CN103436523A - 基于随机引物条码技术建立分析免疫库谱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明针对医药生物技术，涉及基于引物条码技术的高通量测序方法及其用于免疫基因组学中的研究，具体为基于cDNA分子的标记方法的T细胞受体高通量测序方法，具体包括以下步骤：提取样本中的RNA，对RNA进行逆转录，得cDNA，根据所得cDNA设计特异性引物，设计的特异性引物的下游引物、随机条码和测序接头以串联的方式组成随机引物条码，将所得随机引物条码过量加入所得cDNA分子中，利用随机引物条码中的测序接头进行高通量测序，测序数据进行VDJ比对，分析CDR3序列，建立免疫库谱；本方法降低了PCR扩增过程中发生偏斜和误差的方法，该方法根据特定的引物条码对应的给定的cDNA序列，使得cDNA分子的数量可以量化。

Description

基于随机引物条码技术建立分析免疫库谱的方法

技术领域

本发明针对医药生物技术主题，属于重大疾病的个体化诊疗技术，具体是一种基于条码技术的高通量测序方法及其用于免疫基因组学中的研究。 

背景技术

免疫基因组学是研究人体主要组织相容性复合体（MHC）、T细胞受体(TCR)和抗体的基因组学，可广泛用于指导疫苗设计、个体化医疗等研究。免疫基因组学的研究中，T细胞是机体免疫功能的执行者，TCR是T细胞表面识别抗原的分子，也是T细胞产生免疫应答的首个关键分子。Ｔ细胞在胸腺发育过程中，ＴＣＲ通过Ｖ（Ｄ）ＪＣ基因重排和选择，组成了外周多样性的Ｔ细胞库，使其能对外界各种各样的抗原产生应答。 

ＴＣＲ的CDR3受体库，在上世纪90年代以来，被广泛应用于机体生理条件下（Ｔ细胞的进化、发育、分化、增殖、亚群、耐受、衰老等）的基础研究。分析ＴＣＲ的ＣＤＲ3受体库，了解初始Ｔ细胞中ＴＣＲ基因重排的情况，可以用以评价机体初始Ｔ细胞的多样性，并可分析不同个体之间的ＴＣＲ的CDR3受体库的多样性，进一步研究Ｔ细胞发生、发育过程。同一个体不同年龄阶段中枢外周ＴＣＲ的CDR3受体库差异，可以应用于探讨年龄与ＴＣＲ多样性的关系等。在多种情况下，个体ＴＣＲ的CDR3库的综合基因表达分析对评价免疫应答很有意义，通过研究ＴＣＲ的CDR3的表达频率，筛选克隆性增殖的Ｔ细胞和感染、肿瘤、自身免疫病、器官移植等等的关系，可为这些疾病的诊断和治疗提供基础和手段。在非Ｔ细胞肿瘤的研究中，可通过ＴＣＲ的CDR3受体库来寻找并分析抗肿瘤Ｔ细胞的分子特征，为患者个体化Ｔ细胞的回收治疗和肿瘤疫苗的研制等提供基础；在成熟的Ｔ细胞肿瘤中，可分析肿瘤 Ｔ细胞ＴＣＲ的CDR3的组成，为Ｔ细胞肿瘤患者寻找治疗靶标和残余病变的诊断等提供方法。同时动态分析肿瘤病人体内ＴＣＲ的CDR3受体库的变化情况，可了解肿瘤患者的免疫状态和预后等。 

Ｔ细胞在限制病毒、细菌和寄生虫感染等起到关键作用，ＴＣＲ的CDR3受体库的多样性可能影响了ＣＴＬ的杀伤能力并调控着免疫自稳状态，通过研究急性和持续性病毒感染中，不同ＴＣＲＣＤＲ3受体库的产生和维持，追踪不同的Ｔ细胞亚群，为提高Ｔ细胞在感染状态下的应答能力奠定基础。对自身免疫病患者ＴＣＲ的CDR3受体库的全面深入分析，可了解自身应答Ｔ细胞是如何打破自身耐受的机制，同时，通过自身应答Ｔ细胞ＴＣＲ的CDR3组成的研究，可为个体化的自身免疫诊治提供切实可行的手段。近年来随着干细胞研究的进展，自体和异体造血干细胞移植在越来越多的疾病中得到应用。检测移植供者和受者的Ｔ细胞ＴＣＲ的CDR3受体库，动态监测移植后不同时间段ＴＣＲ的CDR3受体库变化，有助于对移植患者体内移植排斥Ｔ细胞来源及移植后免疫重建的评估等提供基础。另外，对ＴＣＲ的CDR3受体库的全面分析，可探讨个体对疾病的易感性和抵抗性，即某些ＴＣＲ的CDR3的缺失或高表达和机体Ｔ细胞对特异抗原（不同疾病）应答密切相关。 

DNA条形码技术（DNA barcode）是利用生物体DNA中一段保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术，是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为生态学研究的重要工具，不仅用于物种鉴定，同时也帮助生物学家进一步了解生态***内发生的相互作用。通常，在发现一种未知物种或者物种的一部分时，研究人员便描绘其组织的DNA条形码，而后与国际数据库内的其他条形码进行比对；如果与其中一个相匹配，研究人员便可确认这种物种的身份。理想的DNA barcdoing应当符合下列标准：(1)具有足够的变异性以区分不同的物种，同时具有相对的保守性；(2)必须是一段标准的DNA区来尽可能鉴别不同的分类群；(3)目标DNA区应当包含足够的***进化信息以定位物种在分类***(科、属等)中的位置；(4)应该是高度保守的引物设计区以便于通用引物的设计；(5)目标DNA 区应该足够的短以便于有部分降解的DNA的扩增。DNA barcoding作为生物“种水平species-level”鉴定的工具引人注目。Genbank数据库中CO I序列正在快速增加。Min等分析了CO I序列及其来源基因组核苷酸含量之间的关系，结果表明849个CO I基因的5端的DNA barcoding序列令人惊奇地准确地代表了其来源完整线粒体基因mtDNA的重要信息，也就是说对于未测序的基因组，从DNA barcoding能快速预知完整基因组的组成。 

另外，目前用于免疫基因组研究的高通量测序技术存在两个缺陷：1）建库过程中的扩增偏斜；2）低拷贝数序列的测序误差较大。针对以上问题，申请者建立了一种新的基于条码技术的高通量测序技术。 

本发明是基于上述现有技术，并针对现有技术的不足进行改进发明的。 

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种随机引物条码标记cDNA分子的方法，并提供基于方法下的T细胞受体高通量测序方法；用上述方法建立免疫库谱效率高，误差小。 

为实现上述目的，本发明的技术方案为： 

cDNA分子的标记方法，在cDNA两端加入过量的随机引物条码，使cDNA分子两端各标记对应的随机引物条码。 

用所述的标记方法获得的cDNA分子。 

进一步，所述的cDNA分子，所述随机引物条码由根据cDNA分子设计的特异性引物的下游引物、随机条码和测序接头以串联的方式组成。 

基于cDNA分子的标记方法的T细胞受体高通量测序方法，具体包括以下步骤： 

1)提取样本中的RNA; 

2)对RNA进行逆转录，得cDNA; 

3)根据所得cDNA设计特异性引物，设计的特异性引物的下游引物、随机条码和测序接头以串联的方式组成随机引物条码； 

4）将所得随机引物条码过量加入步骤2）所得cDNA分子中； 

5）利用随机引物条码中的测序接头进行高通量测序，测序数据进行VDJ比对，分析CDR3序列。 

进一步，步骤1）中的样本源自被病原感染后不同阶段的患者。 

更进一步，步骤1）中的样本源自被乙肝病毒感染后不同阶段的患者。 

进一步，根据分析同一样本的CDR3序列的结果，得到单个完整的免疫库谱。 

进一步，根据分析不同样本的CDR3序列的结果，得到多个集合的完整的免疫库谱。 

更进一步，所述免疫库谱为慢性乙型肝炎免疫库谱。 

进一步，步骤3）中的测序接头与Illumina的平台兼容。 

本发明的有益效果在于：本发明涉及的方法降低PCR扩增过程中发生偏斜和误差的方法。在获得PCR扩增的cDNA文库时，使用带有随机序列作为条码的特异性下游引物进行逆转录反应，因而每个cDNA模板得到一个唯一的条码序列，经过PCR扩增，深度测序，然后通过计算原样品中的独特的条形码序列的数目，以及该特定条码对应的给定的cDNA序列，使得cDNA分子的数量可以量化。 

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。 

一慢性乙肝患者样本选取 

（1）选取慢性乙肝轻度患者一名：症状较轻、较少，如轻度乏力、轻度腹胀、轻度肝区不适等，肝功能有损伤。转氨酶在3倍(正常值为40单位)，胆红素在2倍正常值左右(正常值为17.1微摩尔/升)，白蛋白大于或等于35克/升(正常值为35-55克/升)。 

（2）选取慢性乙肝中度一名：症状和体征及肝功能改变介于轻度和重度之间。转氨酶超过正常值的3倍，胆红素超过正常值的4倍、白蛋白在35克/升之间。 

（3）选取慢性乙肝重度一名：有明显或持续的肝炎症状，如乏力、食欲差、腹胀、便溏、尿黄、肝区疼痛、面色灰暗、肝掌、蜘蛛痣等，肝功能损伤较重，转氨酶超过正常值5倍，胆红素超过正常值5倍，白蛋白等于32克/升。 

二样本总RNA提取 

1.从阳性病人全血中提取总RNA 

取-70℃保存的全血冰上融化，取3ml加入15ml离心管，加入6mlTRNzol-A+，3ml三氯甲烷，充分颠倒混匀5分钟。10,000g离心10分钟，吸取上清约2.5ml加入新15ml离心管，加入2.5ml异丙醇和250μl醋酸钠，颠倒混匀后放置冰上1小时。10,000g离心20分钟，沉淀用70%乙醇洗涤2次后37℃烘干,加50μl TE溶解并转移至1.5ml离心管。测定提取总RNA的OD260值。根据阳性全血样本2份共约120ml左右,补充订购200ml TRNzol-A+总RNA提取试剂，50ml除RNase螺口高速离心管,按预实验步骤，分3批次，每次提取40ml全血RNA。 

三.逆转录制备cDNA分子 

主要试剂为M-MLV Reverse Transcriptase（CatNo.:28025-013,Invtrogen公司），mRNA Mini Kits（CatNo.:70022,Qiagen公司），DNA纯化试剂盒（Roche公司）。按照mRNA Mini Kits试剂盒说明书，将总共24.1μg的总RNA抽提纯化得到mRNA。以纯化的mRNA为模板，根据设计的特异性引物，设计得到9段cDNA分子。 

四.随机引物条码的制备 

测序接头来自Illumina的平台提供的序列，由博奥生物公司提供。根据上述设计得到9段cDNA分子，设计对应的特异性引物，利用分别的下游引物、随机条码和测序接头以串联的方式组成随机引物条码。将随机引物条码与设计得到9段cDNA分子各自的两末端连接，得9段被随机引物条码标记的cDNA分子。） 利用随机引物条码中的测序接头进行，利用Illumina的平台高通量测序，测序数据进行VDJ比对，分析CDR3序列。得到单个完整的免疫库谱和集合免疫库谱。 

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。 

Claims (10)

1.cDNA分子的标记方法，其特征在于：在cDNA两端加入过量的随机引物条码，使cDNA分子两端各标记对应的随机引物条码。

2.用权利要求1所述的标记方法获得的cDNA分子。

3.根据权利要求1所述的cDNA分子，其特征在于：所述随机引物条码由根据cDNA分子设计的特异性引物的下游引物、随机条码和测序接头以串联的方式组成。

4.基于cDNA分子的标记方法的T细胞受体高通量测序方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)提取样本中的RNA;

2)对RNA进行逆转录，得cDNA;

3)根据所得cDNA设计特异性引物，设计的特异性引物的下游引物、随机条码和测序接头以串联的方式组成随机引物条码；

4）将所得随机引物条码过量加入步骤2）所得cDNA分子中；

5）利用随机引物条码中的测序接头进行高通量测序，测序数据进行VDJ比对，分析CDR3序列。

5.根据权利要求4所述的基于cDNA分子的标记方法的T细胞受体高通量测序方法，其特征在于：步骤1）中的样本源自被病原感染后不同阶段的患者。

6.根据权利要求5所述的基于cDNA分子的标记方法的T细胞受体高通量测序方法，其特征在于：步骤1）中的样本源自被乙肝病毒感染后不同阶段的患者。

7.根据权利要求6所述的基于cDNA分子的标记方法的T细胞受体高通量测序方法，其特征在于：根据分析同一样本的CDR3序列的结果，得到单个完整的免疫库谱。

8.根据权利要求6所述的基于cDNA分子的标记方法的T细胞受体高通量测序方法，其特征在于：根据分析不同样本的CDR3序列的结果，得到多个集合的完整的免疫库谱。

9.根据权利要求8或9所述的基于cDNA分子的标记方法的T细胞受体高通量测序方法，其特征在于：所述免疫库谱为慢性乙型肝炎免疫库谱。

10.根据权利要求4所述的基于cDNA分子的标记方法的T细胞受体高通量测序方法，其特征在于：步骤3）中的所述测序接头与Illumina的平台兼容。