CN103417980B

CN103417980B - 一种鸭病毒性肝炎活疫苗冻干保护剂

Info

Publication number: CN103417980B
Application number: CN201310354836.7A
Authority: CN
Inventors: 张小飞; 黄显明
Original assignee: NANJING TIANBANG BIO-INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: Zhaofenghua Biotechnology (Nanjing) Co., Ltd
Priority date: 2013-08-14
Filing date: 2013-08-14
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2033-08-14
Also published as: CN103417980A

Abstract

本发明涉及一种鸭病毒性肝炎活疫苗新型冻干保护剂。该新型保护剂最大优点是使疫苗在冻干过程中抗原活性损失小，有效解决了鸭肝炎病毒对冻干的敏感难题。其次，用该保护剂冻干的鸭肝炎活疫苗耐热性好，疫苗在2～8℃条件下保存期达24个月以上，经37℃耐老化试验10天后仍保持良好活性，解决了疫苗对贮存、运输严格的低温冷链问题，同时还大大的降低了疫苗贮存和运输成本。

Description

一种鸭病毒性肝炎活疫苗冻干保护剂

技术领域

本发明涉及一种鸭病毒性肝炎活疫苗新型冻干保护剂，属于兽用生物制品制造技术领域。

背景技术

鸭病毒性肝炎（duck viral hepatitis,DVH）是由鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus,DHV）引起的雏鸭的一种以肝脏出血性炎症为特征的急性、烈性、高度致死性传染病。鸭肝炎主要发生于3周龄以内雏鸭，发病突然，传播迅速，发病率和死亡率可达90%以上。自1950年Levine和Fabricant首次从美国纽约长岛发病雏鸭分离到1型鸭肝炎病毒以来，目前已知引起鸭肝炎的病毒有三种，分别称为1型、2型和3型鸭肝炎病毒。其中1型鸭肝炎病毒属于微RNA病毒科，2型及3型鸭肝炎病毒属星状病毒科。三种病毒是互为独立的病原体，之间无血清交叉保护性，而且2型仅见于英国，3型仅在美国发生过。1型鸭肝炎流行最广，自上世纪五十年代被发现以后，世界养鸭国家陆续有该病报道。我国黄均建1963年首次报道了上海地区鸭场爆发此病,王平等1980年首先在北京地区发病鸭场分离到该病毒，之后我国养鸭地区均有本病的发生。

1992年Sandhu等报道发现一种1型DHV的变异株，用鸡胚交叉中和试验证明与1型之间有部分交叉保护作用。近年来我国大陆、台湾及韩国分别有1型DHV变异株和新型鸭肝炎的报道，不同学者通过分子生物学和血清学试验证实我国虽有鸭肝炎变异株或新型鸭肝炎的存在，但鸭肝炎的流行仍以经典的1型肝炎为主。

我国鸭的年饲养量已达40亿只，占全世界鸭饲养总量的70%以上，由于长期以来没有合法的商品化鸭肝炎疫苗用于预防接种，该病已成为危害我国养鸭业的头号疫病，每年因感染鸭肝炎死亡所造成的直接经济损失达数亿元。此前，我国对鸭病毒性肝炎的防治主要采用高免卵黄抗体，由于被动免疫持续时间短，预防和治疗效果不佳，常常需要多次注射卵黄抗体，造成防治费用高、费时费力。弱毒活疫苗是预防本病最经济和最有效的方法，我们通过二十余年的努力培育出了1株免疫原性良好、毒力稳定、安全性好、产生保护力快的疫苗毒株，研制出鸭病毒性肝炎活疫苗（A66株）。通过疫苗的免疫接种有望控制国内鸭病毒性肝炎的流行，对降低雏鸭的死亡率和提高生产效益具有重要意义。

在兽用疫苗中，冻干活疫苗占相当大的比例。冻干保护剂及冻干工艺是活疫苗生产中的一项关键技术，对疫苗的冻干、保存、运输和使用有很大影响。目前，国内兽用活疫苗冻干保护剂成分主要为牛奶、蔗糖、明胶等，虽然用它们作为保护剂制备的产品外型稳定、易溶性良好、成本低廉，但对疫苗热稳定性和抗原活性保护能力不强，对有些疫苗冻干过程中抗原活性损失大，产品大多需要在-15℃以下保存，而且保存期仅有1年左右时间，这给疫苗的储存和运输带来很大的困难。活疫苗新型保护剂和冻干工艺研究国外在二十世纪八十年代就已开始，现在国外兽用活疫苗及国内外人用活疫苗已普遍采用新型保护剂配方和冻干工艺，使疫苗在2～8℃条件下保存期达24个月以上，37℃保存10天仍保持活性。

病毒作为最简单的生命形式，种类不同，对冻感的敏感性也不同，这反映了它们对冻干的耐受特征及修复干燥过程中损伤的能力不同。Grieff和Rightsel根据病毒对冻干敏感性的不同而将病毒分成不同的类群[Grieff,D.and Rightsel,W.A.(1965)Stabilities of virus after vacuum sublimation and storage.Cryobiology3,435-443.]，而1型鸭肝炎病毒正好属于对冻干特别敏感的微RNA病毒科成员[Rightsel,W.A..and Grieff,D(1967)Freezing and freeze-drying of virus.Cryobiology3,423-431.]，我们在筛选鸭肝炎疫苗保护剂配方时也验证这种特性，所以本发明所涉及的保护剂配方和冻干曲线适宜于对冻干敏感的微RNA病毒科病毒，尤其适宜于鸭肝炎病毒的冻干。

发明内容

本发明的目的在于通过冻干保护剂配方的筛选、优化地提供一种适合鸭病毒性肝炎活疫苗新型冻干保护剂和冻干曲线。本发明的新型保护剂配制简单，适用于大规模生产。

本发明的技术方案

一种鸭病毒性肝炎活疫苗耐热冻干保护剂，其处方为：

各组份重量体积百分比为：海藻糖2%～5%、葡萄糖1%～3%、甘氨酸3%～8%、D-山梨醇1%～3%、聚乙烯吡咯烷酮1%～3%、明胶0.8%～1.2%，注射用水补足至100%；

配制方法为：

对冻干保护剂组份的海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、D-山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶等成分按处方比例称取混合后溶于注射用水，置116℃高压灭菌30min。

本发明所涉及的新型保护剂适宜于对冻干敏感的微RNA病毒科病毒的冻干保护，尤其适宜于在鸭病毒性肝炎活疫苗中的应用。

该新型保护剂在鸭病毒性肝炎活疫苗中的应用，是该新型冻干保护剂与鸭病毒性肝炎抗原液以1:1的体积比混合、分装，采用相应的冻干曲线冷冻干燥即得鸭病毒性肝炎活疫苗，而该相应的冻干曲线是：分装后的制品置入预冷至5℃的冻干机箱体内,以0.5℃～1℃/min 的速度将温度降至-45℃，维持4～6小时使疫苗冻实,抽真空至5Pa后，再以1℃/min的速度将温度升至15℃，在此温度下维持12～15小时，接着以0.5℃/min的速度升温至25℃维持2小时，再以0.5℃/min的速度升温至32℃，维持6小时加塞出箱。冻干全程为26～30小时，冻干后的鸭病毒性肝炎活疫苗每羽份病毒含量应≥10^4.3LD₅₀。

本发明具体实施方式

鸭病毒性肝炎活疫苗（A66株）抗原制备：取生产用鸭肝炎病毒A66株（本发明人由1986年由我国安徽分离到的鸭肝炎病毒经SPF鸡胚连续传代致弱获得，并由本发明人保存，该株鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus）已于2013年08月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.8020）毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，接种发育良好的9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.2ml，封孔后，置36～37℃继续孵育，弃36小时前死亡的鸡胚。36小时后，每隔4～8小时照蛋一次，随时取出72小时以内死亡的鸡胚，置4～8℃冷却。将冷却4～24小时的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部，以无菌手术除去蛋壳，收取病变鸡胚绒毛***、胚液（尿囊液及羊水）、胎儿，每若干个鸡胚混为一组，高速匀浆制成悬液，置于灭菌容器中，加入适量抗生素室温作用1～2小时，留样后置-15℃结冻保存。经检验无菌和病毒含量测定每1ml应≥10^7.5ELD₅₀，方可用于配苗。

配苗及分装：取出检验合格的鸡胚组织抗原解冻、称重，先加入适量保护剂于同一容器内混合、过滤，扣除残渣量，依实际滤过组织量加入余量保护剂。再加入适宜抗生素，充分混匀，定量分装，然后迅速置入预冷的冻干机箱体内，按本发明优选的冻干曲线进行冷冻真空干燥。

试验制品主要技术参数和检验方法：

制品的物理性状、剩余水分测定和真空度测定按现行《中华人民共和国兽药典》（二○一○年版）附录的方法及标准进行。

病毒含量测定方法及标准：

病毒含量测定按瓶签注明的羽份，将疫苗用灭菌生理盐水稀释至1羽份/0.1ml，再作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-53个稀释度，分别尿囊腔内接种8～9日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～120小时死亡的鸡胚，随时取出，计算ELD₅₀。每羽份疫苗中的病毒含量应不低于10^4.3ELD₅₀。

5%蔗糖脱脂奶作为常规冻干保护剂对照。

将试验制品置于-15℃、2～8℃、37℃条件下保存，不同时间取样测定病毒含量。

本发明的新型冻干保护剂是由重量百分比计的以下组分组成：海藻糖2%～5%、葡萄糖1%～3%、甘氨酸3%～8%、D-山梨醇1%～3%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP-k30）1%～3%、明胶0.8%～1.2%，注射用水补足至100%；。

将上述新型冻干保护剂组份的海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、D-山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP-k30）、明胶等成分按各自比例溶于注射用水，为完全溶解上述物质可采用水浴加温搅拌方式，直至溶液透明，再分装至适当容器后置116℃高压灭菌30min，备用。

将上述灭菌后的新型冻干保护剂与鸭病毒性肝炎抗原液以1:1的体积比混合、分装至7ml西林瓶中，每瓶2～4ml，用丁基胶三叉塞半加塞后置入预冷至5℃的冻干机箱体内,以0.5℃～1℃/min的速度将温度降至-45℃，维持4～6小时使疫苗冻实,抽真空至5Pa后，再以1℃/min的速度将温度升至15℃，在此温度下维持12～15小时，接着以0.5℃/min的速度升温至25℃维持2小时，再以0.5℃/min的速度升温至32℃，维持6小时加塞出箱。冻干全程为26～30小时，冻干后的鸭病毒性肝炎活疫苗每羽份病毒含量应≥10^4.3LD₅₀。

附图说明

图1真空冷冻干燥曲线示意图。如图所示，分装后的疫苗进入预冷至5℃的冻干机箱体内,以0.5℃～1℃/min的速度将温度降至-45℃，维持4～6小时使疫苗冻实,抽真空至5Pa后，再以1℃/min的速度将温度升至15℃，在此温度下维持12～15小时，接着以0.5℃/min的速度升温至25℃维持2小时，再以0.5℃/min的速度升温至32℃，维持6小时加塞出箱。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及的微生物资源为鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus）A66株[本发明人于1986年由我国安徽分离到的鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus）A株经SPF鸡胚连续传代致弱获得]，该株鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus）已于2013年08月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.8020。

本发明的积极意义

实施例

下面结合具体的实施方式对本发明作进一步详细说明，本实施例不对本发明构成限制。

实施例1

——鸭病毒性肝炎活疫苗（A66株）抗原制备

取生产用鸭肝炎病毒A66株毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，接种发育良好的9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.2ml，封孔后，置36～37℃继续孵育，弃36小时前死亡的鸡胚。36小时后，每隔4～8小时照蛋一次，随时取出72小时以内死亡的鸡胚，置4～8℃冷却。将冷却4～24小时的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部，以无菌手术除去蛋壳，收取病变鸡胚绒毛***、胚液（尿囊液及羊水）、胎儿，每若干个鸡胚混为一组，高速匀浆制成悬液，置于灭菌容器中，加入适量抗生素室温作用1～2小时，留样后置-15℃结冻保存。经检验无菌和病毒含量测定每1ml应≥10^7.5ELD₅₀。

实施例2

——保护剂的配制及疫苗制备（1）

新型冻干保护剂重量百分比计的以下组分组成：海藻糖2、葡萄糖1%、甘氨酸3%、D-山梨醇1%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP-k30）1%、明胶0.8%，余量为注射用水。完全溶解上述物质，经116℃高压灭菌30min。

取新型冻干保护剂及用于对照的5%蔗糖脱脂牛奶保护剂，分别与检验合格的鸭病毒性肝炎抗原液以1:1的体积比混合、分装至7ml西林瓶中，每瓶2ml，用丁基胶三叉塞半加塞后置入预冷至5℃的冻干机箱体内,以0.5℃/min的速度将温度降至-45℃，维持4小时使疫苗冻实,抽真空至5Pa后，再以1℃/min的速度将温度升至15℃，在此温度下维持12小时，接着以0.5℃/min的速度升温至25℃维持2小时，再以0.5℃/min的速度升温至32℃，维持6小时加塞出箱。冻干全程约为26小时。

实施例3

——保护剂的配制及疫苗制备（2）

新型冻干保护剂重量百分比计的以下组分组成：海藻糖3.5%、葡萄糖2%、甘氨酸5.5%、D-山梨醇2%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP-k30）2%、明胶1%，加注射用水至100%。完全溶解上述物质，经116℃高压灭菌30min。

取新型冻干保护剂及用于对照的5%蔗糖脱脂牛奶保护剂，分别与检验合格的鸭病毒性肝炎抗原液以1:1的体积比混合、分装至7ml西林瓶中，每瓶3ml，用丁基胶三叉塞半加塞后置入预冷至5℃的冻干机箱体内,以0.75℃/min的速度将温度降至-45℃，维持5小时使疫苗冻实,抽真空至5Pa后，再以1℃/min的速度将温度升至15℃，在此温度下维持13.5小时，接着以0.5℃/min的速度升温至25℃维持2小时，再以0.5℃/min的速度升温至32℃，维持6小时加塞出箱。冻干全程约为28小时。

实施例4

——保护剂的配制及疫苗制备（3）

新型冻干保护剂重量百分比计的以下组分组成：海藻糖5%、葡萄糖3%、甘氨酸8%、D-山梨醇3%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP-k30）3%、明胶1.2%，余量为注射用水。完全溶解上述物质，经116℃高压灭菌30min。

取新型冻干保护剂及用于对照的5%蔗糖脱脂牛奶保护剂，分别与检验合格的鸭病毒性肝炎抗原液以1:1的体积比混合、分装至7ml西林瓶中，每瓶4ml，用丁基胶三叉塞半加塞后置入预冷至5℃的冻干机箱体内,以1℃/min的速度将温度降至-45℃，维持6小时使疫苗冻实,抽真空至5Pa后，再以1℃/min的速度将温度升至15℃，在此温度下维持15小时，接着以0.5℃/min的速度升温至25℃维持2小时，再以0.5℃/min的速度升温至32℃，维持6小时加塞出箱。冻干全程约为30小时。

实施例5

——冻干制品的检测

表1冻干制品的物理性状、剩余水分测定和真空度测定结果

*用真空测定器测定产品均呈现乳白色辉光，符合中华人民共和国兽药典的相关规定（中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部.中国农业出版社2011年）。

表2冻干制品于-15℃条件下保存，不同时间取样测定病毒含量测定结果

表3冻干制品于2～8℃条件下保存，不同时间取样测定病毒含量测定结果

表4冻干制品于37℃条件下保存，不同时间取样测定病毒含量测定结果

从试验结果显示，5%蔗糖脱脂奶保护剂疫苗冻干前、后毒价损失较大，超过2个滴度，而本发明的新型冻干保护剂疫苗冻干前、后毒价损失较小，不超过1个滴度，表明本发明的新型保护剂对鸭肝炎病毒在冻干过程中具有良好的保护作用。

试验结果还显示，5%蔗糖脱脂奶保护剂冻干的鸭肝炎疫苗在-15℃条件下只能保存12个月，在2～8℃条件下保存12个月，37℃条件下保存3天病毒毒价损失超过1个滴度；而本发明的新型保护剂冻干的鸭肝炎疫苗在-15℃和2～8℃条件下保存均达24个月以上，37℃条件下保存10天病毒毒价损失在1个滴度范围内，表明使用本发明的新型冻干保护剂制备的鸭病毒性肝炎活疫苗在2～8℃条件下具有较好的稳定性。

实施例6

——疫苗的相关试验

在鸭病毒性肝炎活疫苗(A66)临床试验申请获得农业部兽用生物制品临床试验批准（批件号：200844）后，我们及时按照批准的临床试验方案开展工作。自2009年2月至6月，在5个鸭场应用5个批次按本发明所述新型保护剂制备的疫苗产品进行临床试验，试验共计免疫雏鸭5.9万羽。经临床观察、攻毒试验、抗体检测及生产性能的统计，结果表明：鸭病毒性肝炎活疫苗(A66)对免疫雏鸭安全、有效、无不良反应。

3临床试验使用疫苗的批号、数量，见下表5。

表5试验使用的鸭肝炎（A66）活疫苗

疫苗批号	规格	使用羽份	使用鸭场	鸭的品种
					070901	1000羽/瓶	12000	1	樱桃谷肉鸭（SM3）
070902	1000羽/瓶	8000	2	高邮鸭（肉蛋兼用）
					70903	1000羽/瓶	12000	3	樱桃谷肉鸭（SM3）
071004	1000羽/瓶	15000	4	樱桃谷肉鸭（SM3）
					071005	1000羽/瓶	12000	5	巢湖麻鸭（肉蛋兼用）

表6五个试验鸭场试验安排基本情况

注：每批疫苗另分别安排100只雏鸭使用1/10羽份和10羽份剂量注射免疫。

1.临床观察情况

在五个试验场，无论是采取注射免疫或是饮水免疫的试验鸭，免疫5天内鸭群精神状况正常，无聚集、蜷缩、打堆现象，采食、饮水正常，死、淘情况正常；对每批疫苗注射免疫和饮水免疫的鸭群，在免疫后5天时分别随机取10只小鸭进行解剖，注射免疫的接种部位和肝、脾、肺、心、消化道和脑部均未见病变和异常，随机取大剂量（10倍免疫剂量）注射免疫组5只鸭剖检观察亦无异常。

在试验观察期间（至42日龄），1号鸭场试验鸭群和对照鸭群15日龄时出现发病和死亡增加情况，经临床和实验室诊断为大肠杆菌病，经药敏试验后选择恩诺沙星饮水给药治疗5天，康复；3号鸭场非免疫对照鸭群8日龄时出现突然死亡病例，经临床和实验室诊断为鸭病毒性肝炎，当天下午对该鸭群采取4倍免疫剂量皮下注射方法进行紧急预防接种，3天后死亡停止，康复；2、4和5号三个试验场免疫鸭群与非免疫对照鸭群至42日龄时，鸭群精神状况、采食、饮水、死淘及生长发育情况均正常。每批疫苗分别安排的100只雏鸭小剂量免疫（1/10推荐免疫剂量）和大剂量（10倍推荐免疫剂量）注射免疫，至42日龄时未发生鸭肝炎和其他不良反应。

临床试验观察结果表明，鸭病毒性肝炎活疫苗(A66)采用注射（皮下或肌肉）和饮水免疫对雏鸭安全，对生长发育无不良反应，对临床发生的鸭病毒性肝炎的紧急预防有良好效果。

2.攻毒试验结果

对每个批次的试验鸭群在疫苗免疫后5天随机选择10只，同时随机抽取10只同批非免疫对照鸭，带回实验室进行攻毒试验。用鸭肝炎病毒强毒W株，按每只鸭1000LD₅₀的剂量进行攻毒试验，结果免疫试验组（注射免疫和饮水免疫）攻毒保护率均达80%以上，非免疫对照组攻毒死亡率80%以上，表明鸭病毒性肝炎活疫苗(A66)免疫效果确实。各批次疫苗临床免疫攻毒试验结果见表7。

表75批疫苗临床试验免疫攻毒保护结果

3.免疫抗体测定

对五鸭场的试验鸭群，按不同免疫途径分别于疫苗免疫后7、14、28、42天随机选择采集10只鸭血样，同批非免疫对照组5只鸭血样，分离血清后取等量组内混合，采用鸡胚中和试验方法测定抗体。试验采用固定病毒稀释血清的方法，将DHV A66用生理盐水配制成200ELD₅₀/0.1ml，血清用生理盐水（含青、链霉素各1000单位/ml）作倍比稀释后与等量病毒液混合，置37℃作用1h。每个稀释度分别接种9日龄SPF鸡胚5个，每胚接种0.2ml，置37℃继续孵育120h，用Reed-Muench法计算鸭肝炎抗体中和效价。结果表明：雏鸭接受鸭肝炎疫苗免疫（无论注射免疫或饮水免疫），免疫后7天抗体水平明显高于非免疫鸭，免疫后4～6周免疫鸭群抗体滴度维持在高峰水平，能保护雏鸭度过鸭肝炎感染年龄段。因此，从免疫中和抗体的角度证实鸭病毒性肝炎活疫苗(A66)具有良好的免疫原性，各批次疫苗临床免疫鸭群抗体水平动态检测结果见表8。

表85批疫苗免疫雏鸭抗体水平动态测定结果

4.生产性能统计

5个临床试验鸭场对试验鸭群临床试验过程中的死淘率、料肉比、增重等生产性能等进行统计汇总，从统计结果可以看出，鸭病毒性肝炎活疫苗（A66）对死淘率、料肉比、增重等生产性能无影响。各试验鸭场试验鸭群生产性能统计结果见表9。

表95批疫苗临床试验鸭群至42日龄时生产性能统计汇总结果

小结：5个鸭场免疫1～3日龄雏鸭5.9万羽进行了临床试验结果表明：无论注射免疫或是饮水免疫的鸭群无不良反应，鸭群精神状况、采食、饮水均正常，鸭群的死淘率、肉料比、增重及生长发育情况均正常，试验过程中免疫试验鸭群未发生鸭病毒性肝炎。通过临床观察、实验室抗体测定和攻毒试验及生产性能的统计，结果证明鸭病毒性肝炎(A66)活疫苗安全、有效。

Claims

1.一种鸭病毒性肝炎活疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，处方为：各组分重量体积百分比为：海藻糖2％～5％、葡萄糖1％～3％、甘氨酸3％～8％、D-山梨醇1％～3％、聚乙烯吡咯烷酮1％～3％、明胶0.8％～1.2％，注射用水补足至100％；

配制方法为：将海藻糖、葡萄糖、甘氨酸、D-山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶按处方比例称取混合后溶于注射用水，置116℃高压灭菌30min。

2.根据权利要求1所述的冻干保护剂的应用，其特征在于该保护剂适宜于对冻干敏感的微RNA病毒科病毒的冻干保护。

3.根据权利要求1所述的冻干保护剂的应用，其特征在于该保护剂适宜于在鸭病毒性肝炎活疫苗中的应用。

4.如权利要求3所述的冻干保护剂的应用，其特征在于所述保护剂在鸭病毒性肝炎活疫苗中的应用，是该冻干保护剂与鸭病毒性肝炎抗原液以1:1的体积比混合、分装，采用相应的冻干曲线进行真空冷冻干燥即得鸭病毒性肝炎活疫苗。

5.如权利要求4所述的冻干保护剂的应用，其特征在于采用的冻干曲线为：分装后的制品置入预冷至5℃的冻干机箱体内,以0.5℃～1℃/min的速度将温度降至-45℃，维持4～6小时使疫苗冻实,抽真空至5Pa后，再以1℃/min的速度将温度升至15℃，在此温度下维持12～15小时，接着以0.5℃/min的速度升温至25℃维持2小时，再以0.5℃/min的速度升温至32℃，维持6小时加塞出箱，冻干全程为26～30小时，冻干后的鸭病毒性肝炎活疫苗每羽份病毒含量应≥10^4.3LD₅₀。