对受体是无毒的并且可与制剂的其它成分相容。药学上可接受的赋形剂的实例包括，水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、乙醇、多元醇、植物油、脂肪、油酸乙酯、脂质体、蜡、聚合物（包括凝胶形成和非凝胶形成聚合物）、以及它们的适当混合物。载体可含有少量的添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质。这些材料在所采用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其它有机酸或其盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量（少于约10个残基）的多肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；反离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，如聚山梨酯、泊洛沙姆或PEG。优选载体是肠胃外载体，更优选与受体血液等渗的溶液。
粘合剂的实例包括但不限于，微晶纤维素和纤维素衍生物、黄蓍胶、葡萄糖溶液、***胶浆、明胶溶液、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、交聚维酮、蔗糖和淀粉糊。
稀释剂的实例包括但不限于，乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露醇和磷酸氢钙。
赋形剂的实例包括但不限于，淀粉、表面活性剂、亲脂性媒介物、疏水性媒介物、预胶化淀粉、Avicel、乳糖、奶糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和色淀共混紫（lake blend purple）。用于如软胶囊剂型的典型赋形剂包括，胶囊用明胶，和油比如大豆油、米糠油、芥花油、橄榄油、玉米油和其它类似的油；作为表面活性剂和吸收促进剂的甘油、聚乙二醇液体、维生素E TPGS（Softgels:Manufacturing Considerations;Wilkinson P,Foo Sog Hom,Special Drug Delivery Systems;Drugs and thePharmaceutical Sciences Vol41Praveen Tyle Editor,Marcel Dekker1990,409-449;Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery by Ansel,Popovich and Allen1995,Williams and Wilkins,Chapter5pp155-225）。
崩解剂的实例包括但不限于，复合硅酸盐、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基纤维素。
助流剂的实例包括但不限于，胶态二氧化硅、滑石、玉米淀粉。
润湿剂的实例包括但不限于，丙二醇单硬脂酸酯、失水山梨醇单油酸酯、二甘醇月桂酸酯和月桂醇聚氧乙烯醚。
甜味剂的实例包括但不限于，蔗糖、乳糖、甘露醇和比如糖精的人工甜味剂以及任意数量的喷雾干燥调味料。
调味剂的实例包括但不限于，从植物比如果实中提取的天然调味料和产生怡人感觉的合成化合物共混物（例如，但不限于薄荷和水杨酸甲酯）。
润滑剂的实例包括硬脂酸镁或硬脂酸钙、月桂基硫酸钠、滑石、淀粉、石松子和硬脂酸以及高分子量的聚乙二醇。
着色剂的实例包括但不限于，批准认证的水溶性FD染料和C染料、其混合物；以及悬浮于氧化铝水合物中的水不溶性FD染料和C染料中的任一种。
本领域的普通技术人员将认识到，除活性作用剂（本发明的DSLNT）外，可以在本发明的制剂中可使用多种不同的成分，同时保持制剂在治疗肠病例如NEC中的效力。本文提供的列举不是穷举的。
本发明的制剂可以经口给药（例如，以溶剂内的液体形式比如水性或非水性的液体、或在固体载体内的液体形式）、经直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、***内给药、腹膜内给药、局部给药（通过粉剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、滴剂、透皮贴剂或经皮贴剂）、口腔给药（经支气管形式或作为口腔喷剂或鼻喷剂）。本文所用的术语“肠胃外”是指给药模式，包括静脉内（例如，在右旋糖或盐溶液内）、肌内、胸骨内、皮下、皮内、滑膜内、鞘内、骨膜、脑室内、关节内注射和/或输注。可以每日、每周、每月、每隔一月、每季度或按任何其它给药日程以单剂量注射或输注、以多剂量、或以连续剂型进行给药。本发明制剂对受试者的给药可以是间歇性的，或者处于渐进、连续、恒定或受控的速率。此外，一天中给药剂型的时间和每日给药次数可以不同。
化合物的适当剂量将为，有效预防肠病发生的量。“有效量”、“治疗量”或“有效剂量”是指，足以引发所期望的药理效果或治疗效果的量，从而实现对障碍或病症的有效预防或治疗。
本发明的分离的DSLNT或其变体、异构体、类似物和衍生物也可以配制成合适的药物制剂，如用于经口给药的溶液、混悬剂、片剂、分散片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂或酏剂。
口服制剂可以是固体、凝胶或液体。固体剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂和整装粉剂。液体制剂可以例如通过在载体比如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等中溶解、分散、或以其它方式混合如上定义的本发明的分离DSLNT和药物佐剂进行制备，从而形成溶液或悬浮液。如果需要的话，待施用的本发明制剂也可含有少量的无毒辅助物质，如湿润剂、乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂等等，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯（盐）和其它这类作用剂。
在某些实施方式中，制剂是固体剂型，在一个实施方式中是胶囊剂或片剂。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含一种或多种的以下成分或类似性质的化合物：粘合剂；润滑剂；稀释剂；助流剂；崩解剂；着色剂；甜味剂；调味剂；润湿剂；催吐剂包衣；和薄膜包衣。粘合剂的实例包括微晶纤维素、黄蓍胶、葡萄糖溶液、***胶浆、明胶溶液、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、交聚维酮、蔗糖和淀粉糊。润滑剂包括滑石、淀粉、硬脂酸镁或硬脂酸钙、石松子和硬脂酸。稀释剂包括，例如乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐和甘露醇以及磷酸氢钙。
助流剂包括但不限于，胶态二氧化硅。崩解剂包括交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基纤维素。着色剂包括，例如，批准认证的水溶性FD染料和C染料、其混合物；以及悬浮于氧化铝水合物中的水不溶性FD染料和C染料中的任一种。甜味剂包括蔗糖、乳糖、甘露醇和比如糖精的人工甜味剂，以及任意数量的喷雾干燥调味料。
调味剂包括从植物如果实中提取的天然调味料和产生怡人感觉的合成化合物共混物，例如，但不限于，薄荷和水杨酸甲酯。润湿剂包括丙二醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、二甘醇单硬脂酸酯和月桂醇聚氧乙烯醚。催吐剂包衣包括脂肪酸、脂肪、蜡、虫漆、氨化虫漆和邻苯二甲酸醋酸纤维素。薄膜包衣包括羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇4000和邻苯二甲酸醋酸纤维素。
当剂量单位型是胶囊时，除上述类型的材料外，还可包含液体载体比如脂肪油。另外，剂量单位型可包含改变剂量单位的物理形式的各种其它材料，例如糖衣和其它肠内吸收剂。化合物还可以作为酏剂、混悬剂、糖浆、薄片剂、喷洒剂（sprinkle）、口香糖等中的组分进行给药。除活性化合物外，糖浆还可包含作为甜味剂的蔗糖以及某些防腐剂、染料、着色剂和调味料。
活性材料，即本发明的分离的DSLNT，也可以与其它哺乳动物蛋白或植物蛋白相混合。例如，哺乳动物蛋白包括哺乳动物奶中的蛋白（例如，哺乳动物全奶或分馏奶的完整或部分蛋白水解物）。植物蛋白包括豌豆、大豆、杏仁和/或大米蛋白的完整蛋白或蛋白水解物。
防腐剂的实例包括甘油、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠和醇。乳剂中所用的非水性液体的实例包括矿物油和棉籽油。乳化剂的实例包括明胶、***树胶、黄蓍胶、膨润土以及表面活性剂如聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯。混悬剂包括羧甲基纤维素钠、果胶、黄蓍胶、Veegum硅酸铝镁和***树胶。甜味剂包括蔗糖、糖浆、甘油和人工甜味剂如糖精。润湿剂包括丙二醇单硬脂酸酯、失水山梨醇单油酸酯、二甘醇月桂酸酯和月桂醇聚氧乙烯醚。有机酸包括柠檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氢钠和碳酸钠。着色剂包括任一种的批准认证的水溶性FD染料和C染料及其混合物。调味剂包括从植物如果实中提取的天然调味料和产生怡人味觉的合成化合物共混物。
对于固体剂型，在例如碳酸丙烯酯、植物油或甘油三酯中的溶液或悬浮液，在一个实施方式中被包封在明胶胶囊中。此类溶液及其制备和包封在本领域内是众所周知的。对于液体剂型，例如在聚乙二醇中的溶液，可以用足量的药学上可接受的液体载体如水进行稀释，使其能容易地计量给药。
或者，液体或半固体口服制剂的制备可以通过将活性化合物或盐溶解或分散在植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯（例如碳酸丙烯酯）以及其它此类载体中，并将这些溶液或悬浮液包封在硬的明胶胶囊壳或软的明胶胶囊壳中。
本文感兴趣的还有粉剂，可被重构（reconstitute）成溶液、乳剂和其它混合物以进行给药。它们也可被重构和配制成固体或凝胶。
分离的DSLNT可以作为益生元通过其作用来降低NEC的风险，促进有益菌比如双歧杆菌（Bifidobacteria）和乳酸杆菌（Lactobacilli）的生长，同时降低引起肠病的病原菌的负载。这样，分离的DSLNT及其变体、异构体、类似物和衍生物可以作为益生元，其选择性地刺激宿主胃肠道内的一种或多种细菌种类的生长或群落化，且这些细菌的存在对宿主健康是有益的。
作为益生元，分离的DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体可以与益生菌一起进行给药，其中益生菌可以是活的或死的微生物，在足量施用时对宿主赋予健康益处。被认为对其宿主具有健康益处的微生物包括但不限于，属于双歧杆菌属和乳酸杆菌属的那些。尽管益生菌可以是活或死的微生物，通常优选为作为益生菌而被受试者摄取的活的微生物。益生菌可以呈现多种不同的形式，比如粉末、冻干细胞、条状物、液体培养物、浓缩的液体培养物、糊状物、酸奶或其组合。肠内给药或液体供给是将益生菌连同DSLNT及其衍生物、异构体、类似物和变体引入新生儿的优选途径。
如下文所述的，粉末、液体或条状物形式的益生素可包含在营养配方中。组合物可包含任意量的双歧杆菌和/或乳酸杆菌益生菌，在与本公开的益生元共同对个体进行肠内施用时可有效治疗和/或预防NEC或肠病。通常，组合物将包含足量的益生菌，从而在组合物摄取时向个体提供，比如约106菌落形成单位（cfu）至约1012菌落形成单位（cfu）、或约106cfu～约1010cfu、或约108cfu～约1012cfu、或约108cfu～约1010cfu的益生菌的每日剂量。在一些实施方式中，组合物将包含足以在组合物摄取时向个体提供约106cfu、或约107cfu、或约108cfu、或约109cfu、或约1010cfu、或约1011cfu或约1012cfu的每日剂量的益生菌。
在营养配方中，营养配方可以包含：1）DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体，以及2）相对于每克营养配方干重为约104cfu～约1010cfu的益生微生物、或相对于每克营养配方干重为约104cfu～约109cfu、或相对于每克营养配方干重为约104cfu～约108cfu的益生菌、或相对于每克营养配方干重为约104cfu～约107cfu的益生菌、或相对于每克营养配方干重为约104cfu～约106cfu的益生菌、或相对于每克营养配方干重为约104cfu～约105cfu的益生菌。在另一个实施方式中，营养配方可以包含，相对于每克营养配方干重为约106cfu～约108cfu的益生菌、或相对于每克营养配方干重为约106cfu～约107cfu的益生菌。在另一个实施方式中，营养配方可以包含，相对于每克营养配方干重为约104cfu的益生菌、或相对于每克营养配方干重为约105cfu的益生菌、或相对于每克营养配方干重为约106cfu的益生菌、或相对于每克营养配方干重为约107cfu的益生菌、或相对于每克营养配方干重为约108cfu的益生菌、或相对于每克营养配方干重为约109cfu的益生菌、或相对于每克营养配方干重为约1010cfu的益生菌。
可以使用本领域技术人员已知的任意数量的来源和方法来获得本发明的DSLNT。或者，可以使用分别在正向或逆向反应中参与本发明DSLNT的生物合成或分解代谢的所分离低聚糖生物合成酶或分解酶，通过酶促方法合成本发明的DSLNT；或者，可以通过使用不同的生物合成酶或分解酶以及期望糖类似物来替代关键的酶步骤，以获得期望的低聚糖，从而得到DSLNT衍生物、类似物和变体。本发明的DSLNT也可以通过化学方法合成并纯化以获得期望的化合物。
益生元和益生菌的结合组合物可以是粉末或液体形式，和/或可以被包含在营养配方或婴儿配方中。组合物可以包含任意量的益生元DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体，其与益生菌比如双歧杆菌属和/或乳酸杆菌属的菌种相结合地经肠施用至个体时，可有效治疗和/或预防NEC或肠病。
当益生元DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体与益生菌比如双歧杆菌属和/或乳酸杆菌属的菌种的组合被制备成营养配方或婴儿配方时，营养配方或婴儿配方可以包含：相对于每100克营养物为约0.35克的益生元～相对于每100克营养物为约9.2克的益生元、或相对于每100克营养物为约1.5克的益生元～相对于每100克营养物为约7.0克的益生元、或相对于每100克营养物为约1.5克的益生元～相对于每100克营养物为约6.0克的益生元。并且优选相对于每100克营养物为约3.0克的益生元～相对于约100克营养物为约6.0克的益生元。
在一个实施方式中，可以将DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体作为益生元向受试者或患者施用，以刺激胃肠道中的双歧杆菌和乳酸杆菌的群落化或生长并减少病原体的存在。
在另一个实施方式中，可将DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体连同益生菌比如双歧杆菌和乳酸杆菌向受试者或患者施用，以帮助建立健康的胃肠道微生物菌丛。
II.本发明的方法
本发明还提供通过在受试者中以足以预防或治疗肠病和/或炎症的量施用分离的二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）或其变体、异构体、类似物和衍生物，从而预防或治疗患有肠病和/或炎症的受试者的方法。
肠病和炎性疾病的实例包括但不限于，坏死性小肠结肠炎（NEC）、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、***、未定型结肠炎、微小性结肠炎、结肠袋炎（pouchitis）、伪膜性肠炎、缺血性结肠炎、憩室炎、炎症性肠病、阑尾炎和肠易激综合征。
短语“治疗”是指使得疾病或障碍的一种或多种症状改善或以其它方式有益地改变的任何方式，不管是永久性的或是临时性的方式，其可以归因于本文制剂的施用或与本文制剂的施用相关。该术语涵盖任何药学用途，包括预防性用途，其中以永久性或是临时性的方式预防、延缓或减轻疾病或障碍的一种或多种症状的发展，其可归因于本发明制剂的施用或与本文制剂的施用相关。
受试者可以是人或动物受试者，包括猴、大鼠、小鼠、狗、猫、猪、山羊、绵羊、马或牛。优选地，受试者是儿科受试者，包括婴儿、儿童和青少年。受试者可以罹患腹泻、小肠炎、结肠炎、痉挛、腹痛、水肿、溃疡、胃炎、肠病、消化***疾病或炎症性肠病。在一个实施方式中，肠病是传染病。在另一个实施方式中，肠病是坏死性小肠结肠炎（NEC）。
根据本发明的实施，本发明的配方可以是经口服用的液体配方（例如，婴儿配方）、或固体或半固体配方（例如，幼儿食品或营养补充剂）。然而，其它给药途径也是可行的，并且被本发明涵盖。
此外，本发明的DSLNT也可通过动物饲料、动物饲料补充剂或动物营养补充剂的方式进行施用。
本发明还提供鉴别母乳喂养的婴儿是否处于患上坏死性小肠结肠炎（NEC）的风险的方法。在一个实施方式中，该方法包括测定母乳中DSLNT的浓度，低水平的DSLNT预示着母乳喂养的婴儿处于患上NEC的风险。仅作为实例，可通过测量母乳中DSLNT的浓度和每日DSLNT摄入的总量，并将这些值与新生儿的NEC发生率进行比较，从而确定低水平的DSLNT。
III.试剂盒
根据本发明的另一方面，提供试剂盒。根据本发明的试剂盒包含含有本发明制剂的包装。
短语“包装”是指包含本文所呈现的化合物或组合物的任何容器。在优选的实施方式中，包装可以是盒或包装材料。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员所熟知。药物包装材料的实例包括，但不限于，泡罩包、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适合于所选制剂和预期的给药和治疗模式的任何包装材料。
试剂盒也可包含不含在包装内而是附着在包装外部的物件，比如吸液器。
试剂盒可以任意地包含用于向具有需要治疗的症状的受试者施用本发明制剂的说明书。试剂盒还可包含对于由管理机构例如美国食品和药物管理局批准的本文化合物用途的说明书。试剂盒可以任意地含有用于本发明化合物的标签或产品插页。包装和/或任何产品插页自身可以是经管理机构批准的。试剂盒可以在包装中包含在固相或液相（比如提供的缓冲剂）中的化合物。试剂盒还可以包含制备实施方法时所用的液体的缓冲剂，以及用于将液体从一个容器转移到另一容器的移液器。
在另一个实施方式中，本发明提供含有可用于治疗肠病（例如NEC）的本发明DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体的试剂盒（即，试剂和说明书的打包组合）。
试剂盒可以包含本发明的制剂，本发明的制剂包含一种或多种可有效治疗肠病的本发明药物以及可接受的载体或佐剂（例如，药学上可接受的缓冲剂，比如磷酸缓冲盐水、林格式溶液或右旋糖溶液）。
试剂盒还可包含在商业和用户立场上所期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插页。
作用剂可提供为干粉，通常是冻干干粉，包含溶解时将提供具有合适浓度的试剂溶液的赋形剂。
试剂盒包含具有标签和/或说明书的一个或多个容器。标签可以提供用于实施DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体的制备（例如溶解干粉）和/或治疗例如肠病（例如NEC）的指南。
标签和/或说明书可以指明本发明制剂的体内用途的说明。标签和/或说明书可以表明，本发明的制剂可以单独使用或与另一作用剂组合使用，以治疗比如肠病（例如NEC）。
标签可以指明如上所述的本发明DSLNT和/或其衍生物、异构体、类似物和/或变体的合适剂量。
合适的容器包括，例如瓶、小瓶和试管。容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。容器可具有无菌的接入口（例如，容器可以是具有可被针比如皮下注射针刺穿的阻塞物的静脉溶液袋或小瓶）。
提供以下实施例以进一步说明本发明的各方面。这些实施例是非限制性的，不应被理解为限制本发明的任何方面。
实施例
实施例1
人乳低聚糖（HMO）预防新生大鼠中的NEC
除乳糖外，一升的成熟人乳包含5～15g的未结合低聚糖，这与乳蛋白总量相近，并超过乳脂的量。图1显示，HMO是异质性低聚糖组，这些低聚糖根据相对于每HMO分子的唾液酸数量的不同而具有不同电荷，并且根据聚乳糖胺骨架的长度不同而具有不同尺寸。已经鉴定出多于150种的不同HMO。相比之下，婴儿配方含有低很多的量的低聚糖，这些低聚糖在结构上也更为不复杂。为弥补HMO的缺乏，现在经常对配方补充低聚半乳糖（GOS），GOS部分地模仿HMO的益生元效果。然而，如图1所示，GOS在结构上与HMO非常不同，并且可能还不能模拟出HMO的更加结构特异性的效果。
尽管已经假设HMO对NEC的有益效果，HMO的有限可得性使得对人早产儿的受控和统计上有力的干预研究难以实施。作为代替，我们在用新生Sprague-Dawley大鼠良好确立的NEC模型中对HMO进行测试。我们通过催产素对足月的孕大鼠引产，并将其仔鼠随机分到不同的干预组。一些仔鼠与母鼠留在一起，用作母乳喂养对照；其它仔鼠通过每日两次的经口填喂进行配方喂养。将所有仔鼠暴露于低氧，每天三次。在出生第4天，我们处死仔鼠并对其肠进行宏观和微观的NEC标志分析。将回肠制备为用于H&E染色，并由三名独立的研究者进行盲评，以确定NEC病理得分。尽管所有母乳喂养的仔鼠一直存活到第4天，配方喂养仔鼠的存活率下降到72%（图2A）。平行地，NEC病理得分显著增加（图2B）。随后，我们从汇集的人乳中分离HMO，并将其添加到配方中。存活率和病理得分显著改善，并且与母乳喂养的对照相近。这些结果首次显示出，在动物模型中HMO确实预防NEC。添加GOS对存活和病理得分没有影响，意味着HMO的有益效果本质上可能不单纯地是益生元，而是更加结构特异性的。
一种特定的HMO预防新生鼠中的NEC
HMO是结构上异质的低聚糖组，这引起的问题是，是否所有HMO均在预防NEC中具有类似效果、或有益效果是否基于独特的结构特征。我们通过二维多糖色谱来分离汇集的HMO，并测试级分和亚级分是否减少大鼠中的NEC。
在第一维度，我们使用阴离子交换色谱（QAE），基于相对于每个HMO分子的唾液酸数目，通过电荷来分离HMO。没有唾液酸的中性级分略微降低NEC病理得分（图3A）。相比于母乳喂养的对照，包含所有唾液酸化HMO中的约90%的单唾液酸化HMO（-1）没有效果，但是二唾液酸化HMO（-2）显著降低得分。三唾液酸化HMO（-3）和四唾液酸化HMO（-4）没有效力，可能是因为它们的丰度极低。我们对荧光标记的HMO使用HPLC-FL，显示出，二唾液酸化HMO仅含有四种主要的低聚糖（图3B）。其中之一（#1）被鉴别为少量的单唾液酸化HMO的溢出，我们将其弃掉。
在第二维度，我们使用FPLC体积排阻色谱，按尺寸进一步分离二唾液酸化HMO级分（图3C）。我们能够将HMO#2与HMO#3和HMO#4分离开。HMO#3和HMO#4并不预防NEC（图3D）。然而，HMO#2显著地降低NEC病理得分。
在各种浓度下对各个HMO级分和亚级分进行测试，这些浓度基于其在10mg/mL（即成熟人乳中的平均浓度）的汇集HMO中的相对丰度。假设汇集HMO的平均分子量为1,000g/mol，10mg/mL等同于10mM。防治性HMO#2的相对丰度为～3%，其对应于300μM，在之前所报道的生物活性多糖的范围内。总而言之，我们鉴定出一种在生物学相关浓度下在新生大鼠模型中预防NEC的特定HMO。接下来，我们要解析这种特定HMO的结构组成。
多糖结构解析鉴定出DSLNT为防治性HMO
我们与UC San Diego Glycotechnology Core合作来解析防治性HMO#2的单糖组成、序列和糖苷键。MALDI-TOF-MS分析表明，存在三个己糖、一个己糖胺以及预期中的两个唾液酸。使用连接键特异性的外切糖苷酶的按序消化以及对全甲基化衍生物的GC-MS分析表明，乳-N-四糖（Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）是骨架（图4），其中一个唾液酸α2-3-连接到末端Gal且另一个唾液酸α2-6-连接到亚末端的GlcNAc。我们的方法明确地鉴定出，HMO#2是二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）的特定异构体。
实施例2
材料和方法
汇集HMO的分离
在经过大学伦理审查委员会的批准之后，从加利福尼亚大学圣地亚哥医学中心（San Diego,California,USA）招募的12名健康的早产儿志愿者中获得人乳。离心后，去除脂质层，并通过添加冰冷乙醇随后进行离心，从水相中沉淀出蛋白。通过旋转蒸发从含有HMO的上清液中去除乙醇。通过凝胶过滤色谱经BioRad P2柱（100cm×16mm,Bio-Rad,Hercules,California,USA）使用半自动快速蛋白液相色谱（FPLC）***除去乳糖和盐。GOS糖浆（Vivinal，干物质75%）由Friesland Campina Domo（Amersfoort,The Netherlands）提供。二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）购自于Dextra（Reading,UK）。
通过二维色谱的HMO分级
使用阴离子交换色谱经QAE重力柱（Sigma Aldrich,St.Louis,Missouri,USA）按电荷分离汇集的HMO。将冻干的汇集HMO溶解于2mM Tris中并施加到平衡柱。分别用含有0、20、70、100和400mMNaCl的2mM Tris来洗脱中性HMO、-1、-2、-3和-4带电HMO。通过凝胶过滤色谱经P2柱去除Tris和NaCl。如下所述通过荧光高效液相色谱（HPLC-FL）来监测分离。使用P2凝胶过滤色谱（100cm×16mm）按尺寸来进一步分离带不同电荷的HMO级分并通过HPLC-FL进行监测。将含有相同HMO且没有其它HMO的级分汇集并冻干。
通过HPLC的低聚糖图谱化
HMO和GOS用2-氨基苯甲酰胺（2AB）进行荧光标记并使用50mM甲酸铵/乙腈缓冲***通过HPLC在氨基-80柱（4.6mm ID×25cm，5μm，Tosoh Bioscience，Tokyo，Japan）上分离。在360nm激发和425nm发射下，通过荧光检测器监测分离。峰注解基于在装备有Nano-ESI-源的Thermo LCQ Duo离子阱质谱仪上的标准保留时间和质谱（MS）分析。
通过MALDI-TOF质谱仪的HMO分析
收集2AB标记的HMO峰物质，干燥并以1:1的比例与超级-DHB基质混合，并在MALDI板上点样以进行分析。以正离子模式获取谱图。通过按序的外切糖苷酶消化的HMO分析
连接键混杂性神经氨酸酶（α2-3>6,8,9；产脲节杆菌（Arthrobacterureafaciens））购自Sigma Aldrich（St.Louis,Missouri,USA）；α2-3-特异的神经氨酸酶（伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium））、β1-3半乳糖苷酶（木薯萎蔫病黄单胞菌（Xanthomonas manihotis））、β1-4半乳糖苷酶（脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis））和β-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶（GlcNAcase,木薯萎蔫病黄单胞菌）从New England Biolabs（Ipswich,Massachusetts,USA）获得。所有酶都以制造商操作指南中的浓度和孵育时间使用。
通过气相色谱质谱（GC-MS）的HMO连接键分析
将未知的HMO2溶解在二甲亚砜中并通过相继添加氢氧化钠和碘甲烷而进行全-O-甲基化（par-O-methylated）。加入氯仿并通过添加水来终止反应。提取氯仿层中的甲基化多糖，将其干燥并在100℃下用4N的三氟乙酸水解6h。在干燥氮吹扫下用50%异丙醇：水去除酸。水解样品经1M氢氧化铵中的硼氢化钠还原过夜。通过30%乙酸中和过量的硼氢化物，并且硼酸作为硼酸甲酯被去除。在100℃下用1:1乙酸酐：吡啶处理样品1h。通过氮吹扫来去除吡啶和乙酸酐。部分甲基化的糖醇乙酸酯用二氯甲烷提取，使用DB-5毛细管柱经GC-MS分析，并通过所确立保留时间和质谱裂解图谱的组合进行鉴定。
新生大鼠中NEC的诱导和评价
新生大鼠中的NEC模型最早由Barlow等人（Surgery1975;77:687-90）记载，后来被修改（Nadler EP,Dickinson E,Knisely A,等人,J Surg Res2000;92:71-7）。简单来说，足月时使用催产素Pitocin（每个动物1-2U）对记录怀孕时间的Sprague-Dawley大鼠进行引产。紧接在出生后，将新生仔随机分到不同研究组之一中。母鼠喂养（DF）组的动物仍与母鼠一起。所有其它动物都与母鼠分开，笼养在温度和湿度受控的孵育器中，并用特殊的啮齿动物配方（0.2ml）经口填胃，每天两次。配方与大鼠母乳的蛋白和卡路里含量相近，由溶于75mlEsbilac犬科代乳品（Pet-Ag,Hampshire,Illinois,USA）中的15g Similac60/40（Ross Pediatrics,Columbus,Ohio,USA）组成。将母鼠喂养和填喂的所有动物在模块化室中暴露于低氧（5%O2，95%N2）10分钟，每天三次。将所有动物在产后96h处死；收集它们的肠并检查总的坏死型改变或肠壁囊样积气症的存在。根据操作指南准备0.5cm的末端回肠切片用于H&E染色，并由三名研究者基于形态学改变（包括上皮脱落、绒毛水肿、中性粒细胞浸润、绒毛肠细胞的凋亡、隐窝增生和上皮细胞中的错位核（misaligned nuclei））进行盲评。如果观察到至少一个病理标志，则根据严重度指派0.5～1.5的得分。共同两个或三个标志得到2～3的得分。在上皮完全闭塞（有或没有肠穿孔）的情况下给出最高得分4。对于每个动物进行病理得分的绘图并计算每组的平均值。在至少两套独立的实验中对各个干预进行测试，每个干预组总共有8～26只动物。通过单因素方差分析，用Kruskal-Wallis检验和Dunn’s多重比较试验，计算组间的差异。显著性定义为p<0.05。
结果
汇集HMO而非GOS改善新生大鼠中的存活并减少NEC
本研究的主要目的是评价HMO是否影响新生大鼠中的NEC。因此，我们将出生时的大鼠仔鼠随机分到不同的研究组中。第一组在整个研究期间与母鼠呆在一起（母鼠喂养，DF），但与所有其它组一起每天三次地暴露于低氧。第二组用不含HMO的配方喂养（配方喂养，FF）。第三组用补充有10mg/ml HMO（成熟人乳中的平均HMO浓度）的配方喂养（FF+HMO）。第四组用补充有8mg/ml GOS（与具有益生元的婴儿配方中的GOS浓度相当）的配方喂养（FF+GOS）。对于分离的汇集HMO的HPLC-FL分析显示，2’-岩藻糖基乳糖（2’FL）、乳-N-岩藻五糖1（LNFP1）和乳-N-四糖（LNT）是主要的低聚糖（图5A，5B）。此外，汇集HMO含有一些复合物，岩藻糖基化和/或唾液酸化的低聚糖。相比之下并正如所料，GOS的HPLC-FL谱看起来显著不同（图5C），并主要含有是三塘和四糖，几乎没有任何复合多糖。
与得自相同的新生大鼠模型27-29的公开数据相当，所有DF仔鼠，而仅有26只FF仔鼠中的19只（73.1%）在产后第一个96h内存活（图6A）（Nadler EP,Dickinson E,Knisely A等人.J Surg Res2000;92:71-7;Upperman JS,Potoka D,Grishin A等人.Semin Pediatr Surg2005;14:159-66;Guner YS,Franklin AL,Chokshi NK等人.Lab Invest2011;91:1668-79）。最有趣的是，HMO的添加极大地改善存活率（20只仔鼠中有19只，95.0%）。然而GOS没有效果（17只仔鼠中有13只，76.5%）。
DF仔鼠比FF仔鼠增重更快，但HMO或GOS的添加并不改善增重，意味着存活率改善独立于体重增加。产后96h的宏观评价显示，大多数FF和FF+GOS仔鼠的肠更暗沉，具有片状坏死和肠出血以及肠壁内气囊肿（肠壁囊样积气症）的迹象，这些是NEC的特征性标志（图6B），在所有DF和大多数FF+HMO仔鼠的肠内并没有这些。对H&E染色的回肠切片的微观评价已证实宏观评测（图6C）。大多数DF和FF+HMO仔鼠的回肠显示出正常健康的微观结构，而FF和FF+GOS仔鼠的一些切片显示出完全的破坏。平均病理得分（±SD）在DF组中为0.15±0.34，而在FF组中显著增加到1.98±1.11（p<0.001）（图6D）。接受HMO（10mg/ml）和配方的仔鼠具有0.44±0.30的平均病理得分，显著低于FF组（p<0.001），在统计学上与DF组并没有不同。接受浓度低10倍的HMO（1mg/ml）的仔鼠具有0.64±0.54的平均病理得分，仍然显著低于FF组（p<0.001），但略高于DF对照（p<0.05）。GOS对病理得分没有影响（1.69±0.90）。这些结果首次证明，从人乳中分离出的低聚糖在新生大鼠疾病模型中改善存活率并降低NEC。
需要在产后第一个24h暴露于HMO，但不足以降低NEC
为评测HMO是否需要出现在所有防治性喂养中，我们在第一个24h用不含HMO的配方喂养一组仔鼠，然后在余下的72h换成补充有HMO的配方（图7）。让我们惊讶的是，病理得分（1.72±1.06）与研究全程接受无补充配方的仔鼠（1.97±1.15）并无差别。另一组仔鼠在第一个24h接受具有HMO的配方，并在余下的72h接受无HMO的配方。同样，病理得分（2.04±0.80）与全程接受无补充配方的组并无差别。归结起来，这些结果表明，需要在产后第一个24h暴露于HMO，但不足以免受NEC。
单独的二唾液酸化HMO降低NEC
由于迄今已鉴定出多于150种结构不同的HMO，我们想要知道是否所有的HMO都是防治性的，或者效果是否依赖于特定的结构表位。首先，我们使用阴离子交换色谱，基于单个HMO上唾液酸部分的数量，按电荷来分离汇集HMO。如HPLC-FL所证实的，我们得到五种不同的含有低聚糖的HMO级分，这些低聚糖分别含有零、一、二、三或四个唾液酸并且净电荷分别为0、-1、-2、-3或-4。我们随后在大鼠模型中，以各自在10mg/ml的汇集HMO中的浓度，对这些级分进行测试（图8A）。向配方中添加中性（0）HMO级分使得病理得分降低到1.18±0.50（p<0.05）。-1、-3和-4的带电HMO级分并没有效果，而-2带电级分使病理得分下降到0.44±0.42，这明显与FF组不同（p<0.001），但与DF对照并无差别。这些结果显示，不是所有的HMO都是防治性的，并且效果依赖于两个唾液酸的存在。
我们通过HPLC-FL对-2带电HMO级分进行分析，并检测到四个不同的峰（图8B），我们收集这四个峰并通过MALDI-TOF-MS进行分析（图8C）。峰1的m/z值对应于2AB标记的含三个己糖、一个N-乙酰基-己糖胺和一个N-乙酰基-神经氨酸的低聚糖的钠加合物，该低聚糖可能是单唾液酸化的乳-N-四糖（Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）或单唾液酸化的乳-N-新四糖（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）。由于峰1仅含一个唾液酸并且我们已示出单唾液酸化（-1）的HMO级分对降低NEC病理得分没有明显作用，我们推定峰1是-1带电HMO级分的溢出，并在后续分析中弃掉该低聚糖。峰2与峰1的不同仅在于增加一个N-乙酰基-神经氨酸，并且可能是二唾液酸化乳-N-四糖或二唾液酸化乳-N-新四糖。峰3和峰4含有一个额外的己糖和一个额外的N-乙酰基-己糖胺，其可能代表由二糖N-乙酰基-乳糖胺（Galβ1-4GlcNAc）或乳-N-二糖（Galβ1-3GlcNAc）引起的HMO骨架的延伸。峰3与峰4的不同仅在于岩藻糖部分的增加。在下文中，由峰2、3和4代表的低聚糖分别被称为HMO2、HMO3和HMO4。
接着，我们使用凝胶排阻色谱按尺寸对-2带电HMO级分中的低聚糖进行进一步分离。尽管我们不能将HMO3和HMO4彼此分离开，我们将HMO3+4与HMO2分离开（图8D）。我们随后汇集含有HMO2或HMO3+4的亚级分，并在大鼠模型中以其在10mg/ml汇集HMO中的原始浓度对它们进行测试（图8E）。尽管HMO3+4没有作用，HMO2使病理得分降低到0.64±0.41，这显著低于FF组的病理得分（p<0.001），与DF对照并无差别。
NEC-防治性HMO是DSLNT
二维色谱法的结果显示，独特的二唾液酸化HMO保护新生大鼠免患NEC。尽管MALDI-TOF-MS对防治性HMO的大体组成提供了最初洞悉，我们在按序的外切糖苷酶消化后使用HPLC-FL来确定不同单糖残基的确切位置和连接键。首先，我们确定两个唾液酸是否以α2-3或α2-6连接键结合。将HMO2与α2-3-特异性的神经氨酸酶一起孵育，导致HPLC-FL色谱中HMO2峰的完全移位（图9A），表明至少一个唾液酸以α2-3位结合。将HMO2与切割α2-3-和α2-6-结合唾液酸的连接键混杂性神经氨酸酶一起孵育，引起HMO2峰的更大移位（图9A）。归结起来，这些结果表明，一个唾液酸以α2-3连接键结合，一个以α2-3连接键结合。在去除两个唾液酸之后，我们使用连接键特异性的半乳糖苷酶来确定末端单糖是否确实是半乳糖，以及HMO基础骨架是否为I型（Galβ1-3GlcNAc-R）链还是II型（Galβ1-4GlcNAc-R）链。β1-3-特异性半乳糖苷酶的消化引起完全的峰移位；β1-4-特异性半乳糖苷酶的消化不起作用，证实I型链中存在末端半乳糖（图9B）。接着，我们使用β-N-乙酰基-氨基葡萄糖苷酶，并证实亚末端的单糖确实是GlcNAc（图9C）。余下的二糖通过β1-4-特异性半乳糖苷酶切割，证实乳糖形成HMO2的还原端。
在解析HMO2骨架中的位置和一些连接键之后，我们已确定两个唾液酸的位置。仅有在用连接键混杂性的神经氨酸酶或α2-3-特异性神经氨酸酶预处理后，β1-3-特异性半乳糖苷酶才去除末端的半乳糖，意味着末端的半乳糖被α2-3-连接的唾液酸所遮盖。仅有用连接键混杂性的而不是α2-3-特异性的神经氨酸酶进行预处理后才能去除亚末端GlcNAc，意味着第二个唾液酸以α2-6连接键结合到亚末端GlcNAc。
此外，我们运用对部分甲基化的糖醇乙酸酯（PMAA）衍生物的GC-MS分析，证实3-连接的半乳糖、4-连接的葡萄糖和3,6-连接的GlcNAc的存在（图9D）。按序的外切糖苷酶的消化和PMAA连接键分析的综合数据明确地鉴定出HMO2是具有异构体构型NeuAcα2-3Galβ1-3（NeuAcα2-6）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc的DSLNT（图9E）。
DSLNT具有NEC-防治效果
基于对汇集HMO的HPLC-FL分析（图5A），在我们以10mg/ml补充汇集HMO的配方中，DSLNT浓度为约300μM。我们购买市售的DSLNT，以300　μM将其加到配方中，并已证实可以使NEC病理得分显著降低到0.60±0.52，而FF组为1.90±1.13（p<0.001）（图10）。
参考文献
1.Uauy RD,Fanaroff AA,Korones SB等人.Necrotising enterocolitis invery low birth weight infants:biodemographic and clinical correlates.National Institute of Child Health and Human Development NeonatalResearch Network.J Pediatr1991;119:630-8.
2.Neu J,Walker WA.Necrotizing enterocolitis.N Engl J Med2011;364:255-64.
3.Holman RC,Stoll BJ,Clarke MJ等人.The epidemiology of necrotizingenterocolitis infant mortality in the United States.Am J Public Health1997;87:2026-31.
4.Holman RC,Stoll BJ,Curns AT等人.Necrotising enterocolitishospitalisations among neonates in the United States.Paediatr PerinatEpidemiol2006;20:498-506.
5.Rees CM,Pierro A,Eaton S.Neurodevelopmental outcomes of neonateswith
medically and surgically treated necrotizing enterocolitis.Arch Dis ChildFetal
Neonatal Ed2007;92:F193e8.
6.Dicken BJ,Sergi C,Rescorla FJ等人.Medical management of motilitydisorders in patients with intestinal failure:a focus on necrotizingenterocolitis,gastroschisis,and intestinal atresia.J Pediatr Surg2011;46:1618-30.
7.Clark,Gordon P,Walker WM等人.Characteristics of patients who dieof necrotizing enterocolitis.J Perinatol.Published Online First:19May2011.doi:10.1038/jp.2011.65.
8.Blakely ML,Lally KP,McDonald S等人.Postoperative outcomes ofextremely low birth-weight infants with necrotizing enterocolitis or isolatedintestinal perforation:a prospective cohort study by the NICHD NeonatalResearch Network.Ann Surg2005;241:984e9;discussion989-94.
9.Lucas A,Cole TJ.Breast milk and neonatal necrotizing enterocolitis.Lancet1990;336:1519-23.
10.Sullivan S,Schanler RJ,Kim JH等人.An exclusively humanmilk-based diet is associated with a lower rate of necrotizing enterocolitisthan a diet of human milk and bovine milk-based products.J Pediatr2010;15:562-7e1.
11.Sisk PM,Lovelady CA,Dillard RG等人.Early human milk feeding isassociated with a lower risk of necrotizing enterocolitis in very low birthweight infants.J Perinatol2007;27:428-33.
12.Schanler RJ,Shulman RJ,Lau C.Feeding strategies for prematureinfants:beneficial outcomes of feeding fortified human milk versus pretermformula.Pediatrics1999;103:1150-7.
13.Schanler RJ,Lau C,Hurst NM等人.Randomized trial of donor humanmilk versus preterm formula as substitutes for mothers’own milk in thefeeding of extremely premature infants.Pediatrics2005;116:400-6.
14.Newburg DS,Ruiz-Palacios GM,Morrow AL.Human milk glycansprotect infants against enteric pathogens.Annu Rev Nutr2005;25:37-58.
15.Kunz C,Rudloff S,Baier W等人.Oligosaccharides in human milk:structural,functional,and metabolic aspects.Annu Rev Nutr2000;20:699-722.
16.Bode L.Human milk oligosaccharides:prebiotics and beyond.NutrRev2009;67(Suppl2):S183-91.
17.Bode L.Recent advances on structure,metabolism,and function ofhuman milk oligosaccharides.J Nutr2006;136:2127-30.
18.Wu S,Tao N,German JB等人.Development of an annotated library ofneutral human milk oligosaccharides.J Proteome Res2010;9:4138-51.
19.Wu S,Grimm R,German JB等人.Annotation and structural analysis ofsialylated human milk oligosaccharides.J Proteome Res2011;10:856-68.
20.Stahl B,Thurl S,Zeng J等人.Oligosaccharides from human milk asrevealed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.Anal Biochem1994;223:218-26.
21.Kobata A.Structures and application of oligosaccharides in human milk.Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci2010;86:731-47.
22.Thurl S,Henker J,Siegel M等人.Detection of four human milk groupswith respect to Lewis blood group dependent oligosaccharides.Glycoconj J1997;14:795-9.
23.Blank D,Gebhardt S,Maass K等人.High-throughput mass fingerprinting and Lewis blood group assignment of human milkoligosaccharides.Anal Bioanal Chem2011;401:2495-510.
24.Bode L,Kunz C,Muhly-Reinholz M等人.Inhibition of monocyte,lymphocyte,and neutrophil adhesion to endothelial cells by human milkoligosaccharides.Thromb Haemost2004;92:1402-10.
25.Bode L,Rudloff S,Kunz C等人.Human milk oligosaccharides reduceplateletneutrophil complex formation leading to a decrease in neutrophilbeta2integrin expression.J Leukoc Biol2004;76:820-6.
26.Barlow B,Santulli TV.Importance of multiple episodes of hypoxia orcold stress on the development of enterocolitis in an animal model.Surgery1975;77:687-90.
27.Nadler EP,Dickinson E,Knisely A等人.Expression of inducible nitricoxide synthase and interleukin-12in experimental necrotizing enterocolitis.J Surg Res2000;92:71-7.
28.Upperman JS,Potoka D,Grishin A等人.Mechanisms of nitricoxide-mediated intestinal barrier failure in necrotizing enterocolitis.SeminPediatr Surg2005;14:159-66.
29.Guner YS,Franklin AL,Chokshi NK等人.P-glycoprotein induction bybreast milk attenuates intestinal inflammation in experimental necrotizingenterocolitis.Lab Invest2011;91:1668-79.
30.Stefanutti G,Lister P,Smith VV等人.P-selectin expression,neutrophilinfiltration,and histologic injury in neonates with necrotizing enterocolitis.J Pediatr Surg2005;40:942-7;discussion947-8.
31.Becker DJ,Lowe JB.Leukocyte adhesion deficiency type II.BiochimBiophys Acta1999;1455:193-204.
32.Luhn K,Wild MK,Eckhardt M等人.The gene defective in leukocyteadhesion deficiency II encodes a putative GDP-fucose transporter.NatGenet2001;28:69-72.
33.Crocker PR,Paulson JC,Varki A.Siglecs and their roles in the immunesystem.Nat Rev Immunol2007;7:255-66.
34.Koliwer-Brandl H,Siegert N,Umnus K等人.Lectin inhibition assayfor the analysis of bioactive milk sialoglycoconjugates.Int Dairy J2011;21:413-20.
35.Sodhi C,Richardson W,Gribar S等人.The development of animalmodels for the study of necrotizing enterocolitis.Dis Model Mech2008;1:94-8.
36.Ganapathy V,Hay JW,Kim JH.Costs of necrotizing enterocolitis andcost-effectiveness of exclusively human milk-based products in feedingextremely premature infants.Breastfeed Med.Published Online First:30June2011.doi:10.1089/bfm.2011.0002.
37.Leo F,Asakuma S,Fukuda K等人.Determination of sialyl and neutraloligosaccharide levels in transition and mature milks of Samoan women,using anthranilic derivatization followed by reverse phase highperformance liquid chromatography.Biosci Biotechnol Biochem2010;74:298-303.
38.Bao Y,Zhu L,Newburg DS.Simultaneous quantification ofsialyloligosaccharides from human milk by capillary electrophoresis.AnalBiochem2007;370:206-14.

Claims (27)

1.一种制剂，包含分离的二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）或其变体、异构体、类似物和衍生物。
2.如权利要求1所述的制剂，其中，
所述分离的DSLNT或其变体、异构体、类似物和衍生物为足以抑制肠病的量。
3.如权利要求2所述的制剂，其中，
所述足以抑制肠病的量为至少30μM、至少300μM，或在约600～1500μM或约500～800μM的范围内。
4.如权利要求1所述的制剂，其中，
所述制剂是肠制剂。
5.如权利要求1所述的制剂，其中，
所述制剂添加到婴儿配方、母乳或幼儿食品中。
6.如权利要求1所述的制剂，其中，
所述制剂是液体、凝胶或固体。
7.一种预防或治疗患有肠病和/或炎症的受试者的方法，其通过以足以预防或治疗所述受试者中的肠病和/或炎症的量，向所述受试者进行分离的二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）或其变体、异构体、类似物和衍生物的给药。
8.如权利要求7所述的方法，其中，
所述受试者是哺乳动物。
9.如权利要求8所述的方法，其中，
所述哺乳动物是婴儿。
10.如权利要求7所述的方法，其中，
分离的二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）以婴儿配方、强化母乳、幼儿食品或营养补充剂的方式进行给药。
11.如权利要求8所述的方法，其中，
所述哺乳动物是人、猴、大鼠、小鼠、狗、猫、猪、山羊、绵羊、马或牛。
12.如权利要求7所述的方法，其中，
分离的二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）以动物饲料、动物饲料补充剂或动物营养补充剂的方式进行给药。
13.如权利要求7所述的方法，其中，
所述受试者罹患腹泻、小肠炎、结肠炎、痉挛、腹痛、水肿、溃疡、胃炎、肠道疾病、消化***疾病或炎症性肠病。
13.如权利要求7所述的方法，其中，
所述肠病是传染病。
14.如权利要求7所述的方法，其中，
所述肠病是坏死性小肠结肠炎（NEC）。
15.一种鉴定母乳喂养的婴儿是否处于患上坏死性小肠结肠炎（NEC）的风险的方法，包括测定母乳中二唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）的浓度，低水平的DSLNT预示着所述母乳喂养的婴儿处于患上NEC的风险。
16.如权利要求1所述的制剂，其中，
所述制剂是片剂或囊片。
17.如权利要求16所述的制剂，其中，
所述片剂或囊片是多层的。
18.如权利要求16所述的制剂，其中，
所述片剂或囊片是骨架片或骨架囊片。
19.如权利要求1所述的制剂，其中，
所述制剂是多颗粒制剂。
20.如权利要求19所述的制剂，其中，
所述多颗粒被装入胶囊。
21.如权利要求19所述的制剂，其中，
所述多颗粒被压成片剂。
22.如权利要求1所述的制剂，其中，
所述制剂是药物制剂。
23.如权利要求1所述的制剂，其中，
所述制剂与益生菌一起给药。
24.如权利要求23所述的制剂，其中，
所述益生菌包含双歧杆菌属和/或乳酸杆菌属的菌种。
25.一种制剂，包含分离的DSLNT或其变体、异构体、类似物和衍生物以及药学上可接受的载体。
26.一种制剂，由分离的DSLNT或其变体、异构体、类似物和衍生物以及药学上可接受的载体组成。
27.如权利要求1或25所述的制剂，其中，
所述制剂基本上不含非DSLNT的低聚糖。
CN201280007735.6A 2011-02-04 2012-02-03 预防或抑制肠病的二唾液酸乳-n-四糖（dslnt）或其变体、异构体、类似物和衍生物 Expired - Fee Related CN103442696B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161439705P 2011-02-04 2011-02-04
US61/439,705 2011-02-04
PCT/US2012/023866 WO2012106665A2 (en) 2011-02-04 2012-02-03 Disialyllacto-n-tetraose (dslnt) or variants, isomers, analogs and derivatives thereof to prevent or inhibit bowel disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103442696A true CN103442696A (zh) 2013-12-11
CN103442696B CN103442696B (zh) 2016-09-21

Family

ID=46603334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280007735.6A Expired - Fee Related CN103442696B (zh) 2011-02-04 2012-02-03 预防或抑制肠病的二唾液酸乳-n-四糖（dslnt）或其变体、异构体、类似物和衍生物

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9675649B2 (zh)
EP (1) EP2670399A4 (zh)
CN (1) CN103442696B (zh)
BR (1) BR112013019522A2 (zh)
CA (1) CA2824960A1 (zh)
IL (1) IL227398A0 (zh)
MX (1) MX2013008500A (zh)
SG (1) SG192234A1 (zh)
WO (1) WO2012106665A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115364113A (zh) * 2014-10-29 2022-11-22 格礼卡姆股份公司 合成组合物以及用于治疗肠易激综合症的方法

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201306689D0 (en) 2013-04-12 2013-05-29 Glycom As Synthesis of sialylated/fucosylated human milk oligosaccharides
CN113331426A (zh) 2014-04-08 2021-09-03 雅培公司 使用人乳寡糖增强对病原体的粘膜先天免疫反应和/或检测的方法
US11040049B2 (en) * 2014-10-29 2021-06-22 Glycom A/S Composition comprising HMSs/HMOs and use thereof
US20160243139A1 (en) * 2014-10-29 2016-08-25 Glycom A/S Composition comprising HMSs/HMOs and use thereof
PL3212198T3 (pl) * 2014-10-29 2021-08-23 Glycom A/S Syntetyczna kompozycja i sposób promowania gojenia się błony śluzowej
US11040050B2 (en) 2014-10-29 2021-06-22 Glycom A/S Composition comprising HMSs/HMOs and use thereof
CN105806976B (zh) * 2016-03-15 2018-06-22 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种测定奶粉、米粉和乳米粉中低聚半乳糖含量的方法及其应用
KR20190045228A (ko) * 2016-08-31 2019-05-02 올리고사이언스 바이오테크놀로지 게엠베하 송아지 비육에서 인간 모유 올리고당류의 용도
EP3473644A1 (en) * 2017-10-17 2019-04-24 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentative production of n-acetylneuraminic acid
US11701404B2 (en) * 2017-12-01 2023-07-18 Societe Des Produits Nestle S.A. Human milk fortifier composition
EP4076474A4 (en) * 2019-12-06 2024-02-28 Glycom A/S COMPOSITION CONTAINING 2'-FL AND DFL FOR USE IN A PAIN RELIEF METHOD
TW202233201A (zh) * 2020-12-16 2022-09-01 荷蘭商弗里斯蘭康必奶荷蘭有限公司 包含ＬＮＦＰ ＩＩＩ和ＬＳＴａ的合成組成物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005055944A2 (en) * 2003-12-05 2005-06-23 Cincinnati Children's Hospital Medical Center Oligosaccharide compositions and use thereof in the treatment of infection

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19701382A1 (de) 1997-01-16 1998-07-23 Nutricia Nv Kohlenhydratmischung
DE10204000A1 (de) * 2002-02-01 2003-08-14 Nutricia Nv Sialysierte Kohlenhydrate
CA2636724A1 (en) 2006-01-09 2007-08-02 Children's Hospital Medical Center Adiponectin for treatment of various disorders
EP1974735A1 (en) * 2007-03-28 2008-10-01 Nestec S.A. Reduction of risk of diarrhoea
WO2008153377A1 (en) 2007-06-15 2008-12-18 N.V. Nutricia Nutrition with non-viable bifidobacterium and non-digestible oligosaccharide
WO2011005681A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Children's Hospital Medical Center Inhibiting inflammation with milk oligosaccharides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005055944A2 (en) * 2003-12-05 2005-06-23 Cincinnati Children's Hospital Medical Center Oligosaccharide compositions and use thereof in the treatment of infection

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C.KUNZ ET AL.: "Potential anti-inflammatory and anti-infectious effects of human milk oligosaccharides", 《ADVANCES IN EXPERIMANTAL MEDICINE AND BIOLOGY》, vol. 606, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 455 - 465 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115364113A (zh) * 2014-10-29 2022-11-22 格礼卡姆股份公司 合成组合物以及用于治疗肠易激综合症的方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL227398A0 (en) 2013-09-30
EP2670399A2 (en) 2013-12-11
WO2012106665A3 (en) 2013-01-03
SG192234A1 (en) 2013-09-30
US20130315990A1 (en) 2013-11-28
EP2670399A4 (en) 2015-08-26
CA2824960A1 (en) 2012-08-09
BR112013019522A2 (pt) 2019-09-24
WO2012106665A2 (en) 2012-08-09
CN103442696B (zh) 2016-09-21
US9675649B2 (en) 2017-06-13
NZ613432A (en) 2016-06-24
MX2013008500A (es) 2014-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103442696B (zh) 预防或抑制肠病的二唾液酸乳-n-四糖（dslnt）或其变体、异构体、类似物和衍生物
ES2967947T3 (es) Polímeros de glicano y métodos relacionados de los mismos
US11697692B2 (en) Methods of producing glycan polymers
Autran et al. Sialylated galacto-oligosaccharides and 2′-fucosyllactose reduce necrotising enterocolitis in neonatal rats
CN107427528B (zh) 聚糖治疗剂和其相关方法
Chen et al. Lactose and lactose-derived oligosaccharides: More than prebiotics?
CN1105506C (zh) 碳水化合物混合物
Kunz et al. Health promoting aspects of milk oligosaccharides
EP1531832B1 (en) Therapeutic compositions for use in prophylaxis or treatment of diarrheas
Arribas et al. Di-D-fructose dianhydride-enriched caramels: effect on colon microbiota, inflammation, and tissue damage in trinitrobenzenesulfonic acid-induced colitic rats
KR20060123175A (ko) 글루코사민을 포함하는 식품 조성물
Hennet et al. Decoding breast milk oligosaccharides
EP3703705B1 (en) Glucose-containing glycan preparations for use in the treatment of hyperammonaemia
Difilippo et al. Oligosaccharides in urine, blood, and feces of piglets fed milk replacer containing galacto-oligosaccharides
Hussein Novel prebiotics and next-generation probiotics: opportunities and challenges
TWI660969B (zh) 具有自然免疫活化作用之多醣類及含有該多醣類之自然免疫活化劑或飲食品
CA3172064A1 (en) Composition for enhancing urolithin production in a human subject
Ren et al. Advancement in Therapeutic Intervention of Prebiotic-Based Nanoparticles for Colonic Diseases
NZ613432B2 (en) Disialyllacto-n-tetraose (dslnt) or variants, isomers, analogs and derivatives thereof to prevent or inhibit bowel disease
WO2022163663A1 (ja) 遺伝子突然変異を抑制する薬剤及び健康食品
Yi The estimation of the digestibility of fucoidan extracted from New Zealand Undaria pinnatifida
Wagner The complexity of membrane-bound glycans in health and disease and the beneficial properties of glyconutrients
Oftedal et al. Glycobiology Advance Access published May 7, 2014
Maldonado-Gomez Studies on the Adherence Properties of Plant Lectins and Bacterial Adhesins and their Inhibition by Prebiotic Oligosaccharides and Bovine Colostrum Fractions

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160921

Termination date: 20170203