CN103409499A

CN103409499A - 一种钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌lamp检测方法

Info

Publication number: CN103409499A
Application number: CN2013101182727A
Authority: CN
Inventors: 王红宁; 程菡; 张安云; 雷昌伟; 刘必慧; 杨帆; 夏青青; 管中斌
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2013-04-08
Filing date: 2013-04-08
Publication date: 2013-11-27

Abstract

本发明公开了一种钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法。所述方法中包括LAMP反应优化的专用引物、所需试剂及反应条件。本方法中所述2对LAMP专用引物根据沙门氏菌保守序列fimY基因设计。本发明采用优化配制的钙黄绿素MnCl2混合溶液作为荧光指示剂，反应前加入LAMP反应体系，一步反应后无需开盖，可直接肉眼准确判断结果。本方法反应高效快速，具有操作简便、成本低廉、特异性好、通用性广、灵敏度高的特点，可在养殖生产单位、基层医疗单位、实验室日常检测等推广，具有广泛的应用前景和良好的经济效益。

Description

一种钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法，涉及一种利用环介导等温扩增技术的沙门氏菌检测方法。

背景技术

沙门氏菌（Salmonella）是肠杆菌科中一种重要的人畜共患、革兰氏阴性病原菌。动物源性沙门氏菌易引起摄食者急性腹泻，甚至暴发食物中毒，导致胃肠炎、伤寒及副伤寒，其中肉类和家禽类是沙门氏菌传播的主要媒介。近年来，沙门氏菌在全球范围内引起的危害呈不断上升趋势，公共卫生学上，具有十分重要的意义。

由于沙门氏菌血清型繁多，各类生化反应复杂，目前已经建立了多种沙门氏菌检测方法，如传统培养法、酶联免疫法、生物传感器技术、核酸扩增技术，但这些方法或程序繁琐、耗时费力，或特异性低，或敏感性差，或成本昂贵等，不适用于现场快速检测及基层普及应用。

2000年，日本学者Notomi等发明了一种全新的核酸扩增方法——环介导等温扩增技术(LAMP，loop-mediatedisothermalamplification)。该法在等温条件下(60℃—65℃)就能完成扩增反应，它可以在1h以内恒温条件下特异地扩增DNA到10⁹个拷贝，在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强反应的特异性，缩短检测时间，降低成本。自发展以来，广泛应用于各种细菌病毒的检测中。2004年，Yoshikawa等分别采用 LAMP和 PCR 2种方法进行 HHV-7 DNA扩增，采用焦磷酸镁浊度检测法时，测得30 min的LAMP反应的灵敏度为每管500拷贝，而 60 min的 LAMP反应的灵敏度为每管250拷贝，其中仅底物为 HHV-7 DNA的反应中生成了 LAMP产物，而在另外的底物均不能发生LAMP反应。2009年，Wataru Yamazaki等首次报道了鸡肉中不同弯曲杆菌的LAMP检测方法。对144份分离自鸡肉的空肠弯曲杆菌Preston富集肉汤培养后分别进行LAMP检测和传统培养检测。与传统培养检测方法相比，LAMP检测敏感性和特异性分别为98.5% 和97.4% ，阳性和阴性符合率分别为97.1%和 98.7%。从菌株的分离到鉴定，传统方法需要3-4天，LAMP方法大大缩短时间，从DNA的提取到鉴定需要90min，从菌株分离到鉴定总共需要24小时。2008年，Li Wang等设计一对外引物和一对内引物，特异识别沙门氏菌靶基因invA的6个特定区域。65℃等温条件下扩增出241bp的目标DNA序列，经琼脂电泳后形成特异梯度条带。目前应用LAMP检测沙门氏菌多以invA作为目的基因设计引物，存在invA特异性引物扩增产生了非沙门氏菌的非特异性扩增片段的局限性。LAMP检测方法在体系反应完成后判定结果，有四种方法：一是采用肉眼直接判断浑浊法，由于浊度不一，该方法主观性因素影响较大，不能准确判断；二是体系反应完毕后加入SYBRGreenⅠ、HNB等荧光染料作为反应指示剂，由于SYBRGreenⅠ、HNB等影响LAMP反应效率，故必须反应后开盖加入；三是体系反应完毕后开盖进行琼脂糖凝胶电泳检测，产生梯度条带即发生阳性反应。第二、三种方法由于LAMP高效率扩增，使得反应后开盖容易带来气溶胶污染，造成假阳性干扰。四是采用浊度仪实时检测浊度，判断反应结果，使用浊度仪价格昂贵，且操作相对复杂。

发明内容

本发明内容之一是提供一种特异性好、灵敏度高和通用性强的用于检测沙门氏菌的LAMP专用引物。

本发明提供的沙门氏菌LAMP专用引物是根据核苷酸序列表1中所示的沙门氏菌特异性保守序列fimY基因设计的，用于定性检测多种待测样品中的不同血清型（肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等）沙门氏菌。

本发明用于沙门氏菌LAMP检测的引物由两对引物混合组成。第一对引物：引物1（F3），其核苷酸序列如序列表中序列2所示；引物2（B3），其核苷酸序列如序列表中序列3所示。第二对引物：引物3（FIP），其核苷酸序列如序列表中序列4所示；引物4（BIP），其核苷酸序列如序列表中序列5所示。

所述引物组合中2对引物（FIP和BIP）:（F3和B3）的摩尔比为8:1。

本发明内容之二是克服现有技术操作复杂、假阳性干扰等不足，提供一种准确、灵敏、快速、简便的钙黄绿素荧光可视化的沙门氏菌LAMP检测方法。

本发明提供的钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法，包括以下步骤：

（1）用缓冲蛋白胨水BPW及亚酸盐胱氨酸增菌液SC按照《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2010）对待检样品培养10~14小时。

（2）煮沸法从上述增菌液中提取基因组DNA，加入到含有上述专用引物的LAMP反应体系中64℃恒温反应1小时。

（3）反应后判断结果：反应后体系中钙黄绿素MnCl₂混合溶液由橘红色变为绿色荧光，表示存在沙门氏菌；反应前后没有颜色变化均为橘红色，表示没有沙门氏菌存在。

上述参与反应的样品包括：病死鸡组织样品、粪便、肉类等样品。上述25ul反应体系具体包括：引物FIP和BIP 0.8uM、F3和B3 0.1uM，待测样品DNA模板2ul，MgCl₂ 4mM，甜菜碱Betaine 0.8M，10×Thermpol 反应缓冲液 2.5 ul，钙黄绿素MnCl₂混合溶液2.5ul，dNTP 0.8mM，ddH₂O 2ul，Bst DNA聚合酶 320U/ml。

25ul反应体系中钙黄绿素MnCl₂混合溶液经过优化配制。由浓度为1mM的钙黄绿素溶液与4mM的MnCl₂溶液等体积混合得到，钙黄绿素溶液终浓度为50uM，MnCl₂溶液终浓度为200 uM。该荧光指示剂不影响LAMP反应，反应前加入体系中，一步反应后直接根据颜色变化判断结果，避免了开盖后加入荧光指示剂带来的假阳性干扰。

采用以上方案，本发明具有以下优点：

（1）有效避免假阳性干扰：反应前在体系中加入钙黄绿素MnCl₂混合溶液荧光指示剂，不影响扩增效率，既可肉眼观看反应结果，又避免了开盖后加入染料带来的气溶胶污染，从而有效避免假阳性干扰。

（2）特异性好、通用性强：本发明以沙门氏菌fimY保守序列设计并最终筛选出了2对最佳引物，能够准确排除其它生理生化相似的肠杆菌科细菌的干扰，对多种不同血清型沙门氏菌（肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等）均能有效扩增。

（3）结果鉴定准确、便捷：采用本发明优化配制的最佳浓度比例的钙黄绿素MnCl₂混合溶液，阴性及阳性反应颜色区分明显，可准确判断结果。

（4）高灵敏度：钙黄绿素荧光检测结果的灵敏度与PCR电泳检测方法相当，荧光定量PCR仪检测结果的灵敏度略高，是钙黄绿素荧光检测和PCR电泳检测灵敏度的10倍。

（5）操作简便：只需用煮沸法裂解细菌提取基因组DNA，然后加入到反应体系中，64℃恒温水浴锅中一步反应1小时即可肉眼判定结果。

（6）快速、高效扩增：整个反应1小时内即可完成，反应效率明显高于PCR。

（7）综上所述，本发明不需要复杂仪器和操作，可以在恒温水浴中高效、快速、特异、灵敏地检测沙门氏菌，结果判定简便可视化。可用于畜牧养殖生产单位、实验室日常检测、医疗基层单位等筛查和检测沙门氏菌，显示出广阔的应用前景和较大的经济效益。

（8）接下来结合实例对本发明的具体实施方式做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的特异性检测结果。

图2为本发明钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的通用性检测结果。

图3为本发明钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的灵敏度检测结果。

图4为沙门氏菌PCR电泳检测方法的灵敏度检测结果。

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下实施进行，具体实施方式中，未特别说明，均为常规方法，接下来就具体事例进行详细阐述。

实施1、沙门氏菌LAMP检测方法的特异引物设计

从美国基因序列数据库Genbank中，检索下载所有沙门氏菌fimY基因，通过Blast软件进行同源性分析，得到一段381bp的沙门氏菌特异性保守fimY序列（Genbank 号：AM933172.1，详细序列见核苷酸序列表1）作为靶序列，利用 PrimerExplorer V4软件 (日本荣研株式会社)自行设计引物。4条引物中2条为内引物(FIP和BIP)，2条为外引物(F3和B3)。内引物FIP包含F1区域的互补序列和F2序列，即F1c-F2；内引物BIP包含B1c序列和B2区域的互补序列，即B1c-B2。外引物F3和B3分别位于F2和B2的区域外。具体序列见核酸序列表2~表5。

实施2、沙门氏菌基因组DNA模板的制备

采用煮沸法提取基因组DNA，具体方法如下：

（1）取1ml 37℃ 10~14小时培养的菌液于1.5ml Eppendorf管中，5000rpm离心5min，弃上清，双蒸水洗涤2次，

（2）沉淀悬浮于50ul双蒸水，枪头吹打混匀后，沸水中煮10 min，

（3）立即取出Eppendorf管，放置于-80℃冰冻15 min，

（4）立即取出Eppendorf管，沸水中煮1 min，10000rpm离心3min，取上清，-20℃保存备用。

实施3、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的建立

一、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的初步建立

初始反应体系为：沙门氏菌特异性保守序列fimY基因的2对引物FIP和BIP 0.8uM、F3和B3 0.1uM，待测样品基因组DNA模板2ul，MgCl₂ 3mM，甜菜碱Betaine 0.4M，10×Thermpol 反应缓冲液2.5ul，10×SYBRGreenⅠ2.5ul，dNTP 0.6mM，ddH₂O 5.5ul，Bst DNA聚合酶 320U/ml。初始反应条件是：63℃恒温反应1小时。由于LAMP反应体系和反应条件的优化采用荧光定量PCR仪实时检测荧光进行分析，故初始反应体系中的荧光染料为可用于IQ^TM5荧光定量PCR仪光学***检测荧光的SYBRGreenⅠ荧光染料。

二、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法最佳反应体系及反应条件的建立

IQ^TM5荧光定量PCR仪光学***可替代浊度仪通过实时检测SYBR GreenⅠ荧光进行LAMP反应效率检测，本发明沙门氏菌LAMP检测方法采用IQ^TM5荧光定量PCR仪光学***进行反应体系和反应条件优化。依次对Mg²⁺（2uM、3uM、4uM、5uM、6uM）、甜菜碱Betaine（0M、0.4M、0.8M、1.2M）、dNTP（0.6mM、0.8mM、1 mM、1.2 mM、1.4 mM）、Bst DNA聚合酶（224U/ml、256U/ml、288 U/ml、320 U/ml、352 U/ml）浓度梯度以及反应温度（60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃）梯度进行优化，确定最佳反应体系为：沙门氏菌特异性保守序列fimY基因的2对引物FIP和BIP 0.8uM、F3和B3 0.1uM，待测样品DNA模板2ul，MgCl₂ 4mM，甜菜碱Betaine 0.8M，10×Thermpol 反应缓冲液 2.5 ul，10×SYBR GreenⅠ2.5ul，dNTP 0.8mM，ddH₂O 2ul，Bst DNA聚合酶 320U/ml。最佳反应条件是：64℃恒温反应1小时。由于实际应用中采用肉眼可视化判定反应结果，故在荧光定量PCR仪检测已确定好的反应体系基础上，将体系中的10×SYBRGreenⅠ替换成钙黄绿素MnCl₂混合溶液，并对钙黄绿素溶液（0.50mM、1mM）和MnCl₂溶液（1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10 mM）不同浓度等体积混合进行优化，得到钙黄绿素（1mM）和MnCl₂溶液（4mM）等体积混合后，为最佳荧光指示剂。确定钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的最佳反应体系为：沙门氏菌特异性保守序列fimY基因的2对引物FIP和BIP 0.8uM、F3和B3 0.1uM，待测样品DNA模板2ul，MgCl₂ 4mM，甜菜碱Betaine 0.8M，10×Thermpol 反应缓冲液 2.5 ul，钙黄绿素MnCl₂混合溶液2.5ul，dNTP 0.8mM，ddH₂O 2ul，Bst DNA聚合酶320U/ml。最佳反应条件是：64℃恒温反应1小时。

实施4、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法特异性检测

选取与沙门氏菌生理生化特征相似的肠杆菌科细菌（沙雷氏菌、大肠杆菌、变形杆菌、志贺氏菌、铜绿假单胞杆菌、克雷伯氏菌）煮沸法提取基因组DNA。以肠炎沙门氏菌基因组DNA为阳性对照，以双蒸水为阴性对照，根据实施3中最佳反应体系和反应条件进行LAMP反应。

钙黄绿素荧光显色检测结果为只有肠炎沙门氏菌LAMP反应液由橘红色变为绿色荧光，表明具有阳性扩增；其它肠杆菌科细菌以及阴性对照反应前后LAMP反应液均为橘红色，无颜色变化，表明未出现阳性扩增。具体见图1，其中1—8分别为肠炎沙门氏菌阳性对照、沙雷氏菌、大肠杆菌、变形杆菌、志贺氏菌、铜绿假单胞杆菌、克雷伯氏菌、双蒸水阴性对照。

实施5、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法通用性检测

选取7种不同常见血清型沙门氏菌（肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌）煮沸法提取基因组DNA。以双蒸水为阴性对照，根据实施3中最佳反应体系和反应条件进行LAMP反应。

钙黄绿素荧光显色检测结果为7种不同血清型沙门氏菌LAMP反应液均由橘红色变为绿色荧光，表明均具有阳性扩增；阴性对照反应前后LAMP反应液为橘红色，无颜色变化，表明未出现阳性扩增。具体见图2，其中1—8分别为肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、双蒸水阴性对照。

实施6、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法灵敏度检测

煮沸法提取肠炎沙门氏菌标准菌株基因组DNA，并进行10倍梯度稀释，分别得到浓度为442ng/ul、44.2ng/ul、4.42ng/ul、442pg/ul、44.2pg/ul、4.42pg/ul、0.442pg/ul、0.0442pg/ul的肠炎沙门氏菌基因组DNA。将不同梯度DNA浓度根据实施3中最佳反应体系和反应条件进行LAMP反应。

钙黄绿素荧光显色检测结果为442ng/ul—4.42pg/ul的肠炎沙门氏菌LAMP反应液均变为绿色荧光，0.442pg/ul、0.0442pg/ul的浓度LAMP反应液未出现颜色变化，均为橘红色。具体见图3，其中1—9浓度分别为442ng/ul、442ng/ul、44.2ng/ul、4.42ng/ul、442pg/ul、44.2pg/ul、4.42pg/ul、0.442pg/ul、0.0442pg/ul。

实施7、沙门氏菌PCR检测灵敏性检测

选取实施6中442ng/ul—0.0442pg/ul浓度的肠炎沙门氏菌基因组DNA，以双蒸水为阴性对照，进行PCR。25ul反应体系为：Taq MasterMix 12.5ul，引物F3和B3各1ul，DNA模板2ul，双蒸水2ul。反应条件为：95℃/5min；95℃/30s，56℃/30s，72℃/45s；72℃/10min，30个循环。

反应后进行琼脂糖凝胶电泳，与预期目标相符，442ng/ul—4.42pg/ul浓度的肠炎沙门氏菌在250bp附近有条带，且亮度逐渐减弱，0.442pg/ul、0.0442pg/ul浓度无条带。具体见图4，其中1—9浓度分别为442ng/ul、44.2ng/ul、4.42ng/ul、442pg/ul、44.2pg/ul、4.42pg/ul、0.442pg/ul、0.0442pg/ul，M为Tranks2K plus DNA Marker。表明，沙门氏菌LAMP钙黄绿素荧光显色检测与PCR灵敏度相当，荧光定量PCR仪检测的灵敏度略高于前两者。

核苷酸序列表

[0041]

Figure 2013101182727100002DEST_PATH_IMAGE001

序列表

<1>1

<2>381

<3>DNA

<4>人工序列

<5>

<6>

<7>1

tgtggggaaggttaaggagggtgataagttgtttaagccggtaaactacacgatgataaggtacgctttgctgacgtgct

atttcttttaaagaggcaccttgcgctaaagtttcaatcatcaaccagtcagtacggctaaagctttccgataagcgagg

tttggcggctgataacaaggcttcgcgtacagaggccagattttgtcgtcgcgacagaacaaaaaaacgcccagccatac

ggataaactgtgttatagcgggggttttatctgataccagcaggtaaatctggatatcgctttgttgccaactgagcgcg

cgtagctggttaagcgcctcaatacaggagacaggtagcgcctccatatctacaatcagtt

<8>2

<9>20

<10>DNA

<11>人工序列

<12>

<13>

<14>2

gggaaggttaaggagggtga

<15>3

<16>20

<17>DNA

<18>人工序列

<19>

<20>

<21>3

gctgggcgtttttttgttct

<22>4

<23>42

<24>DNA

<25>人工序列

<26>

<27>

<28>4

actttagcgcaaggtgcctcttagccggtaaactacacgatg

<29>5

<30>42

<31>DNA

<32>人工序列

<33>

<34>

<35>5

ttccgataagcgaggtttggcgcgacaaaatctggcctctgt

Claims

1.用于沙门氏菌LAMP检测的专用引物，是根据沙门氏菌特异保守序列fimY基因（见核苷酸序列表1）设计的引物组合，用于定性检测不同血清型（肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等）沙门氏菌。

2.权利要求1中所要求的引物组合中包含2对专用引物，各引物对（FIP和BIP）:（F3和B3）的摩尔比为8:1。

3.具体的2对引物序列见核苷酸序列表2~表5。

4.一种钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法，包括以下步骤：

（1）用缓冲蛋白胨水BPW及亚酸盐胱氨酸增菌液SC按照《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2010）培养待检样品10~14小时；

（2）煮沸法从上述增菌液中提取细菌基因组DNA，加入到含有上述引物的LAMP反应体系中64℃恒温反应1小时，同时以肠炎沙门氏菌作阳性和双蒸水作阴性对照；

（3）反应后判断结果：反应后体系中的钙黄绿素MnCl₂混合溶液由橘红色变为绿色荧光，表示存在沙门氏菌；反应前后没有颜色变化，都为橘红色，表示没有沙门氏菌存在。

5.根据权利要求4所述，本发明钙黄绿素荧光可视化LAMP检测方法的特征之一是参与反应的样品包括病死鸡组织样品、粪便、肉类等样品。

6.根据权利要求4、5所述，本发明钙黄绿素荧光可视化LAMP检测方法的特征之二是上述25ul反应体系具体包括：引物FIP和BIP 0.8uM、F3和B3 0.1uM，待测样品DNA模板2ul，MgCl₂ 4mM，甜菜碱Betaine0.8M，10×Thermpol反应缓冲液2.5 ul，钙黄绿素MnCl₂混合溶液2.5ul，dNTP0.8mM，ddH₂O 2ul，BstDNA聚合酶320U/ml。

7.根据权利要求4、5、6所述，本发明钙黄绿素荧光可视化LAMP检测方法的特征之三是优化配制钙黄绿素MnCl₂混合溶液作为荧光指示剂，反应前加入体系。

8.根据权利要求7所述，钙黄绿素MnCl₂混合溶液由浓度为1mM的钙黄绿素溶液与4mM的MnCl₂溶液等体积混合得到，钙黄绿素溶液终浓度为50uM，MnCl₂溶液终浓度为200 uM。