CN103409499A - 一种钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌lamp检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法。所述方法中包括LAMP反应优化的专用引物、所需试剂及反应条件。本方法中所述2对LAMP专用引物根据沙门氏菌保守序列fimY基因设计。本发明采用优化配制的钙黄绿素MnCl2混合溶液作为荧光指示剂,反应前加入LAMP反应体系,一步反应后无需开盖,可直接肉眼准确判断结果。本方法反应高效快速,具有操作简便、成本低廉、特异性好、通用性广、灵敏度高的特点,可在养殖生产单位、基层医疗单位、实验室日常检测等推广,具有广泛的应用前景和良好的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法,涉及一种利用环介导等温扩增技术的沙门氏菌检测方法。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中一种重要的人畜共患、革兰氏阴性病原菌。动物源性沙门氏菌易引起摄食者急性腹泻,甚至暴发食物中毒,导致胃肠炎、伤寒及副伤寒,其中肉类和家禽类是沙门氏菌传播的主要媒介。近年来,沙门氏菌在全球范围内引起的危害呈不断上升趋势,公共卫生学上,具有十分重要的意义。
由于沙门氏菌血清型繁多,各类生化反应复杂,目前已经建立了多种沙门氏菌检测方法,如传统培养法、酶联免疫法、生物传感器技术、核酸扩增技术,但这些方法或程序繁琐、耗时费力,或特异性低,或敏感性差,或成本昂贵等,不适用于现场快速检测及基层普及应用。
2000年,日本学者Notomi等发明了一种全新的核酸扩增方法——环介导等温扩增技术(LAMP,loop-mediatedisothermalamplification)。该法在等温条件下(60℃—65℃)就能完成扩增反应,它可以在1h以内恒温条件下特异地扩增DNA到109个拷贝,在保持PCR技术优点的基础上,进一步增强反应的特异性,缩短检测时间,降低成本。自发展以来,广泛应用于各种细菌病毒的检测中。2004年,Yoshikawa等分别采用 LAMP和 PCR 2种方法进行 HHV-7 DNA扩增,采用焦磷酸镁浊度检测法时,测得30 min的LAMP反应的灵敏度为每管500拷贝,而 60 min的 LAMP反应的灵敏度为每管250拷贝,其中仅底物为 HHV-7 DNA的反应中生成了 LAMP产物,而在另外的底物均不能发生LAMP反应。2009年,Wataru Yamazaki等首次报道了鸡肉中不同弯曲杆菌的LAMP检测方法。对144份分离自鸡肉的空肠弯曲杆菌Preston富集肉汤培养后分别进行LAMP检测和传统培养检测。与传统培养检测方法相比,LAMP检测敏感性和特异性分别为98.5% 和97.4% ,阳性和阴性符合率分别为97.1%和 98.7%。从菌株的分离到鉴定,传统方法需要3-4天,LAMP方法大大缩短时间,从DNA的提取到鉴定需要90min,从菌株分离到鉴定总共需要24小时。2008年,Li Wang等设计一对外引物和一对内引物,特异识别沙门氏菌靶基因invA的6个特定区域。65℃等温条件下扩增出241bp的目标DNA序列,经琼脂电泳后形成特异梯度条带。目前应用LAMP检测沙门氏菌多以invA作为目的基因设计引物,存在invA特异性引物扩增产生了非沙门氏菌的非特异性扩增片段的局限性。LAMP检测方法在体系反应完成后判定结果,有四种方法:一是采用肉眼直接判断浑浊法,由于浊度不一,该方法主观性因素影响较大,不能准确判断;二是体系反应完毕后加入SYBRGreenⅠ、HNB等荧光染料作为反应指示剂,由于SYBRGreenⅠ、HNB等影响LAMP反应效率,故必须反应后开盖加入;三是体系反应完毕后开盖进行琼脂糖凝胶电泳检测,产生梯度条带即发生阳性反应。第二、三种方法由于LAMP高效率扩增,使得反应后开盖容易带来气溶胶污染,造成假阳性干扰。四是采用浊度仪实时检测浊度,判断反应结果,使用浊度仪价格昂贵,且操作相对复杂。
发明内容
本发明内容之一是提供一种特异性好、灵敏度高和通用性强的用于检测沙门氏菌的LAMP专用引物。
本发明提供的沙门氏菌LAMP专用引物是根据核苷酸序列表1中所示的沙门氏菌特异性保守序列fimY基因设计的,用于定性检测多种待测样品中的不同血清型(肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等)沙门氏菌。
本发明用于沙门氏菌LAMP检测的引物由两对引物混合组成。第一对引物:引物1(F3),其核苷酸序列如序列表中序列2所示;引物2(B3),其核苷酸序列如序列表中序列3所示。第二对引物:引物3(FIP),其核苷酸序列如序列表中序列4所示;引物4(BIP),其核苷酸序列如序列表中序列5所示。
所述引物组合中2对引物(FIP和BIP):(F3和B3)的摩尔比为8:1。
本发明内容之二是克服现有技术操作复杂、假阳性干扰等不足,提供一种准确、灵敏、快速、简便的钙黄绿素荧光可视化的沙门氏菌LAMP检测方法。
本发明提供的钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法,包括以下步骤:
(1)用缓冲蛋白胨水BPW及亚酸盐胱氨酸增菌液SC按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》(GB 4789.4—2010)对待检样品培养10~14小时。
(2)煮沸法从上述增菌液中提取基因组DNA,加入到含有上述专用引物的LAMP反应体系中64℃恒温反应1小时。
(3)反应后判断结果:反应后体系中钙黄绿素MnCl2混合溶液由橘红色变为绿色荧光,表示存在沙门氏菌;反应前后没有颜色变化均为橘红色,表示没有沙门氏菌存在。
上述参与反应的样品包括:病死鸡组织样品、粪便、肉类等样品。上述25ul反应体系具体包括:引物FIP和BIP 0.8uM、F3和B3 0.1uM,待测样品DNA模板2ul,MgCl2 4mM,甜菜碱Betaine 0.8M,10×Thermpol 反应缓冲液 2.5 ul,钙黄绿素MnCl2混合溶液2.5ul,dNTP 0.8mM,ddH2O 2ul,Bst DNA聚合酶 320U/ml。
25ul反应体系中钙黄绿素MnCl2混合溶液经过优化配制。由浓度为1mM的钙黄绿素溶液与4mM的MnCl2溶液等体积混合得到,钙黄绿素溶液终浓度为50uM,MnCl2溶液终浓度为200 uM。该荧光指示剂不影响LAMP反应,反应前加入体系中,一步反应后直接根据颜色变化判断结果,避免了开盖后加入荧光指示剂带来的假阳性干扰。
采用以上方案,本发明具有以下优点:
(1)有效避免假阳性干扰:反应前在体系中加入钙黄绿素MnCl2混合溶液荧光指示剂,不影响扩增效率,既可肉眼观看反应结果,又避免了开盖后加入染料带来的气溶胶污染,从而有效避免假阳性干扰。
(2)特异性好、通用性强:本发明以沙门氏菌fimY保守序列设计并最终筛选出了2对最佳引物,能够准确排除其它生理生化相似的肠杆菌科细菌的干扰,对多种不同血清型沙门氏菌(肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等)均能有效扩增。
(3)结果鉴定准确、便捷:采用本发明优化配制的最佳浓度比例的钙黄绿素MnCl2混合溶液,阴性及阳性反应颜色区分明显,可准确判断结果。
(4)高灵敏度:钙黄绿素荧光检测结果的灵敏度与PCR电泳检测方法相当,荧光定量PCR仪检测结果的灵敏度略高,是钙黄绿素荧光检测和PCR电泳检测灵敏度的10倍。
(5)操作简便:只需用煮沸法裂解细菌提取基因组DNA,然后加入到反应体系中,64℃恒温水浴锅中一步反应1小时即可肉眼判定结果。
(6)快速、高效扩增:整个反应1小时内即可完成,反应效率明显高于PCR。
(7)综上所述,本发明不需要复杂仪器和操作,可以在恒温水浴中高效、快速、特异、灵敏地检测沙门氏菌,结果判定简便可视化。可用于畜牧养殖生产单位、实验室日常检测、医疗基层单位等筛查和检测沙门氏菌,显示出广阔的应用前景和较大的经济效益。
(8)接下来结合实例对本发明的具体实施方式做进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的特异性检测结果。
图2为本发明钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的通用性检测结果。
图3为本发明钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的灵敏度检测结果。
图4为沙门氏菌PCR电泳检测方法的灵敏度检测结果。
具体实施方式
实施例在以本发明技术方案为前提下实施进行,具体实施方式中,未特别说明,均为常规方法,接下来就具体事例进行详细阐述。
实施1、沙门氏菌LAMP检测方法的特异引物设计
从美国基因序列数据库Genbank中,检索下载所有沙门氏菌fimY基因,通过Blast软件进行同源性分析,得到一段381bp的沙门氏菌特异性保守fimY序列(Genbank 号:AM933172.1,详细序列见核苷酸序列表1)作为靶序列,利用 PrimerExplorer V4软件 (日本荣研株式会社)自行设计引物。4条引物中2条为内引物(FIP和BIP),2条为外引物(F3和B3)。内引物FIP包含F1区域的互补序列和F2序列,即F1c-F2;内引物BIP包含B1c序列和B2区域的互补序列,即B1c-B2。外引物F3和B3分别位于F2和B2的区域外。具体序列见核酸序列表2~表5。
实施2、沙门氏菌基因组DNA模板的制备
采用煮沸法提取基因组DNA,具体方法如下:
(1)取1ml 37℃ 10~14小时培养的菌液于1.5ml Eppendorf管中,5000rpm离心5min,弃上清,双蒸水洗涤2次,
(2)沉淀悬浮于50ul双蒸水,枪头吹打混匀后,沸水中煮10 min,
(3)立即取出Eppendorf管,放置于-80℃冰冻15 min,
(4)立即取出Eppendorf管,沸水中煮1 min,10000rpm离心3min,取上清,-20℃保存备用。
实施3、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的建立
一、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的初步建立
初始反应体系为:沙门氏菌特异性保守序列fimY基因的2对引物FIP和BIP 0.8uM、F3和B3 0.1uM,待测样品基因组DNA模板2ul,MgCl2 3mM,甜菜碱Betaine 0.4M,10×Thermpol 反应缓冲液2.5ul,10×SYBRGreenⅠ2.5ul,dNTP 0.6mM,ddH2O 5.5ul,Bst DNA聚合酶 320U/ml。初始反应条件是:63℃恒温反应1小时。由于LAMP反应体系和反应条件的优化采用荧光定量PCR仪实时检测荧光进行分析,故初始反应体系中的荧光染料为可用于IQTM5荧光定量PCR仪光学***检测荧光的SYBRGreenⅠ荧光染料。
二、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法最佳反应体系及反应条件的建立
IQTM5荧光定量PCR仪光学***可替代浊度仪通过实时检测SYBR GreenⅠ荧光进行LAMP反应效率检测,本发明沙门氏菌LAMP检测方法采用IQTM5荧光定量PCR仪光学***进行反应体系和反应条件优化。依次对Mg2+(2uM、3uM、4uM、5uM、6uM)、甜菜碱Betaine(0M、0.4M、0.8M、1.2M)、dNTP(0.6mM、0.8mM、1 mM、1.2 mM、1.4 mM)、Bst DNA聚合酶(224U/ml、256U/ml、288 U/ml、320 U/ml、352 U/ml)浓度梯度以及反应温度(60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃)梯度进行优化,确定最佳反应体系为:沙门氏菌特异性保守序列fimY基因的2对引物FIP和BIP 0.8uM、F3和B3 0.1uM,待测样品DNA模板2ul,MgCl2 4mM,甜菜碱Betaine 0.8M,10×Thermpol 反应缓冲液 2.5 ul,10×SYBR GreenⅠ2.5ul,dNTP 0.8mM,ddH2O 2ul,Bst DNA聚合酶 320U/ml。最佳反应条件是:64℃恒温反应1小时。由于实际应用中采用肉眼可视化判定反应结果,故在荧光定量PCR仪检测已确定好的反应体系基础上,将体系中的10×SYBRGreenⅠ替换成钙黄绿素MnCl2混合溶液,并对钙黄绿素溶液(0.50mM、1mM)和MnCl2溶液(1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10 mM)不同浓度等体积混合进行优化,得到钙黄绿素(1mM)和MnCl2溶液(4mM)等体积混合后,为最佳荧光指示剂。确定钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法的最佳反应体系为:沙门氏菌特异性保守序列fimY基因的2对引物FIP和BIP 0.8uM、F3和B3 0.1uM,待测样品DNA模板2ul,MgCl2 4mM,甜菜碱Betaine 0.8M,10×Thermpol 反应缓冲液 2.5 ul,钙黄绿素MnCl2混合溶液2.5ul,dNTP 0.8mM,ddH2O 2ul,Bst DNA聚合酶320U/ml。最佳反应条件是:64℃恒温反应1小时。
实施4、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法特异性检测
选取与沙门氏菌生理生化特征相似的肠杆菌科细菌(沙雷氏菌、大肠杆菌、变形杆菌、志贺氏菌、铜绿假单胞杆菌、克雷伯氏菌)煮沸法提取基因组DNA。以肠炎沙门氏菌基因组DNA为阳性对照,以双蒸水为阴性对照,根据实施3中最佳反应体系和反应条件进行LAMP反应。
钙黄绿素荧光显色检测结果为只有肠炎沙门氏菌LAMP反应液由橘红色变为绿色荧光,表明具有阳性扩增;其它肠杆菌科细菌以及阴性对照反应前后LAMP反应液均为橘红色,无颜色变化,表明未出现阳性扩增。具体见图1,其中1—8分别为肠炎沙门氏菌阳性对照、沙雷氏菌、大肠杆菌、变形杆菌、志贺氏菌、铜绿假单胞杆菌、克雷伯氏菌、双蒸水阴性对照。
实施5、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法通用性检测
选取7种不同常见血清型沙门氏菌(肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌)煮沸法提取基因组DNA。以双蒸水为阴性对照,根据实施3中最佳反应体系和反应条件进行LAMP反应。
钙黄绿素荧光显色检测结果为7种不同血清型沙门氏菌LAMP反应液均由橘红色变为绿色荧光,表明均具有阳性扩增;阴性对照反应前后LAMP反应液为橘红色,无颜色变化,表明未出现阳性扩增。具体见图2,其中1—8分别为肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、双蒸水阴性对照。
实施6、钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法灵敏度检测
煮沸法提取肠炎沙门氏菌标准菌株基因组DNA,并进行10倍梯度稀释,分别得到浓度为442ng/ul、44.2ng/ul、4.42ng/ul、442pg/ul、44.2pg/ul、4.42pg/ul、0.442pg/ul、0.0442pg/ul的肠炎沙门氏菌基因组DNA。将不同梯度DNA浓度根据实施3中最佳反应体系和反应条件进行LAMP反应。
钙黄绿素荧光显色检测结果为442ng/ul—4.42pg/ul的肠炎沙门氏菌LAMP反应液均变为绿色荧光,0.442pg/ul、0.0442pg/ul的浓度LAMP反应液未出现颜色变化,均为橘红色。具体见图3,其中1—9浓度分别为442ng/ul、442ng/ul、44.2ng/ul、4.42ng/ul、442pg/ul、44.2pg/ul、4.42pg/ul、0.442pg/ul、0.0442pg/ul。
实施7、沙门氏菌PCR检测灵敏性检测
选取实施6中442ng/ul—0.0442pg/ul浓度的肠炎沙门氏菌基因组DNA,以双蒸水为阴性对照,进行PCR。25ul反应体系为:Taq MasterMix 12.5ul,引物F3和B3各1ul,DNA模板2ul,双蒸水2ul。反应条件为:95℃/5min;95℃/30s,56℃/30s,72℃/45s;72℃/10min,30个循环。
反应后进行琼脂糖凝胶电泳,与预期目标相符,442ng/ul—4.42pg/ul浓度的肠炎沙门氏菌在250bp附近有条带,且亮度逐渐减弱,0.442pg/ul、0.0442pg/ul浓度无条带。具体见图4,其中1—9浓度分别为442ng/ul、44.2ng/ul、4.42ng/ul、442pg/ul、44.2pg/ul、4.42pg/ul、0.442pg/ul、0.0442pg/ul,M为Tranks2K plus DNA Marker。表明,沙门氏菌LAMP钙黄绿素荧光显色检测与PCR灵敏度相当,荧光定量PCR仪检测的灵敏度略高于前两者。
核苷酸序列表
[0041]
序列表
<1>1
<2>381
<3>DNA
<4>人工序列
<5>
<6>
<7>1
tgtggggaaggttaaggagggtgataagttgtttaagccggtaaactacacgatgataaggtacgctttgctgacgtgct
atttcttttaaagaggcaccttgcgctaaagtttcaatcatcaaccagtcagtacggctaaagctttccgataagcgagg
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<8>2
<9>20
<10>DNA
<11>人工序列
<12>
<13>
<14>2
gggaaggttaaggagggtga
<15>3
<16>20
<17>DNA
<18>人工序列
<19>
<20>
<21>3
gctgggcgtttttttgttct
<22>4
<23>42
<24>DNA
<25>人工序列
<26>
<27>
<28>4
actttagcgcaaggtgcctcttagccggtaaactacacgatg
<29>5
<30>42
<31>DNA
<32>人工序列
<33>
<34>
<35>5
ttccgataagcgaggtttggcgcgacaaaatctggcctctgt
Claims (8)
1.用于沙门氏菌LAMP检测的专用引物,是根据沙门氏菌特异保守序列fimY基因(见核苷酸序列表1)设计的引物组合,用于定性检测不同血清型(肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等)沙门氏菌。
2.权利要求1中所要求的引物组合中包含2对专用引物,各引物对(FIP和BIP):(F3和B3)的摩尔比为8:1。
3.具体的2对引物序列见核苷酸序列表2~表5。
4.一种钙黄绿素荧光可视化沙门氏菌LAMP检测方法,包括以下步骤:
(1)用缓冲蛋白胨水BPW及亚酸盐胱氨酸增菌液SC按照《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》(GB 4789.4—2010)培养待检样品10~14小时;
(2)煮沸法从上述增菌液中提取细菌基因组DNA,加入到含有上述引物的LAMP反应体系中64℃恒温反应1小时,同时以肠炎沙门氏菌作阳性和双蒸水作阴性对照;
(3)反应后判断结果:反应后体系中的钙黄绿素MnCl2混合溶液由橘红色变为绿色荧光,表示存在沙门氏菌;反应前后没有颜色变化,都为橘红色,表示没有沙门氏菌存在。
5.根据权利要求4所述,本发明钙黄绿素荧光可视化LAMP检测方法的特征之一是参与反应的样品包括病死鸡组织样品、粪便、肉类等样品。
6.根据权利要求4、5所述,本发明钙黄绿素荧光可视化LAMP检测方法的特征之二是上述25ul反应体系具体包括:引物FIP和BIP 0.8uM、F3和B3 0.1uM,待测样品DNA模板2ul,MgCl2 4mM,甜菜碱Betaine0.8M,10×Thermpol反应缓冲液2.5 ul,钙黄绿素MnCl2混合溶液2.5ul,dNTP0.8mM,ddH2O 2ul,BstDNA聚合酶320U/ml。
7.根据权利要求4、5、6所述,本发明钙黄绿素荧光可视化LAMP检测方法的特征之三是优化配制钙黄绿素MnCl2混合溶液作为荧光指示剂,反应前加入体系。
8.根据权利要求7所述,钙黄绿素MnCl2混合溶液由浓度为1mM的钙黄绿素溶液与4mM的MnCl2溶液等体积混合得到,钙黄绿素溶液终浓度为50uM,MnCl2溶液终浓度为200 uM。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131127 |