CN103408650B - 中华仙影海葵溶细胞多肽cct-i及其分离纯化方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I及其分离纯化方法和应用。本发明将中华仙影海葵触手粗毒经硫酸铵盐析分段沉淀后，将活性部位依次经过Sephadex G-100和superdex75两种凝胶过滤色谱柱分离纯化，最终首次从中华仙影海葵触手中分离得到一类溶细胞多肽，并通过SDS-PAGE电泳及LC-MS鉴定为一类未见报道的新型海葵溶细胞多肽，其中包含有的两个多肽（α＆β），分子量相近，均为80kDa左右，经HPLC检测，纯度较高，且两个多肽极性相近。并且测定了其半数溶细胞率约为5.75μg·mL-1，经过MTT法检测显示，CCT-I具有强烈的体外抗肿瘤活性，可用于制备***药物。
Description
技术领域
本发明属于中药中天然药物技术领域，涉及中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I及其分离纯化方法和应用。
背景技术
统计资料表明，我国从上世纪80年代起，恶性肿瘤的发病率呈明显上升趋势，常见肿瘤的发病率以5-10%的速度增长，每年恶性肿瘤发病人数为160万，每年死于恶性肿瘤的患者为130万人，目前肿瘤病人的数目在540万。大中城市中肺癌、乳腺癌发病率最高；农村地区则以胃癌、食管癌发病率最高。可见，我国抗肿瘤药的市场潜力巨大。治疗恶性肿瘤的相关研究工作正在不断取得进展，WHO公布的常用抗肿瘤药物为49种。由于抗肿瘤药物的研发周期长，国内大部分企业产品目前仅是仿制国外上市品种，有自主知识产权的国产抗肿瘤药物亟待开发。
海葵（sea anemone）又名海菊花,属腔肠动物门（Coelenterata）珊瑚虫纲（Anthozoa）海葵目（actiniaria）动物。广泛分布在热带和温热带海域，主要固着在海中岩石上或泥沙中，我国海域分布的海葵有黄侧花海葵（Anthopleura xanthogrammica）、太平洋侧花海葵（A.pacifica）、纵条矶海葵（Haliplanella luciae Hand）、中华仙影海葵（Cereus sinensis Verrill）等。海葵具有滋阴壮阳、收敛止泻、燥湿杀虫等功效，民间主要用来治疗痔疮、脱肛、饶虫病和体癣等。现代研究表明从海葵中分离得到的溶细胞毒素多具有较强的抗肿瘤活性，比如StI、EqtII、EqtIIA179C、EqtIIK20C和EqtIIR126C等对不同的肿瘤细胞都具有较强的抑制作用。我国沿海海葵资源丰富，特别是随着江苏省海洋水产研究所对中华仙影海葵进行人工繁育并养殖成功，这使得利用海葵资源进行产业化综合开发成为可能，中华仙影海葵（Cereus sinensis Verrill）隶属于绿海葵科仙影海葵属，是我国沿海广泛分布的一种可食用有毒海葵，其溶细胞毒素的分离纯化、组成及性质研究尚未见报道。
海葵毒素的分离纯化难度较大，其主要原因有以下几个方面：第一，海葵粗毒中含有许多种蛋白成分，其中一些蛋白间的性质（如：分子量、等电点、疏水性等）很接近；第二，海葵毒素多为蛋白类物质，容易受到外界环境因素变化的影响而致使其活性降低甚至丧失；第三，不同种海葵，由于其生长环境等的不同，导致其生理结构及体内所含有毒素成分和性质也存在较大差异，这也使得不同种海葵毒素的分离纯化工作很难直接效仿，而只能通过繁琐的实验摸索才可能获得。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I的分离纯化方法。
本发明的另一目的是提供该方法分离纯化获得的中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I。
本发明的又一目的是提供中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I的应用。
中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I的分离方法，主要包括以下步骤：
1）将中华仙影海葵触手粗毒液经硫酸铵分段盐析沉淀后，得到0-40%、40%-60%和60-90%三个硫酸铵饱和度段，然后用pH=7.0含0.15mol·L-1氯化钠的10mmol·L-1PBS缓冲液复溶，待用；
2）将上述60-90%硫酸铵饱和度段沉淀复溶液经含Sephadex G-100凝胶色谱柱，采用洗脱液以0.5mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，收集的洗脱液在4℃条件下用3kDa的超滤管进行浓缩，收集峰1浓缩液待用；所述洗脱液为pH=7.0含0.15mol·L-1氯化钠的10mmol·L-1磷酸缓冲液；
3）取上述步骤2）中峰1浓缩液经凝胶色谱柱superdex75采用洗脱液以流速0.3mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，收集的洗脱液在4℃条件下用3kDa的超滤管进行浓缩，收集活性峰1浓缩液，并用3.5kDa透析袋过夜透析，透析袋外液为纯水，冷冻干燥后，得所述的溶细胞多肽CCT-I；所述洗脱液为pH=7.0含0.15mol·L-1氯化钠的10mmol·L-1PBS缓冲液。
其中，所述的中华仙影海葵触手粗毒液通过以下方法制备：将剪下的中华仙影海葵触手-80℃进行2～3次冻融，20℃～28℃下适当解冻后，用剪刀剪碎，并用玻璃匀浆器充分匀浆后，加入超纯水，封口膜封好后置于4℃冰箱中，放置1.5～2h，期间每15min搅拌一次，然后在4℃，10000～12000r/min条件下离心1～1.5h，取出上清液，再在同样条件下离心0.8～1h，收集上清液得中华仙影海葵触手粗毒液。
中华仙影海葵触手粗毒液制备过程中所述的中华仙影海葵触手与超纯水的料液比优选1:4～6，进一步优选1:5。
所述的中华仙影海葵触手粗毒液经硫酸铵分段盐析沉淀的方法为：准确量取100mL海葵粗毒，参照硫酸铵0℃饱和度表，称取研磨至细碎的硫酸铵，缓缓加入到100mL海葵粗毒液中，然后于4℃冰箱静置过夜。在4℃下，10000～12000r·min-1离心35～45min，取出上清，沉淀用pH=7.0含0.15mol·L-1氯化钠的10mmol·L-1PBS缓冲液复溶，按照上述方法将海葵盐析为0～40%、40%～60%和60%～90%三个硫酸铵饱和度段。
所述的分离方法制备的中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I。
所述的溶细胞多肽CCT-I主要由分子量均在80kDa的两个多肽组成。
所述的中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I在制备抗癌药物中的应用，优选在制备抗***、抗肺癌或抗肝癌的药物中的应用。
有益效果：
本发明将中华仙影海葵触手粗毒经硫酸铵盐析分段沉淀后，将活性部位依次经过SephadexG-100和superdex75两种凝胶过滤色谱柱分离纯化，最终首次从中华仙影海葵触手中分离得到一类溶细胞多肽，并通过SDS-PAGE电泳及LC-MS鉴定为一类未见报道的新型海葵溶细胞多肽，命名为CCT-I。其中包含有的两个多肽（α＆β），分子量相近，均为80kDa左右，经HPLC检测，纯度较高，且两个多肽极性相近。并且测定了其半数溶细胞率约为5.75μg·mL-1，经过MTT法检测显示，CCT-I具有强烈的体外抗肿瘤活性，可用于制备***药物。
附图说明
图1本发明中华仙影海葵粗毒60%-90%硫酸铵盐析段复溶液的Sephadex G-100凝胶过滤柱层析图，峰1为活性峰。
图2Sephadex G-100凝胶色谱中的峰1再次过Sephadex G-100凝胶过滤柱层析图。
图3Sephadex G-100凝胶色谱中的峰1浓缩液的superdex75凝胶过滤柱层析图，峰1为活性峰。
图4本发明中SDS-PAGE电泳图，其中M为标准分质量Marker；1为Sephadex G-100凝胶色谱中的峰1；2为CCT-I。
图5为本发明中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I经HPLC检测纯度的洗脱曲线图。
图6中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I的溶细胞活性图。
图7A图为本发明中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I-α经胰蛋白酶解后的HPLC洗脱图；B图为本发明中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I-α的质谱图；C图为本发明中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I-β经胰蛋白酶解后的HPLC洗脱图；D图为本发明中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I-β的质谱图。
图8中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I抑制肿瘤细胞Hela生长的显微观察图。
其中，a图为对照，b图中CCT-I浓度为3.125μg·mL-1，c图中CCT-I浓度为6.25μg·mL-1，d图中CCT-I浓度为12.5μg·mL-1，e图中CCT-I浓度为25μg·mL-1，f图中CCT-I浓度为50μg·mL-1。
图9中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I抑制肿瘤细胞A549生长的显微观察图。
其中，a图为对照，b图中CCT-I浓度为3.125μg·mL-1，c图中CCT-I浓度为6.25μg·mL-1，d图中CCT-I浓度为12.5μg·mL-1，e图中CCT-I浓度为25μg·mL-1，f图中CCT-I浓度为50μg·mL-1。
图10中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I抑制肿瘤细胞HepG2生长的显微观察图。
其中，a图为对照，b图中CCT-I浓度为3.125μg·mL-1，c图中CCT-I浓度为6.25μg·mL-1，d图中CCT-I浓度为12.5μg·mL-1，e图中CCT-I浓度为25μg·mL-1，f图中CCT-I浓度为50μg·mL-1。
具体实施方式：
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1中华仙影海葵溶细胞多肽的分离
第一步，海葵粗毒制备。将活体的中华仙影海葵触手剪下，迅速冷冻在-80℃冰箱中，制备前，取出冻融2次的海葵触手，室温下适当解冻后，准确称取20g，用剪刀剪碎，并用玻璃匀浆器充分匀浆后，按料液比1:5加入一定量的超纯水，封口膜封好后置于4℃冰箱中，放置2h，期间每15min搅拌一次，注意轻轻搅拌以免产生大量泡沫。然后在4℃，10000r/min条件下离心1h，取出上清液，再在同样条件下离心1h，所得上清液即为海葵粗毒液。用Bradford法检测蛋白浓度，并用SD大鼠血液反应***检测粗毒溶细胞活性。
第二步，硫酸铵盐析处理。准确量取上述粗毒液100mL，参照硫酸铵0℃饱和度表，称取一定量研磨至细碎的硫酸铵，缓缓加入到100mL海葵粗毒液中（整个实验过程均在冰水浴环境和磁力搅拌器上进行），然后于4℃冰箱静置过夜。在4℃下，10000r·min-1离心40min，取出上清，沉淀用一定量10mmol·L-1磷酸盐缓冲液（PBS pH=7.0含0.15mol·L-1氯化钠）复溶。参照上述方法，将海葵盐析为0～40%（I）、40%～60%（II）和60%～90%（III）3段。用Bradford法检测各盐析段蛋白浓度，并用SD大鼠血液反应***检测各盐析段复溶液的溶细胞活性。
第三步，Sephadex G-100凝胶过滤柱层析。按上述方法获得溶细胞活性较强的第60%～90%（III)盐析段PBS复溶液。Sephadex G-100凝胶过滤柱（3.7cm×100cm）用10mmol·L-1磷酸盐缓冲液（PBS pH=7.0含0.15mol·L-1氯化钠）平衡，充分后将样品上样于该柱。用同样缓冲液洗脱，在280nm检测吸光度，收集各个峰的峰值管（图1），3kDa超滤管浓缩后，用SD大鼠血液反应***检测各峰的溶细胞活性，结果显示活性峰1的溶细胞活性最强，收集活性峰1（图2），待用。
第四步，Superdex75凝胶过滤层析柱。Superdex75凝胶过滤柱（1.6cm×100cm）用同样10mmol·L-1磷酸盐缓冲液（PBS pH=7.0含0.15mol·L-1氯化钠）平衡，充分后将SephadexG-100凝胶过滤得到的活性成分的峰1浓缩液上样于该柱。用同样缓冲液洗脱，在280nm检测吸光度，收集各个峰的峰值管（图3），3kDa超滤管浓缩后，用SD大鼠血液反应***检测各峰的溶细胞活性，结果显示活性峰1的溶细胞活性最强，收集活性峰1，并用3.5kDa透析袋过夜透析，透析袋外液为纯水，冷冻干燥后，CCT-I粉末-20℃保存，待用。
实施例2溶血活性检测的检测
第一步，血样制备。取健康成年的SD大鼠，心脏取血，血液存于抗凝管中，4℃保存备用。
第二步，SD大鼠2%红细胞混悬液制备。从抗凝管中取出一定量SD大鼠血液，用10mmol·L-1磷酸盐缓冲液（PBS pH=7.0含0.15mol·L-1氯化钠）洗涤，4℃条件下1500r·min-1离心5min，弃去上清，重复4～5次，直至上清清澈透明无红色为止，红细胞用PBS稀释成2%红细胞混悬液，4℃保存备用。
第三步，溶血活性检测。取200μL不同浓度的CCT-I溶液加入到200μL2%红细胞混悬液中，然后用PBS定容至1mL，37℃，孵育30min，4℃条件下1500r·min-1离心5min，在540nm测定上清的A540值，每个浓度平行作3组，阴性对照为加200μL PBS,阳性对照为加200μL0.5%Triton X-100。计算各样品溶细胞率：
溶细胞率=（样品A540－阴性对照A540）/（阳性对照A540－阴性对照A540）×100%
结果显示CCT-I的半数溶细胞率约为5.5μg·mL-1（图6）。
各峰值管洗脱液的溶血活性也是按上述方法测定。
实施例3中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I的鉴定
第一步，SDS-PAGE电泳检验CCT-I纯度、估测分子量。样品和5×上样缓冲液混合（v:v=4:1）并于95℃煮沸5min，然后用5%浓缩胶和12%分离胶进行分离，最后采用考马斯亮蓝R-250固定染色，通过与标准蛋白进行对比来确定分子量。标准蛋白Marker含的标准蛋白有：磷酸酶b97.2kDa、牛血清蛋白66.4kDa、卵清蛋白44.3kDa、碳酸酐酶29.0kDa、胰蛋白酶抑制剂20.1kDa和溶菌酶14.3kDa。结果显示CCT-I中主要包含两条蛋白带，纯度高，而且分子量均在80kDa左右（图4）。
第二步，HPLC检验CCT-I纯度。将CCT-I溶于10%乙腈（乙腈:0.1%TFA=1:9）中，经过孔径为0.22μm微孔滤膜过滤后，用HPLC（Thermo Ultimate3000）检验纯度，色谱柱为C18柱（4.6×25mm），洗脱条件为线性洗脱，具体为0-60min内，乙腈由10%-52%(乙腈:0.1%TFA=1:9-13:12)，检测波长为280nm。结果显示CCT-I中主要含有两个多肽，极性相近，且纯度高（图5）。
第三步，LC-MS结合搜索NBCI库的方法鉴定CCT-I中的α和β两个多肽。
1）HPLC条件，
流动相：A液 H2O（质谱级），0.1%TFA
B液 乙腈（质谱级），0.1%TFA
流速：200uL/min（分流后2uL/min）
梯度：120min(5%B to35%B in40min,to95%in20min，平衡20min)
进样量：20uL
柱子型号：CTICAP5150100
2）MS条件，
型号：LTQ XL Thermo
离子源：NSI; 毛细管电压：3.5KV；
离子源温度：260℃； 脱溶剂气温度：260℃；
脱溶剂气流量：20unit/min 检测器电压：200V
3）检索NBCI参数，
检索软件：Proteomics Discovery1.2(Thermo)
检索算法：Sequest
数据库:客户提供蛋白质可能来源，Actiniaria（NCBI）
峰误差 1Da
数据筛选：Xcorr>1.9 if Charge=1
Xcorr>2.2 if Charge=2
Xcorr>3.75 if Charge=3
4）样品制备。用手术刀将上述第一步中SDS-PAGE电泳胶的两个蛋白条带切下后，再将胶条切成1mm3小块儿，置于1.5ml Eppendorf管中；用200ul双蒸水洗2次，每次10min；加考染脱色液（50mM NH4HCO3/CH3CN）200ul，超声脱色15min，吸干，重复3次，直至脱色完全；加CH3CN100ul脱水至胶粒变白，真空抽干10min；加200ul10mM DTT/25mMNH4HCO3，37℃水浴1h；冷至室温，吸干，快速加200ul50mM IAA/25mM NH4HCO3，置于暗室45min；依次用下列溶液进行超声清洗:25mM NH4HCO3（2次）、25mMNH4HCO3+50%CH3CN（2次）及CH3CN(1次),每次10min。CH3CN脱水至胶粒变白，真空抽干10min；将0.1μg/μL胰蛋白酶液用25mM NH4HCO3稀释10-20倍，每管加2-3μL，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30min。待酶液被胶粒完全吸收，加25mMNH4HCO3至总体积300μL，37℃过夜；离心收集收集酶解上清液，置于另一1.5ml Eppendorf管中；剩余胶粒用抽提缓冲液（67%CH3CN、5%TFA、28%ddH2O）超声15min，重复3次，将酶解液混合，真空超干；加5%B液复溶，依次用上述1）、2）和3）中条件进行检测。结果显示没有检索到与CCT-I中两条带完全匹配的蛋白，这说明CCT-I中两个蛋白（α＆β）均为新发现的蛋白（图7）。
通过上述方法制备的中华仙影海葵溶细胞多肽是从腔肠类动物中华仙影海葵触手中分离得到的一类未见报道的新型海葵溶细胞多肽，分子量在80kDa左右，且具有较高纯度。
实施例4中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I抑制肿瘤细胞生长作用
取对数生长期的Hela、A549和HepG2肿瘤细胞，用对应的培养基将肿瘤细胞稀释至密度为2×104/mL，然后接种于96孔板中，每孔100μL，于37℃，5%CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24h后，每孔加入20μL用对应培养基稀释的CCT-I样品，浓度分别为3.125,6.25,12.5,25和50μg·mL-1，每个实验组设置5个复孔，阴性对照为加20μL相应培养基。继续培养48h后为中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I抑制肿瘤细胞生长的显微观察图见图8～图10，用MTT法测定样品对两株肿瘤细胞的抑制作用。EC50是对50%肿瘤细胞产生抑制作用时的药物浓度。
表1中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I抗肿瘤细胞生长作用
从表1中可见，中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I能够有效抑制人***细胞系（Hela）、肺癌细胞系（A549）和肝癌细胞系（HepG2）的生长，这表明中华仙影海葵溶细胞毒素CCT-I具有很强的抗肿瘤细胞生长的作用。
Claims (7)
1.中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I的分离方法，其特征在于主要包括以下步骤：
1）将中华仙影海葵触手粗毒液经4℃硫酸铵分段盐析沉淀后，得到0-40%、40%-60%和60-90%三个硫酸铵饱和度段，然后用pH = 7.0含0.15 mol·L-1氯化钠的10 mmol·L-1PBS缓冲液复溶，待用；所述的中华仙影海葵触手粗毒液通过以下方法制备：将剪下的中华仙影海葵触手-80 ℃进行2~3次冻融，20℃~28℃下适当解冻后，用剪刀剪碎，并用玻璃匀浆器充分匀浆后，加入超纯水，封口膜封好后置于4℃冰箱中，放置1.5~2 h，期间每15 min搅拌一次，然后在4 ℃，10000~12000 r/min条件下离心1~1.5 h，取出上清液，再在同样条件下离心0.8~1 h，收集上清液得中华仙影海葵触手粗毒液；
2）将上述60-90%硫酸铵饱和度段沉淀复溶液经含Sephadex G-100凝胶色谱柱3.7 cm×100 cm，采用洗脱液以0.5 mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280 nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，收集的洗脱液在4 ℃条件下用3 kDa的超滤管进行浓缩，在280 nm检测吸光度，收集第一个峰的浓缩液待用；所述洗脱液为pH = 7.0 含0.15 mol·L-1氯化钠的10 mmol·L-1磷酸缓冲液；
3）取上述步骤2）中第一个峰的浓缩液经凝胶色谱柱superdex 75采用洗脱液以0.3 mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280 nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，收集的洗脱液在4 ℃条件下用3 kDa的超滤管进行浓缩，收集第一个峰的浓缩液，并用3.5 kDa透析袋过夜透析，透析袋外液为纯水，冷冻干燥后，得所述的溶细胞多肽CCT-I；所述洗脱液为pH = 7.0 含0.15 mol·L-1氯化钠的10 mmol·L-1PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I的分离方法，其特征在于中华仙影海葵触手粗毒液制备过程中所述的中华仙影海葵触手与超纯水的料液比为1:4~6。
3.根据权利要求1所述的中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I的分离方法，其特征在于：所述的中华仙影海葵触手粗毒液经硫酸铵分段盐析沉淀的方法为：准确量取100 mL海葵粗毒，参照硫酸铵0℃饱和度表，称取研磨至细碎的硫酸铵，缓缓加入到100 mL海葵粗毒液中，然后于4 ℃冰箱静置过夜；在4 ℃下，10000~12000 r·min-1离心35~45 min，取出上清，沉淀用pH = 7.0 含0.15 mol·L-1氯化钠的10 mmol·L-1PBS缓冲液复溶，按照上述方法将海葵盐析为0~40%、40%~60%和60%~90% 三个硫酸铵饱和度段。
4.按照权利要求1~3中任一项所述的分离方法制备的中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I。
5.根据权利要求4所述的溶细胞多肽CCT-I，其特征在于所述的溶细胞多肽CCT-I主要由分子量均在80 kDa的两个多肽组成。
6.权利要求4所述的中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I在制备抗癌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的中华仙影海葵溶细胞多肽CCT-I在制备抗***或抗肺癌的药物中的应用。
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