CN103409366A - 成人多能祖细胞的培养基以及采用成人多能祖细胞的培养基培养成人多能祖细胞的方法 - Google Patents

成人多能祖细胞的培养基以及采用成人多能祖细胞的培养基培养成人多能祖细胞的方法 Download PDF

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本发明公开的成人多能祖细胞的培养基包括560ml低糖DMEM、400mlMCDB-201、20ml胎牛血清、20ml双抗青霉素和链霉素、10ug胰岛素-转铁蛋白-硒（1×）、0.039mg***、25.6mg2-磷酸抗坏血酸、1ug重组人表皮生长因子、1ug重组人血小板衍化生长因子BB和1ug白血病抑制因子；本发明公开的采用成人多能祖细胞的培养基培养成人多能祖细胞的方法包括采用成人多能祖细胞的培养基，500/cm2低密度贴壁培养，并用CD45、GlyA免疫微磁珠分选去除CD45、GlyA阳性杂质细胞纯化MAPC。本发明提供的成人多能祖细胞的培养基生长更好、纯度更高，本发明提供的采用成人多能祖细胞的培养基培养成人多能祖细胞的方法培养时间更短。

Description

成人多能祖细胞的培养基以及采用成人多能祖细胞的培养基培养成人多能祖细胞的方法
技术领域
本发明涉及干细胞种子细胞的研究，尤其是成人多能祖细胞的培养基以及采用成人多能祖细胞的培养基培养成人多能祖细胞的方法。
背景技术
成人多能祖细胞(multipotent adult progenitor cells，简称MAPC)是2002年美国明尼苏达州州立大学干细胞研究所的科学家们在骨髓基质干细胞中发现了一种新的干细胞亚型，它最初是从人骨髓中纯化分离出来，后陆续有科学家从身体其他部位，如脂肪、滑膜等组织也分离出MAPC，证明MAPC是一种分布广泛干细胞。MAPC具有比间充质干细胞更强的分化潜能和扩增能力，可连续扩增超过80代(最高达120代)不出现衰老，可分化成内、中、外三胚层细胞。它不表达CD34、CD44、CD45、c-Kit和MHCⅠ、Ⅱ；能够表达CD13和特殊时期抗原1(SSEA-1)，Oct-4、SSEA-1多能性基因；端粒酶活性稳定，生物性状不会随着传代次数增加而改变。但是，关于MAPC尚存在许多争议，有人认为它是基质干细胞中的一个亚型，由于其数量太少而往往被人们忽略；也有人认为它是一种类似胚胎外内皮细胞的干细胞，完全不同于基质干细胞，只不过它往往与基质干细胞出现在同一部位而被误以为同一种细胞。存在这些争议是因为目前培养MAPC技术还不成熟，培养方法繁多，缺乏一种公认的培养MAPC的标准方法，而且培养高纯度MAPC至少需3个月时间（仅用贴壁传代培养方法，不采用免疫微磁珠分选）。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种培养基组细胞生长更好、纯度更高的成人多能祖细胞的培养。本发明所要解决的技术问题还包括提供一种培养时间更短的培养成人多能祖细胞的方法。
为此，本发明提供的成人多能祖细胞的培养基，包括560ml低糖DMEM、400mlMCDB-201、20ml胎牛血清、20ml双抗青霉素和链霉素、10ug胰岛素-转铁蛋白-硒（1×）、0.039mg***、25.6mg 2-磷酸抗坏血酸、1ug重组人表皮生长因子、1ug重组人血小板衍化生长因子BB 和1ug白血病抑制因子。
本发明还提供了采用上述培养基培养成人多能祖细胞的方法，包括A、临床常规抽取骨髓5ml，采用低分子肝素钠0.5ml抗凝；B、加入10ml淋巴细胞分离液中，以2500r/min密度梯度离心，收集中间灰色单核细胞层；C、加入预先放好5ml培养基的25 cm2培养瓶中，37℃，5%CO2，孵箱中进行骨髓单核细胞培养；D、培养2 天后换液，吸管吸除原培养基及悬浮细胞，然后PBS洗涤，加入新培养基5ml，继续37℃，5%CO2，孵箱中培养；E、以后每2～3天换液1次，直至30日内倒置显微镜下观察细胞长至70%融合时，进行传代培养；F、待细胞数量增至107时，进行CD45、GlyA免疫微磁珠分选去除CD45、GlyA阳性杂质细胞纯化MAPC。
在本发明中，采用专利技术的培养基组细胞明显生长好，纯度高。而且本发明提供的培养方法中通过CD45、GlyA免疫微磁珠分选去除CD45、GlyA阳性杂质细胞纯化MAPC，大大地提高了MAPC纯化效率。在一个月内就可以分离出高纯度的MAPC，这样明显缩短了MAPC的培养时间，为干细胞种子细胞的研究带来了便利。
说明书附图
图1为倒置显微镜下观察第2代CD45、GlyA阴性MAPC (×200)；
图2为流式细胞检测MAPC表达Oct-4、SSEA-1基因图表；
图3为荧光显微镜下检测MAPC细胞表面标志物Oct-4；
图4为荧光显微镜下检测MAPC细胞表面标志物SSEA-1；
图5为磁珠分选前倒置显微镜下普通培养基（15%胎牛血清）培养的MAPC第二代细胞 (200×)；
图6为磁珠分选前倒置显微镜下本发明提供的培养基培养的MAPC第二代细胞 (200×)。
具体实施方式
本发明提供的成人多能祖细胞的培养基，包括560ml低糖DMEM〔一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500mg/L）和低糖型(低于1000mg/L)〕、400mlMCDB-201、20ml胎牛血清、20ml双抗青霉素和链霉素、10ug胰岛素-转铁蛋白-硒（1×）、0.039mg***、25.6mg 2-磷酸抗坏血酸、1ug重组人表皮生长因子、1ug重组人血小板衍化生长因子BB 和1ug白血病抑制因子。采用本发明专利技术的培养基组细胞明显生长好，纯度高。
如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示，本发明提供的培养成人多能祖细胞的方法，包括采用权利要求1所述的成人多能祖细胞的培养基，500/cm2低密度贴壁培养，并用CD45、GlyA免疫微磁珠分选去除CD45（细胞表面抗原45）、GlyA（糖蛋白A）阳性杂质细胞纯化MAPC。这种方法大大地提高了MAPC纯化效率，在一个月内就可以分离出高纯度的MAPC，这样明显缩短了MAPC的培养时间，为干细胞种子细胞的研究带来了便利。
培养成人多能祖细胞的方法具体案例：包括A、临床常规抽取骨髓5ml，采用低分子肝素钠0.5ml抗凝；B、加入10ml淋巴细胞分离液中，以2500r/min密度梯度离心，收集中间灰色单核细胞层；C、加入预先放好5ml培养基的25 cm2培养瓶中，37℃，5%CO2，孵箱中进行骨髓单核细胞培养；D、培养2 天后换液，吸管吸除原培养基及悬浮细胞，然后PBS（磷酸缓冲溶液）洗涤，加入新培养基5ml，继续37℃，5%CO2，孵箱中培养；E、以后每2～3天换液1次，直至30日内倒置显微镜下观察细胞长至70%融合时，进行传代培养；F、待细胞数量增至107时，进行CD45、GlyA免疫微磁珠分选去除CD45、GlyA阳性杂质细胞纯化MAPC。
细胞生物性状检测：
应用FACScan（流式细胞仪）分析第二代细胞表面抗原，主要指标包括OCT4（人体基因中的一种编排名称）、SSEA-1（人体基因中的一种编排名称）、CD13（细胞表面抗原13）、CD44（细胞表面抗原44）、CD45、MHCⅡ。MAPC只表达OCT4、SSEA-1、CD13，而其它抗原均不表达，为阴性（如图2所示）。
免疫荧光检测MAPC细胞表面标志物，将第3代MAPC接种至24孔培养板中，每孔加入2×105/ml MAPC单细胞悬液1ml，37℃，5%CO2, 饱和湿度培养过夜，进行免疫荧光染色。
（1） PBS迅速洗2-3次；
（2） 4%多聚甲醛中固定，室温10min；
（3） DPBS（杜氏磷酸缓冲液，全称为：Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）洗3min×3次；
（4） 山羊血清封闭30分钟（37oC），不洗，甩去；
（5） DPBS洗3min×3次；
（6） 一抗CD13（1：100）、SSEA-1（1：200）、CD44（1：200）、CD45（1：200）、CD14(1：100)、HLA-1（1：200）、Oct4(1：200)分别加入3孔，每孔一抗各50μl，阴性对照用50μl抗体稀释液代替一抗，湿盒内4℃过夜；
（7） DPBS洗3min×3次；每孔加二抗：FITC标记山羊抗小鼠IgG，〔1:100 含1%BSA（牛血清白蛋白）的PBS稀释〕50μl或Cy3标记山羊抗兔IgG，（1:200 含1%BSA的PBS稀释），湿盒内37℃ 50min；
（8） 超纯水洗3min×3次；
（9） DAKO® Fluorescent Mounting Medium封片，4℃避光存放，一个月内荧光显微镜观察。
培养细胞免疫荧光染色结果显示： CD13+、SSEA-1+、Oct4+、CD44-、CD45-、CD14-、HLA-1(人体白细胞抗原-1)-（如图3所示）。 我们在实验中用自制MAPC培养基与普通培养基（15%胎牛血清）比较，培养结果示：自制培养基组细胞明显生长好，纯度高，如图4所示。大量实验中总结出最适合MAPC生长的自制培养基，最适培养条件，提供了一种标准、有效的MAPC培养方法，通过CD45、GlyA免疫微磁珠分选去除CD45、GlyA阳性杂质细胞纯化MAPC，大大地提高了MAPC纯化效率。在一个月内就可以分离出高纯度的MAPC；传统方法，仅用贴壁传代培养方法，不采用免疫微磁珠分选，至少需3月才能培养出高纯度的MAPC。这样明显缩短了MAPC的培养时间，为干细胞种子细胞的研究带来了便利。

Claims (3)

1.一种成人多能祖细胞的培养基，其特征是：包括560ml低糖DMEM、400mlMCDB-201、20ml胎牛血清、20ml双抗青霉素和链霉素、10ug胰岛素-转铁蛋白-硒（1×）、0.039mg***、25.6mg 2-磷酸抗坏血酸、1ug重组人表皮生长因子、1ug重组人血小板衍化生长因子BB 和1ug白血病抑制因子。
2.一种采用权利要求1所述成人多能祖细胞的培养基培养成人多能祖细胞的方法，其特征是：包括采用权利要求1所述的成人多能祖细胞的培养基，500/cm2低密度贴壁培养，并用CD45、GlyA免疫微磁珠分选去除CD45、GlyA阳性杂质细胞纯化MAPC。
3.根据权利要求2所述的培养成人多能祖细胞的方法，其特征是：具体步骤包括A、临床常规抽取骨髓5ml，采用低分子肝素钠0.5ml抗凝；B、加入10ml淋巴细胞分离液中，以2500r/min密度梯度离心，收集中间灰色单核细胞层；C、加入预先放好5ml培养基的25 cm2培养瓶中，37℃，5%CO2，孵箱中进行骨髓单核细胞培养；D、培养2 天后换液，吸管吸除原培养基及悬浮细胞，然后PBS洗涤，加入新培养基5ml，继续37℃，5%CO2，孵箱中培养；E、以后每2～3天换液1次，直至30日内倒置显微镜下观察细胞长至70%融合时，进行传代培养；F、待细胞数量增至107时，进行CD45、GlyA免疫微磁珠分选去除CD45、GlyA阳性杂质细胞纯化MAPC。
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